微生物工程工藝原理

1、1、 根據(jù)微生物對(duì)溫度的依賴可分為幾類(lèi)？答：嗜冷菌：0260C生長(zhǎng)，嗜溫菌：15430C生長(zhǎng)，嗜熱菌：37650C生長(zhǎng)，嗜高溫菌：650C生長(zhǎng) 。2、 微生物對(duì)溫度要求不同的原理是什么？答：（1）微生物對(duì)溫度的要求不同與它們的膜結(jié)構(gòu)物理化學(xué)性質(zhì)有密切關(guān)系根據(jù)細(xì)胞膜的液體鑲嵌模型，細(xì)胞在正常生理?xiàng)l件下，膜中的脂質(zhì)成分應(yīng)保持液晶狀態(tài)，只有當(dāng)細(xì)胞膜處于液晶狀態(tài)，才能維持細(xì)胞的正常生理功能，使細(xì)胞處于最佳生長(zhǎng)狀態(tài)，微生物的生長(zhǎng)溫度與細(xì)胞膜的液晶溫度范圍相一致。根據(jù)細(xì)胞膜脂質(zhì)成分分析表明，不同最適溫度生長(zhǎng)的微生物，其膜內(nèi)磷脂組成有很大區(qū)別。嗜熱菌只含飽和脂肪酸，而嗜冷菌含有較高的不飽和脂肪酸。（2）蛋白

2、質(zhì)結(jié)構(gòu)：通過(guò)對(duì)嗜冷酶的蛋白質(zhì)模型和x一射線衍射分析表明，嗜冷酶分子間的作用力減弱，與溶劑的作用加強(qiáng)，酶結(jié)構(gòu)的柔韌性增加，使酶在低溫下容易被底物誘導(dǎo)產(chǎn)生催化作用（3）蛋白質(zhì)合成：嗜冷菌具有在0合成蛋白質(zhì)的能力。這是由于其核糖體、酶類(lèi)以及細(xì)胞中的可溶性因子等對(duì)低溫的適應(yīng)，蛋白質(zhì)翻譯的錯(cuò)誤率最低。許多中溫菌不能在O0C合成蛋白質(zhì)，一方面是由于其核糖體對(duì)低溫的不適應(yīng)，翻譯過(guò)程中不能形成有效的起始復(fù)合物，另一方面是由于低溫下細(xì)胞膜的破壞導(dǎo)致氨基酸等內(nèi)容物的泄露。（4）合成冷休克蛋白：低溫微生物適應(yīng)低溫的另一機(jī)制是合成冷休克蛋白將大腸桿菌從370C突然轉(zhuǎn)移到100C條件時(shí)細(xì)胞中會(huì)誘導(dǎo)合成一組冷休克蛋白，它

3、們對(duì)低溫的生理適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，檢測(cè)嗜冷酵母的冷休克反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)冷刺激后冷休克蛋白在很短時(shí)間內(nèi)大量產(chǎn)生。耐冷菌由于生活在溫度波動(dòng)的環(huán)境中，它們必須忍受溫度的快速降低，這與它們產(chǎn)生的冷休克蛋白是密切相關(guān)的。3、 發(fā)酵過(guò)程的溫度會(huì)不會(huì)變化？為什么？答：會(huì)變化，發(fā)酵熱引起發(fā)酵液的溫度變化的原因，發(fā)酵熱就是發(fā)酵過(guò)程中釋放出來(lái)的凈熱量，什么叫凈熱量呢？在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生菌分解基質(zhì)產(chǎn)生熱量、機(jī)械攪拌產(chǎn)生熱量、通氣熱，而罐壁散熱、水分蒸發(fā)、空氣排氣帶走熱量。這各種產(chǎn)生的熱量和各種散失的熱量的代數(shù)和就叫做凈熱量，發(fā)酵熱引起發(fā)酵液的溫度上升。發(fā)酵熱大，溫度上升快；發(fā)酵熱小，溫度上升慢。4、 發(fā)酵熱的定義答：

4、發(fā)酵過(guò)程中，由于菌體對(duì)培養(yǎng)基的利用而發(fā)生的反應(yīng)及攪拌時(shí)產(chǎn)生的摩擦等等，都會(huì)產(chǎn)生一定的熱量、水分的蒸發(fā)等也帶走了一部分熱量，發(fā)酵過(guò)程中釋放出來(lái)的凈熱量稱為發(fā)酵熱。5、生物熱的大小與哪些因素有關(guān)？答：發(fā)酵類(lèi)型、培養(yǎng)時(shí)間、菌數(shù)、呼吸作用強(qiáng)度。6、 溫度對(duì)發(fā)酵有哪些影響？答：（1)溫度可直接影響發(fā)酵過(guò)程中的各種反應(yīng)速率；（2）通過(guò)改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，間接影響產(chǎn)物的形成：（3）溫度還會(huì)影響生物合成的方向；（4）溫度對(duì)代謝有調(diào)節(jié)作用。7、 發(fā)酵過(guò)程溫度的選擇有什么依據(jù)？答：（1）根據(jù)菌種及生長(zhǎng)階段選擇 微生物種類(lèi)不同，所具有的酶系及其性質(zhì)不同，所要求的溫度范圍也不同。如黑曲霉生長(zhǎng)溫度為370C，谷氨酸產(chǎn)

5、生菌棒狀桿菌的生長(zhǎng)溫度為30320C，青霉菌生長(zhǎng)溫度為300C在發(fā)酵前期由于菌量少，發(fā)酵目的是要盡快達(dá)到大量的菌體，取稍高的溫度，促使菌的呼吸與代謝，使菌生長(zhǎng)迅速；在中期菌量已達(dá)到合成產(chǎn)物的最適量，發(fā)酵需要延長(zhǎng)中期，從而提高產(chǎn)量，因此中期溫度要稍低一些，可以推遲衰老。因?yàn)樵谏缘蜏囟认掳被岷铣傻鞍踪|(zhì)和核酸的正常途徑關(guān)閉得比較嚴(yán)密有利于產(chǎn)物合成。發(fā)酵后期，產(chǎn)物合成能力降低，延長(zhǎng)發(fā)酵周期沒(méi)有必要，就又提高溫度，刺激產(chǎn)物合成到放罐。（2） 根據(jù)培養(yǎng)條件選擇 溫度選擇還要根據(jù)培養(yǎng)條件綜合考慮，靈活選擇。通氣條件差時(shí)可適當(dāng)降低溫度，使菌呼吸速率降低些，溶氧濃度也可髙些。培養(yǎng)基稀薄時(shí)，溫度也該低些。因根據(jù)

6、菌生長(zhǎng)情況（3） 菌生長(zhǎng)快，維持在較高溫度時(shí)間要短些；菌生長(zhǎng)慢，維持較高溫度時(shí)間可長(zhǎng)些。培養(yǎng)條件適宜，如營(yíng)養(yǎng)豐富，通氣能滿足，那么前期溫度可髙些，以利于菌的生長(zhǎng)?？偟膩?lái)說(shuō)，溫度的選擇根據(jù)菌種生長(zhǎng)階段及培養(yǎng)條件綜合考慮。8、 發(fā)酵過(guò)程中PH會(huì)不會(huì)發(fā)生變化，為什么？答：發(fā)酵過(guò)程中pH是不斷變化的1）糖代謝:特別是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是補(bǔ)料的標(biāo)志之一； 2）氮代謝:當(dāng)氨基酸中的-NH2被利用后pH會(huì)下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，當(dāng)碳源不足時(shí)氮源當(dāng)碳源利用pH上升； 3）生理酸堿性物質(zhì)利用后pH會(huì)上升或下降； 4）某些產(chǎn)物本身呈酸

7、性或堿性，使發(fā)酵液pH變化。如有機(jī)酸類(lèi)產(chǎn)生使pH下降，紅霉素、潔霉素、螺旋霉素等抗生素呈堿性，使pH上升； 5）菌體自溶 pH上升，發(fā)酵后期，pH上升； 6）雜菌的污染，pH下降9、pH對(duì)發(fā)酵的影響表現(xiàn)在哪些方面？答：（1）pH影響酶的活性。當(dāng)pH值抑制菌體某些酶的活性時(shí)使菌的新陳代謝受阻。（2）pH影響微生物細(xì)胞膜所帶電荷。從而改變細(xì)胞膜的透性，影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝物的排泄，因此影響新陳代謝的進(jìn)行。（3）pH值影響培養(yǎng)基某些成分和中間代謝物的解離，從而影響微生物對(duì)這些物質(zhì)的利用。（4）pH值影響代謝方向。pH不同，往往引起菌體代謝過(guò)程不同，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變。例如黑曲

8、霉在pH23時(shí)發(fā)酵產(chǎn)生檸檬酸，在pH近中性時(shí)，則產(chǎn)生草酸。谷氨酸發(fā)酵，在中性和微堿性條件下積累谷氨酸，在酸性條件下則容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。（5）pH在微生物培養(yǎng)的不同階段有不同的影響。10、為了確定發(fā)酵的最佳pH，我們?cè)撊绾螌?shí)驗(yàn)？答：配制不同初始pH的培養(yǎng)基，搖瓶考察發(fā)酵情況 11、 發(fā)酵過(guò)程的pH控制可以采取哪些措施？答：（1）、調(diào)節(jié)好基礎(chǔ)料的初始pH （2）、在基礎(chǔ)料中加入維持pH的物質(zhì) （3）、通過(guò)補(bǔ)料調(diào)節(jié)pH （4）、當(dāng)補(bǔ)料與調(diào)pH發(fā)生矛盾時(shí)，加酸堿調(diào)pH（5）、發(fā)酵的不同階段采取不同的pH值 。12、 染菌對(duì)發(fā)酵有什么危害，對(duì)提煉有什么危害？答：染菌對(duì)發(fā)酵的危害：造成大

9、量原材料的浪費(fèi)，在經(jīng)濟(jì)上造成巨大損失擾亂生產(chǎn)秩序，破壞生產(chǎn)計(jì)劃 遇到連續(xù)染菌，特別在找不到染菌原因往往會(huì)影響人們的情緒和生產(chǎn)積極性影響產(chǎn)品外觀及內(nèi)在質(zhì)量染菌對(duì)提煉的危害：染菌的發(fā)酵液一般發(fā)粘，過(guò)濾困難。染菌發(fā)酵液中含有比正常發(fā)酵液更多的水溶性蛋白和其他雜質(zhì)，比較難于進(jìn)一步提煉。采用有機(jī)溶劑萃取的提煉工藝，則極易發(fā)生乳化，很難使水相和溶劑相分離，影響進(jìn)一步提純。采用直接用離子交換樹(shù)脂的提取工藝，如鏈霉素、慶大霉素，染菌后大量雜菌黏附在離子交換樹(shù)脂表面，或被離子交換樹(shù)脂吸附，大大降低離子交換樹(shù)脂的交換容量，而且有的雜菌很難用水沖洗干凈，洗脫時(shí)與產(chǎn)物一起進(jìn)入洗脫液，影響進(jìn)一步提純。13、 有哪些原因

10、會(huì)引起染菌？答：設(shè)備滲漏、空氣帶菌、種子帶菌、滅菌不徹底、技術(shù)管理不善、操作失誤等。14、 染菌以后應(yīng)采取什么措施？答：1） 染菌后的培養(yǎng)基必須滅菌后才可放入下水道 2） 凡染菌的罐要找染菌的原因，對(duì)癥下藥，該罐也要徹底清洗，空罐消毒，才可進(jìn)罐。 3） 染菌厲害時(shí)，車(chē)間環(huán)境要用石灰消毒，空氣用甲醛熏蒸，特別，若染噬菌體，空氣必須用甲醛蒸汽消毒。 4） 前期：嚴(yán)重的重新滅菌，輕微的控制條件提高生產(chǎn)菌的相對(duì)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)（溫度，pH，通氣） 5） 中期：危害大，營(yíng)養(yǎng)消耗快，pH變化大，菌絲自溶厲害，產(chǎn)物分泌減少或停滯。重新滅菌、提前、倒灌 6） 后期：危害小，堅(jiān)持或提前放罐15、為什么會(huì)感染噬菌體？感染

11、了噬菌體后應(yīng)采取哪些措施？答：1生產(chǎn)菌株本身可能就是帶有前噬菌體的污染菌，在發(fā)酵過(guò)程，如遇到某些條件個(gè)別菌體就會(huì)自發(fā)的進(jìn)入裂解性生活周期，而產(chǎn)生噬菌體。2發(fā)酵液中存在噬菌體，究其來(lái)源有：（1）含有噬菌體的發(fā)酵罐會(huì)通過(guò)排氣、測(cè)樣廢液、洗罐污水或偶爾的“跑液”等大量散布噬菌體，污染發(fā)酵環(huán)境和生產(chǎn)系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)。（2）濾過(guò)裝置不良、失效或處理不確實(shí)，并在環(huán)境中有噬菌體的情況下造成污染。（3）操作人員導(dǎo)致的污染。通過(guò)工作人員沾有噬菌體的手、工作服及所用器具導(dǎo)致噬菌體污染。（4）有時(shí)因噬菌體變異，使原本抗噬菌體的菌株變成敏感菌株，導(dǎo)致新的污染。如已感染噬菌體可采用以下措施：1)選育抗性菌株，及時(shí)改用抗噬菌

12、體的生產(chǎn)菌株。2)輪換使用專(zhuān)一性不同的菌株。3)加化學(xué)藥物(如谷氨酸發(fā)酵可加2-4ppm氯霉素，0.1%三聚磷酸鈉，0.6%檸檬酸鈉或銨等)。4)將培養(yǎng)液重新滅菌再接種(噬菌體不耐熱，70-80經(jīng)5分鐘即可殺死)。5）盡快提取成品16、 用于在線檢測(cè)的傳感器必須符合哪些要求？答：（1）必須經(jīng)受高壓蒸汽滅菌（材料、數(shù)據(jù)）;（2)結(jié)構(gòu)不存在滅菌死角（密封性好）（3） 對(duì)測(cè)量參數(shù)要敏感，且能轉(zhuǎn)換成電信號(hào)（響應(yīng)快，靈敏）；（4） 性能要穩(wěn)定，受氣泡影響小17、 PH電極的指示電極能測(cè)定pH值的原理是什么？答18、 pH電極的測(cè)量范圍有沒(méi)有限制？使用時(shí)應(yīng)注意哪些問(wèn)題？答：有，pH電極中，Na離子為干擾離

13、子，在pH超過(guò)10或Na離子較高時(shí)測(cè)定的pH會(huì)有偏差 使用注意：玻璃電極切勿倒置，也不要用手接觸電極的敏感膜；不要用手接觸需要高度絕緣的端子和接線頭19、溶氧電極能夠測(cè)定液體中溶氧濃度的原理是什么？答：20、 影響溶氧電極測(cè)定的靈敏度和準(zhǔn)確性的因素有哪些？答：靈敏度：增加膜穿透系數(shù)P ；減少膜厚度D；增加陰極表面積；擴(kuò)散速度；攪拌速度； 通氣量；培養(yǎng)液粘度準(zhǔn)確性：電極靈敏度；溫度（1）.壓力和溫度的影響：溶氧電極必須經(jīng)得起高壓蒸汽滅菌，如能耐130攝氏度，1小時(shí)滅菌和具有長(zhǎng)期的穩(wěn)定性，其漂移不大于1%/d，其精確度和準(zhǔn)確度在+3%。（2）.原電池型電極電流輸出受電極表面液流的影響。（3.）用溶

14、氧電極測(cè)定呼吸臨界氧值時(shí)，過(guò)程中先加強(qiáng)通氣攪拌，使溶氧上升到最高值，然后中止通氣，繼續(xù)攪拌，在灌頂部空間充氮。這時(shí)溶氧會(huì)迅速直線下降，直到其直線斜率開(kāi)始減少時(shí)所處的溶氧值便是呼吸臨界氧值。21、哪些儀器可以測(cè)定尾氣氧和尾氣二氧化碳？測(cè)定原理是什么？答： 尾氣CO2的測(cè)量 常用的尾氣測(cè)定儀是不分光紅外線二氧化碳測(cè)定儀（簡(jiǎn)稱IR），其精度高，可達(dá) 0.5%，量程的線性范圍大，雖然儀器價(jià)格高，但在生物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)常被采用。 不分光紅外線CO2氣體分析原理是：除了單原子氣體（如氖、氬等）和無(wú)極性的雙原子氣體（如氧、氫、氮等）外，幾乎所有氣體都在紅外波段（即微米級(jí)）具有不同的紅外吸收光譜，CO2的紅外吸收

15、峰在2.62.9m和4.14.5m之間有兩個(gè)吸收峰，根據(jù)吸收峰值可以求出CO2的所含濃度尾氣氧氣測(cè)定 原理是氧具有高順磁性。在磁場(chǎng)中，氧氣的磁化率比其采用熱磁氧分析儀測(cè)定 它氣體高幾百倍，故混合氣體的磁化率幾乎完全取決于含氧氣的多少。將排氣通入熱磁氧分析儀，就可測(cè)出排氣氧的含量。22、 泡沫對(duì)發(fā)酵有哪些有益之處，哪些有害之處？答：危害：（1)降低生產(chǎn)能力 在發(fā)酵罐中，為了容納泡沫，防止溢出而降低裝量（2）引起原料浪費(fèi) 如果設(shè)備容積不能留有容納泡沫的余地，氣泡會(huì)引起原料流失，造成浪費(fèi)。（3）影響菌的呼吸 如果氣泡穩(wěn)定，不破碎，那么隨著微生物的呼吸，氣泡中充滿二氧化碳，而且又不能與空氣中氧進(jìn)行交換

16、，這樣就影響了菌的呼吸。 （4）引起染菌 由于泡沫增多而引起逃液，于是在排氣管中粘上培養(yǎng)基，就會(huì)長(zhǎng)菌。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，雜菌會(huì)長(zhǎng)入發(fā)酵罐而造成染菌。大量泡沫由罐頂進(jìn)一步滲到軸封，軸封處的潤(rùn)滑油可起點(diǎn)消泡作用，從軸封處落下的泡沫往往引起雜菌污染。有利之處：氣體分散、增加氣液接觸面積。23、 發(fā)酵中泡沫形成的原因是什么？答：(1)通氣攪拌的強(qiáng)烈程度 通氣大、攪拌強(qiáng)烈可使泡沫增多，因此在發(fā)酵前期由于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分消耗少，培養(yǎng)基成分豐富，易起泡。應(yīng)先開(kāi)小通氣量，再逐步加大。攪拌轉(zhuǎn)速也如此。也可在基礎(chǔ)料中加入消泡劑。（2）培養(yǎng)基配比與原料組成 培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，黏度大，產(chǎn)生泡沫多而持久，前期難開(kāi)攪拌。（3）菌

17、種、種子質(zhì)量和接種量 菌種質(zhì)量好，生長(zhǎng)速度快，可溶性氮源較快被利用，泡沫產(chǎn)生幾率也就少。菌種生長(zhǎng)慢的可以加大接種量（4）滅菌質(zhì)量 培養(yǎng)基滅菌質(zhì)量不好，糖氮被破壞，抑制微生物生長(zhǎng)，使種子菌絲自溶，產(chǎn)生大量泡沫，加消泡劑也無(wú)效。24、 沒(méi)有外界作用力泡沫是否穩(wěn)定？在什么條件下泡沫會(huì)穩(wěn)定？答：不穩(wěn)定：泡沫是熱力學(xué)不穩(wěn)定體系泡沫體系的三階段變化：(1) 氣泡大小分布的變化半徑越小氣泡壓力越大(2) 氣泡液膜變薄泡沫液還比較厚，以后因蒸發(fā)排液而變薄，泡沫液會(huì)受重力的影響向下排液，泡沫液隨時(shí)間延續(xù)而變薄(3) 泡沫破滅泡沫由于排液，液量過(guò)少，表面張力降低，液膜會(huì)急劇變薄，最后液膜會(huì)變得十分脆弱，以至分子的

18、熱運(yùn)動(dòng)都可以引起氣泡破裂。因此只要泡沫液變薄到一定程度，泡沫即瞬間破滅在泡沫直徑小，表面張力小，具有吉布斯彈性，助泡劑濃度大，粘稠的液體中穩(wěn)定25、羅氏假說(shuō)對(duì)泡沫穩(wěn)定的條件作了如何假釋?zhuān)看穑涸谌芤褐?，溶解狀態(tài)的溶質(zhì)是穩(wěn)泡劑；不溶狀態(tài)的溶質(zhì)，當(dāng)浸入系數(shù)與鋪展系數(shù)均為正值時(shí)即是消泡劑26、 植物油的消泡機(jī)理是什么？答：消泡劑作用機(jī)理有a、消泡劑可使泡沫液局部表面張力降低，因而導(dǎo)致泡沫破滅b、消泡劑能破壞膜彈性而導(dǎo)致氣泡破滅 c、消泡劑能促使液膜排液，因而導(dǎo)致氣泡破滅 d羅氏假說(shuō)消泡劑根據(jù)其作用機(jī)理的不同可以分為破泡劑和抑泡劑植物油屬于天然油脂是一種破泡劑。其破消泡機(jī)理大致有二種。第一，吸附助泡劑，

19、加入電解質(zhì)，瓦解雙電層，及使助泡物被增溶等機(jī)理，這樣就破壞助泡物的穩(wěn)泡作用，同時(shí)消耗掉相應(yīng)的助泡物。第二，低級(jí)醇等溶解性較大的消泡劑，加到氣泡液中局部降低表面張力，發(fā)揮破泡作用，同時(shí)本身不斷破為碎塊，陸續(xù)溶解而失去破泡作用。破泡過(guò)程中，破泡劑不斷失效、消耗，而助泡劑卻不受影響。27、 對(duì)消泡劑有哪些要求？答：（1）在起泡液中不溶或難溶；（2）表面張力低于起泡液；（3）與起泡液有一定程度的親和性；（4）與起泡液不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；（5）揮發(fā)性小，作用時(shí)間長(zhǎng)28、 常用的消泡劑有哪幾類(lèi)？答：天然油脂（酒糟榨出液/啤酒花油） 聚醚類(lèi)（甘油三羥基聚醚、GP、GPE） 硅酮類(lèi)（二甲基硅油） 高級(jí)醇（7C-9

20、C醇）29、 對(duì)于黏稠的發(fā)酵液應(yīng)選怎樣的消泡劑，對(duì)于較稀的發(fā)酵液應(yīng)選怎樣的消泡劑？答：粘稠：聚氧乙烯氧丙烯甘油（GPE、泡敵）親水性較好，溶解度大，消泡能力強(qiáng)較?。壕垩醣└视停℅P）親水性差，在發(fā)泡介質(zhì)中溶解度小，抑泡能力強(qiáng)30、利用基因工程菌生產(chǎn)有什么優(yōu)勢(shì)？常用的宿主菌有哪些？答：工程菌一般都是野生菌改良過(guò)的，集合一些優(yōu)良性狀，可以增加發(fā)酵的終產(chǎn)物。常用宿主菌：大腸桿菌；G+細(xì)菌（枯草桿菌）；低等真核生物（酵母菌）；哺乳動(dòng)物細(xì)胞31、 利用基因工程菌生產(chǎn)有哪些特點(diǎn)？答：（1）基因易丟失，不穩(wěn)定（2）培養(yǎng)分兩段：前期菌體生長(zhǎng)，生長(zhǎng)到某一階段，加入誘導(dǎo)因子，誘發(fā)產(chǎn)物表達(dá)；(3)基因的不穩(wěn)定性。32、 重組菌基因不穩(wěn)定性的原因有哪些？答：（1）分離丟失；（2）結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性；（3）宿主細(xì)胞調(diào)節(jié)突變33、 在基因工程菌培養(yǎng)過(guò)程中為什么質(zhì)粒會(huì)丟失？答：質(zhì)粒