高效液相色譜儀分析測試-科標(biāo)分析

1、高效液相色譜儀分析測試系統(tǒng)組成高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相,被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相內(nèi),由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù),在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí),經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程,各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別,被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出,通過檢測器時(shí),樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀,數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。工作原理分配系數(shù)與組分、流動(dòng)相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān),也與溫度、壓力有關(guān)。在不同的色譜分離機(jī)制中,K有不同的概念:吸附色譜法為吸附系數(shù),離子交換色譜法

2、為選擇性系數(shù)(或稱交換系數(shù),凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可用分配系數(shù)來表示。在條件(流動(dòng)相、固定相、溫度和壓力等一定,樣品濃度很低時(shí)(Cs、Cm很小時(shí),K 只取決于組分的性質(zhì),而與濃度無關(guān)。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件,在這種條件下,得到的色譜峰為正常峰;在許多情況下,隨著濃度的增大,K減小,這時(shí)色譜峰為拖尾峰;而有時(shí)隨著溶質(zhì)濃度增大,K也增大,這時(shí)色譜峰為前延峰。因此,只有盡可能減少進(jìn)樣量,使組分在柱內(nèi)濃度降低,K恒定時(shí),才能獲得正常峰。延伸在同一色譜條件下,樣品中K值大的組分在固定相中滯留時(shí)間長,后流出色譜柱;K值小的組分則滯留時(shí)間短,先流出色譜柱?；旌衔镏懈鹘M分的分配系數(shù)相差越大,越容

3、易分離,因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。在HPLC中,固定相確定后,K主要受流動(dòng)相的性質(zhì)影響。實(shí)踐中主要靠調(diào)整流動(dòng)相的組成配比及pH值,以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時(shí)間,達(dá)到分離的目的。色譜(high performance liquid chromatography,HPLC也叫高壓液相色譜(high pressure liquid chromatography、高速液相色譜(high speed liquid chromatography、高分離度液相色譜(high resolution liquid chromatography等。是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上,

4、于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻,小顆粒具有高柱效,但會(huì)引起高阻力,需用高壓輸送流動(dòng)相,故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。高效液相色譜是目前應(yīng)用最多的色譜分析方法,高效液相色譜系統(tǒng)由流動(dòng)相儲(chǔ)液體瓶、輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成,其整體組成類似于氣相色譜,但是針對(duì)其流動(dòng)相為液體的特點(diǎn)作出很多調(diào)整。HPLC的輸液泵要求輸液量恒定平穩(wěn);進(jìn)樣系統(tǒng)要求進(jìn)樣便利切換嚴(yán)密;由于液體流動(dòng)相粘度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氣體,為了減低柱壓高效液相色譜的色譜柱一般比較粗,長度也遠(yuǎn)小于氣相色譜柱。HPLC應(yīng)用非常廣泛,幾乎遍及定量定性分析的

5、各個(gè)領(lǐng)域。使用高效液相色譜時(shí),液體待檢測物被注入色譜柱,通過壓力在固定相中移動(dòng),由于被測物種不同物質(zhì)與固定相的相互作用不同,不同的物質(zhì)順序離開色譜柱,通過檢測器得到不同的峰信號(hào),最后通過分析比對(duì)這些信號(hào)來判斷待測物所含有的物質(zhì)。高效液相色譜作為一種重要的分析方法,廣泛的應(yīng)用于化學(xué)和生化分析中。高效液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒有本質(zhì)的差別,它的特點(diǎn)是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相,適于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機(jī)化合物。色譜特點(diǎn)高壓壓力可達(dá)150300kg/cm2。色譜柱每米降壓為75kg/cm2以上。高速流速為0.110.0mL/min。高效塔板數(shù)可達(dá)5

6、000/米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。高靈敏度紫外檢測器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn):速度快通常分析一個(gè)樣品在1530min,有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。分辨率高可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果。靈敏度高紫外檢測器可達(dá)0.01ng,熒光和電化學(xué)檢測器可達(dá)0.1pg。色譜柱可反復(fù)使用用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少,容易回收樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞,可以收集單一組分或做制備。主要類型液固吸附色譜1.1分離原理液固色譜是基于各組分吸附能力的差異進(jìn)行混合物分離的,其固定相是固體吸附劑。1.2固定相;吸附色譜固定相可以分為極

7、性和非極性兩大類。1.3流動(dòng)相;流動(dòng)相要求:1.4應(yīng)用液固色譜是以表面吸附性能力為依據(jù)的,所以它常用于分離極性不同低的化合物,也能分離那些具有相同極性基團(tuán),但數(shù)量不同的樣品。液液分配色譜1.1分離原理;分配色譜法的原理與液液萃取相同,都是分配定律。1.2固定相;分配色譜固定相由兩部分組成,一部分是惰性載體,另一部分是涂漬在惰性載體上的固定液。1.3流動(dòng)相;分內(nèi)色譜中,要求流動(dòng)相盡可能不與固定液互溶1.4應(yīng)用;既能分離極性化合物,又能分離非極性化合物。由于不同極性鍵合固定相的出現(xiàn),分離的選擇性可得到很好的控制。鍵合相色譜1.2固定相;按極性大小可分為非極性、弱極性、極性化學(xué)鍵合固定相三種。凝膠色

8、譜凝膠色譜又稱分子排阻色譜,它是按照分子尺寸大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法。凝膠色譜法的固定相凝膠是一種多孔性的聚合材料,有一定的形狀和穩(wěn)定性。根據(jù)所用流動(dòng)相的不同,凝膠色譜法可以分為兩類:即用水溶劑做流動(dòng)相的凝膠過濾色譜法(GFC與用有機(jī)溶劑如四氫呋喃做流動(dòng)相的凝膠滲透色譜法(GPC.應(yīng)用高效液相色譜法只要求樣品能制成溶液,不受樣品揮發(fā)性的限制,流動(dòng)相可選擇的范圍寬,固定相的種類繁多,因而可以分離熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質(zhì)。與試樣預(yù)處理技術(shù)相配合,HPLC所達(dá)到的高分辨率和高靈敏度,使分離和同時(shí)測定性質(zhì)上十分相近的物質(zhì)成為可能,能夠分離復(fù)雜相體中的微量成分。隨著固定相的發(fā)展,有可能在充分保持生化物質(zhì)活性的條件下完成其分離。HPLC成為解決生化分析問題最有前途的方法。由于HPLC具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復(fù)利用,流出組分易收集等優(yōu)點(diǎn),因而被廣泛應(yīng)用到生物化學(xué)、食品分析、醫(yī)藥研究、環(huán)境分析、無機(jī)分析