HbeAg陰性乙型肝炎病毒感染機理的研究進展

1、HbeAg陰性乙型肝炎病毒感染機理的研究進展    乙型肝炎病毒（HBV）感染是嚴重威脅人類健康的問題，尤其在地方性流行區(qū)域如東亞和地中海地區(qū)。HBV在與宿主相互作用的過程中，形成了持續(xù)感染和逃避清除的精確機制，但至今仍知之甚少。由于1989年Carman1的開創(chuàng)性工作，使得人們逐漸意識到HBV變異可能是上述精確機制中相當(dāng)重要的一部分。 在HBV感染的自然史中，伴隨HBeAg的陰轉(zhuǎn)往往是HBV病毒血癥的消失或炎癥的靜息。但在一部分感染者中如重型肝炎患者，感染起始即為HbeAg陰性；另一部分感染者中如慢性肝炎患者，HBeAg陰轉(zhuǎn)并不意味著炎癥活動的停止。H

2、BeAg陰性而存在HBV病毒血癥的情形定義為HBeAg陰性的HBV感染。對其形成的原因，很多作者從HBV變異角度在分子水平上進行了深入的探討。 1 轉(zhuǎn)錄水平 HBeAg前體翻譯自3.5Kb的前C mRNA。前CmRNA轉(zhuǎn)錄受核心基因啟動子（CP）控制和調(diào)節(jié)2。CP包括基本啟動子（BCP）、上游調(diào)節(jié)序列（CURS）和負調(diào)節(jié)元件（NRE）。BCP以相對獨立的作用調(diào)控著前CmRNA和前基因組mRNA的轉(zhuǎn)錄3。 迄今為止，BCP變異與HBeAg陰性HBV感染的關(guān)系已基本明確。首先，在研究HBeAg陰性HBV感染者時發(fā)現(xiàn)，BCP變異很常見，變異類型包括nt17521776區(qū)段內(nèi)的點突變和不同長短長段的缺

3、失，以T1762/A1764聯(lián)合點突變最為常見4；在以HBV慢性感染者為對象，對HBV進行時間生物學(xué)研究時發(fā)現(xiàn)，T1762/A1765變異株具有明顯的生存優(yōu)勢，表現(xiàn)為快速的優(yōu)勢積累，在炎癥活動明顯的慢性乙型肝炎患者中尤其如此；與此同時，雖然HBV病毒血癥持續(xù)存在，HBeAg血清學(xué)狀態(tài)已發(fā)生由陽到陰的轉(zhuǎn)換。在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，T1762/A1764聯(lián)合點突變影響前CmRNA的轉(zhuǎn)錄效率，使得該mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降至1/51/379；關(guān)于是否影響前CmRNA的轉(zhuǎn)錄起始的精確性，有兩個相互矛盾的結(jié)果：一者認為T1762/A1764變異使得前CmRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點飄移610個核苷酸8；另一個結(jié)果顯示前C

4、mRNA的5端是一致的9。結(jié)果間矛盾的原因尚不明確。檢測蛋白表達時發(fā)現(xiàn)，T1762/A1764使得HBeAg水平下降至20%，這與早期的臨床研究結(jié)果似乎并不吻合；后來的研究認為HBeAg檢測方法的敏感性造成了體外實驗與臨床研究的差異10。 與此同時，T1762/A1764變異株卻導(dǎo)致HBV復(fù)制效率和核心抗原表達水平提高79。HBeAg表達降低的同時病毒水平增加，其中的原因仍不明確，但最近的一項實驗結(jié)果似乎給出了部分答案。體外包裝實驗證實，HBeAg前體可以干擾HBV的包裝過程；由于HBeAg前體與 hBV核心蛋白結(jié)構(gòu)上的相似性，在核心蛋白與前基因組mRNA進行裝配的過程中，HBeAg前體也可被

5、誤裝配，但無法進行下一步的逆轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程11。因此HBeAg前體是影響HBV包裝、復(fù)制的原因之一。所以，T1762/A1764等影響到HBeAg前體形成的變異株可使HBV變異株復(fù)制水平提高。這也部分解釋了T1762/A1764變異株在慢性HBV感染者中的優(yōu)勢積累現(xiàn)象。至于T1762/A1764變異株使得HBV核心蛋白增加的原因，可以推測，T1762/A1764變異時，可能因為HBV核心基因啟動子內(nèi)調(diào)節(jié)兩個3.5Kb mRNA轉(zhuǎn)錄區(qū)域的活性比失衡，造成前基因組mRNA轉(zhuǎn)錄增多，從而在轉(zhuǎn)錄水平上影響HBV核心蛋白的表達。 HBV BCP 變異對宿主的影響目前仍存在不同的看法。由于T1762/A1

6、764變異株在各類HBeAg陰性HBV感染者中的普遍存在，因此BCP變異株相對于野株的毒力大小尚不能確定；雖然此類變異株能引起HBV復(fù)制效率和核心蛋白表達水平提高，但其對宿主免疫狀態(tài)的影響仍未有實驗結(jié)果證實。至于BCP變異株對干擾素治療的反應(yīng)，目前的證據(jù)還很不足12。鑒于T1762/A1764變異株在慢性肝炎患者存在優(yōu)勢積累現(xiàn)象，因此在判斷干擾素療效時，HBeAg陰轉(zhuǎn)可能是個假象。所以，需要，更精確的療效判斷標(biāo)準。 由于CURS和NRE對HBV bCP的活性具有較強的調(diào)控作用2，兩個區(qū)段是否存在影響前CmRNA轉(zhuǎn)錄的變異，尚缺乏足夠的證據(jù)，有待于進一步研究。 2 翻譯水平 在翻譯水平上影響HB

7、eAg形成的病毒因素主要是HBV前C基因變異，包括A1896即前C終止密碼子變異和前C起始密碼變異13。A1896變異使得前C第28位密碼子由UGG突變?yōu)閁AG（終止密碼），造成HBeAg前體翻譯提前終止。前C起始密碼突變大約占前C變異的10%。 A1896變異與HBeAg血清學(xué)狀態(tài)的關(guān)系，并不是絕對的直接相關(guān)關(guān)系。在一部分感染A1896變異株的感染者中，應(yīng)用酶免疫法可以檢測到HBeAg；同時也發(fā)現(xiàn)個別慢性乙肝病人中，其感染的毒株雖由G1896突變?yōu)锳1896，HBeAg血清學(xué)結(jié)果依然呈陽性（待發(fā)表結(jié)果）。其原因可能是，UAG作為終止密碼，其將翻譯過程終止的能力在三個終止密碼中是最低的，即經(jīng)常

8、被讀通。雖然前C第28位氨基酸突變?yōu)榻K止密碼，翻譯HBeAg前體的過程仍有限度地進行，因此A1896變異對HBeAg形成的影響在某種程度上來講也是相對的。 A1896突變株在東亞及地中海國家很常見，但在美國和法國卻極少；目前業(yè)已明確A1896變異株的出現(xiàn)具有基因型依賴性，即AC型常見，D型很少。其原因可歸結(jié)于nt1858C或T的區(qū)別：在D型中nt1858位為C，在前基因組mRNA中與nt1896位G形成較穩(wěn)定的堿基配對；而在其他基因中nt1858位為T，與nt1896位的G組成的堿基對不甚穩(wěn)定。因此1896GA的突變增加前基因組包裝信號二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，有利于病毒的包裝和復(fù)制14。但問題是，為

9、什么總是發(fā)生nt1896GA的突變呢？nt1858TC的突變可有同樣的效能。在前基因組mRNA逆轉(zhuǎn)錄出第一鏈時，需要HBV自身編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶參與。對于逆轉(zhuǎn)錄酶來講，rG:dT的誤配是一各很穩(wěn)定的堿基配對，因此在HBV復(fù)制過程中，存在著很高頻率的GA突變；考慮到肝細胞內(nèi)dTTP/dCTP相對濃度的波動以及nt18961899連續(xù)4個G，可以理解nt1896GA何以那么常見15。 A1896變異同樣使得HBV復(fù)制效率和核心蛋白表達水平增加。HBV復(fù)制效率提高的原因，除了A1896變異增加前基因組mRNA包裝信號二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性外，HBeAg前體對HBV正確包裝的影響得以抑制也是原因之一。A1896

10、變異株導(dǎo)致HBV核心蛋白表達增加的原因，與BCP變異并不一樣。HBV為A1896突變毒株時，雖然HBeAg前體的翻譯過程提前終止，但以前CmRNA為模板的翻譯過程并沒有終止，而是從下游的ATG（第30密碼子）重新起始，翻譯產(chǎn)物似HBV核心蛋白，因此可以檢測到核心蛋白水平增加。可以造成HBeAg陰性HBV感染的變異株增色使得HBV的核心蛋白水平增加，這是一種巧合或是具有更深層的意義，目前尚不清楚。 3 翻譯后水平 HBeAg前體在核糖體內(nèi)從前CmRNA上翻譯出時，攜帶著29個氨基酸的信號肽，進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)并經(jīng)特異性的信號肽酶切割，同時將羧基端的數(shù)個氨基酸殘基切除，方能成為可分泌性的HBeAg16。

11、如果HBV dNA 一級結(jié)構(gòu)中的變異影響到翻譯后處理過程，將導(dǎo)致HBeAg前體在胞漿中蓄積，而循環(huán)中無或僅有較低水平17Kd的HBeAg出現(xiàn)。nt1863CT的變異導(dǎo)致前C第17位密碼子由纈氨酸到苯丙氨基酸的突變是常見的原因17。體外實驗已經(jīng)證實前C第17位氨基酸的變異導(dǎo)致HBeAg前體的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累，但在培養(yǎng)上清中同樣檢測到HBeAg，只是水平較低（郭亞兵，待發(fā)表結(jié)果）。至此，三各變異株，分別從HBV前CmRNA的轉(zhuǎn)錄、HBeAg前體的翻譯以及前體的翻譯處理三個水平上造成HBeAg陰性HBV感染；有趣的是，三種變異對可分泌性HBeAg形成的影響都不是絕對的。對于HBeAg前體的羧基端，是否也存在影響到HBeAg前體處理過程的變異，目前尚不清楚。 有作者在腎功能衰竭同時感染HBV的患者中發(fā)現(xiàn)，HBV核心基因部分缺失的變異株，缺失序列負責(zé)編碼HBeAg抗原決定簇（HBel）18，推測分泌性的HBeAg抗原性將大大降低，所以應(yīng)用常規(guī)多克隆抗體法（酶免疫法）檢不出血清HBeAg。缺失變異株的出現(xiàn)可能是由于細胞毒性淋巴細胞對靶表位的特異性清除造成的。核心基因缺失變異株可能并不常見。 總