抗原或抗體的檢測

1、抗原或抗體的檢測一、檢測的原理借助抗原和抗體在體外特異結合后出現(xiàn)的各種現(xiàn)象， 對樣品中的抗原或抗體進行定性、 定量、定位的檢測。1抗原與抗體的親和力 (affinity) 抗原抗體的結合就像酶與底物的結合，激素與其受體 的結合一樣不是化學的反響， 而是非共價鍵的可逆的結合。 抗原決定簇和抗體分子可變區(qū)互 補構型， 造成兩分子間有較強的親和力。 空間構型互補程度不同， 抗原和抗體分子之間結合 力強弱也不同?；パa程度高，那么親和力強。此外，反響溫度、酸堿度和離子濃度對抗原和抗 體分子上各基因的解離性和電荷特性也有重要的影響， 抗體與抗原決定簇之間的結合力大小 可用親合力來表示。 高親合力的抗體與抗

2、原的結合力強， 即使抗原濃度很低時也有較多的抗 體結合抗原形成免疫復合物。2抗原或抗體外檢測原理根據(jù)抗原抗體結合形成免疫復合物的性狀與活性特點，對標 本中的抗原或抗體進行定性、 定位或定量的檢測。 定性和定位檢測比擬簡單， 即用的抗 體和待檢樣品混合， 經過一段時間， 假設有免疫復合物形成的現(xiàn)象發(fā)生， 就說明待檢樣品中 有相應的抗原存在。 假設無預期的現(xiàn)象發(fā)生， 那么說明樣品中無相應的抗原存在。 同理也可用 的抗原檢測樣品中是否有相應抗體。對抗原或抗體進行定量檢測時，以反響中參加抗原和抗體的濃度與形成免疫復物的濃 度呈函數(shù)關系。1根據(jù)免疫復合物產生的多少來推算樣品中抗原或抗體的含量：在一定的反

3、響 條件下，參加的抗體 或抗原 的濃度一定，反響產生的免疫復合物多少與待檢樣品中 含有相應抗原或抗體 量成正比。 也就是抗體濃度一定時， 免疫復合物越多那么樣品中的抗 原量也越多?？捎脤嶒炐詷藴是€推算出樣品中抗原或抗體的含量。 如免疫單向擴散試 驗、免疫比濁試驗和酶聯(lián)免疫檢測等都屬于這類方法。2抗原或抗體效價滴定的原理：當抗原抗體復合物形成多少不能反響抗原抗體反響 強弱時， 就不能以檢測反響強度來對抗原或抗體進行定量。 在實際工作中， 把濃度低的反響 成分抗原或抗體 的濃度固定，把濃度高的另一種反響成分作一系列稀釋。例如用人血清 作抗原免疫 3 只家兔， 比擬 3 只家兔產生抗體的多少， 即

4、滴定 3 只兔血清抗體效價， 可用雙 向瓊脂擴散法來滴定， 例如將抗體濃度固定， 將抗原作不同的稀釋度， 分別將抗原或抗體滴 入瓊脂的相應小孔中，觀察免疫兔血清與不同稀釋度的抗原出現(xiàn)明顯沉淀淺的抗原稀釋度 如甲兔的抗體效價為 1/2000，而丙免的是 1/8000 那么可比擬出后者比前者產生抗體的效價 要高。也就是表示效價的稀釋度越高，樣品中所含待檢成分越多。因人血清抗原和抗 體免疫兔血清相比，濃度高，故應稀釋抗原。二、抗原或抗體檢測的實用意義1抗體檢測的意義檢測抗體可用于評價人和動物免疫功能的指標?？贵w用于臨床治療 或實驗研究時也需做純度分析和定量測定。 臨床上檢測病人的抗病原生物的抗體、

5、抗過敏原 的抗體、抗 HLA 抗原的抗體、血型抗體及各種自身抗體，對有關疾病的診斷有重要意義。2抗原檢測的意義可做為抗原進行檢測的物質可分為以下四類： 1各種微生物及其大分子產物： 用于傳染病診斷、 微生物的分類及鑒定以及對菌苗、 疫苗的研究。2生物體內各種大分子物質：包括各種血清蛋白如各類免疫球蛋白、補體的各種 成分、可溶性血型物質、多肽類激素、細胞因子及癌胚抗原等均可做為抗原進行檢測。在 對這些成分的生物學作用的研究以及各種疾病的診斷有重要意義。 3人和動物細胞的外表分子：包括細胞外表各種分化抗原如CD 抗原、同種異 型抗原血型抗原或 MHC抗原、病毒相關抗原和腫瘤相關性情抗原等。檢測這些

6、抗原對 各種細胞的分類、分化過程及功能研究、對各種與免疫有關的疾病的診斷及發(fā)病機制的研究， 均有重要意義。4各種半抗原物質：某些藥物、激素和炎癥介質等屬于小分子的半抗原，可以分別 將它們偶聯(lián)到大分子的載體上，組成人工結合的完全抗原。用其免疫動物，制備出各種半抗原的抗體，應用于各種半抗原物質的檢測，例如對某些病人在服用藥物后進行血中藥物濃度 的監(jiān)測。對運發(fā)動進行服用違禁藥品的檢測，都是應用半抗原檢測的方法。三、抗原或抗體檢測的方法由于各種檢測方法中所用的抗原性狀不同，出現(xiàn)結果的現(xiàn)象也不同。最廣泛應用方法 有下述幾種：一沉淀反響可溶性抗原與抗體結合，在兩者比例適宜時，可形成較大的不溶性免疫復合物。

7、在反應體系中出現(xiàn)不透明的沉淀物，這種抗原抗體反響稱為沉淀反響precipitation neaction。1環(huán)狀沉淀試驗先將含抗體的未稀釋的免疫血清加到直徑小于的小試管底部。將稀釋 的含有可溶性抗原的材料重疊于上，讓抗原與抗體在兩液體的界面相遇，形成白色免疫復合物沉淀環(huán)，故名為環(huán)狀沉淀試驗ring precipitationtest，此法簡便易行，需用材料較多是其缺點。2. 單向免疫擴散試驗單向免疫擴散試驗single immunodiffusion丨是在凝膠中進行的沉淀反響。將抗體混入加熱溶解的瓊脂中，傾注于玻片上，制成含有抗體的瓊脂板，在適當 位置打孔，將抗原材料參加瓊脂板的小孔內，讓抗原

8、從小孔向四周的瓊脂中擴散，與瓊脂中的抗體相遇形成免疫復合物。當復合物體積增加到一定程度時停止擴散，出現(xiàn)以小孔為中心的圓形沉淀圈，沉淀圈的直徑與參加的抗原濃度成正相關。本方法簡便，易于觀察結果，可 測定抗原的靈敏度最低濃度約為1020卩g/ml常用于定量測定人或動物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺點是需12天才能看結果圖1圖1單向免疫擴散試驗示意圖3免疫比濁法當抗體濃度高，參加少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼看不見的小免疫復合物，它可使通過液體的光束發(fā)生散射，隨著參加抗原增多，形成的免疫復合物也增多，光散射現(xiàn)象也相應加強。免疫比濁法immunonephelomytry丨就是在一定的抗體濃

9、度下，參加一定體積的樣品，經過一段時間，用光散射濁度計nephelometry測量反響液體的濁度，來推算樣品中的抗原含量。本法敏感、快速簡便，可取代單向擴散法定量測定免疫球蛋白的濃度。4, 雙向免疫擴散試驗雙免疫擴散試驗double immunodiffusion丨是在瓊脂板上按一定距離打數(shù)個小孔，在相鄰的兩孔內分別放入抗原和抗體材料。當抗原和抗體向四周凝膠中擴散，在兩孔間可出現(xiàn)23條沉淀線，本法常用于抗原或抗體的定性或定量檢測，或用于兩種抗原材料的抗原相關性分析圖2。圖2雙向免疫擴散試驗示意圖5. 對流免疫電泳對流電泳counterimmunoelectrophoresis丨是一敏感快速的檢

10、測方法，即在電場作用下的雙向免疫擴散。將瓊脂板放入電泳槽內，使瓊脂板的兩孔沿著電場的方向，于負極側的孔內參加抗原，于正極側的孔內參加抗體，通電后，抗原帶負電荷向正極泳動，抗體分子雖也帶負電荷，但因分子量大，向正極的位移小，而受瓊脂中電滲作用向負極移動，抗原和抗體能較快地集中在兩孔之間的瓊脂中形成免疫復合物的沉淀線。只需1小時左右即可觀察結果。6. 免疫電泳免疫電泳(immunoelectrophoresis)的方法分成兩個步驟，即先進行電泳，再進行瓊脂擴散。先將樣品參加瓊脂中電泳，將抗原各成分依電泳速度不同而分散開。然后在適當?shù)奈恢蒙涎仉娪痉较蛲谝恢本€形槽，于槽內參加含有針對各種抗原混合抗體液

11、，讓各抗原成分與相應抗體進行雙向免疫擴散，可形成多答卷沉淀線。常用此法進行血清的蛋白種類分析。對于免疫球蛋白缺損或增多的疾病的診斷或鑒別診斷有重要意義圖3。°晾脂小孑L內加真待槍絶消圖3免疫電泳法根本步示決圖7. 免疫印跡法免疫印跡法immunoblotting又稱為 Western印跡法，用于 AIDS的血 清抗體檢測。第一步，為電泳別離HIV抗原，在電場中根據(jù)分子量大小不同病毒抗原各成分散開。第二步，將電泳別離的蛋白質轉移到硝酸纖維膜上電印跡，然后將印跡有病毒抗原的硝酸纖維膜浸濕于病人血清中。如果病人血清中含有與一種或幾種抗原相對應的抗體的話，那么在該抗原印跡部位形成免疫復合物沉

12、淀。在洗去未沉淀的抗原和抗體后，在膜上加標記的抗人免疫球蛋白的抗體，此抗體可以和病毒抗原與人抗體形成的免疫復合物發(fā)生反 應，最后參加顯色底物如果抗人Ig是用酶標記的或做放射自顯影抗人 Ig用1251標記以顯示結果圖 4。I屯秫勞離；!.電印速J- St筈病人血荷:盤人蟲-Il 2切起超f說圧光帳樂記正休阮理圖4用免疫印跡法檢查患者血清中的HIV病毒抗體第一步：經電泳將 HIV混合抗合抗原按分子量大小別離； 第二步：將已別離的抗原經電印跡轉移到硝酸纖維膜上； 第三步：將待檢病人血清參加覆蓋于硝酸纖維膜上； 第四步：參加標記的第二抗體使之覆蓋膜上； 第五步：參加顯色底物或放射自顯影顯現(xiàn)第二抗體二凝

13、集反響細菌、紅細胞或外表帶有抗原的乳膠顆粒等都是不溶性的顆?？乖?，當與相應抗體結 合，抗原與抗體結合形成凝集團塊，即稱為凝集反響 agglutination 。1直接凝集直接凝集 direct agglutination 是將細菌或紅細胞與相應抗體結合產生的細菌凝集或紅細胞凝集現(xiàn)象。可用于傳染病診斷如肥達氏反響 Widal reaction 診斷傷寒 病。或利用血細胞凝集現(xiàn)象檢查血型。2間接凝集間接凝集 indirect agglutination 是用可溶性抗原包被在乳膠顆?；蚣t細胞外表，與相應抗體混合出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。如用丫球蛋白包乳膠顆粒檢測類風濕關節(jié)炎病人血清中的類風濕因子， 用甲狀腺球

14、蛋白包被乳膠顆粒用于檢測甲狀腺球蛋的抗體。 也可以 將抗體吸附到乳膠顆粒上檢查臨床標本中的抗原，如細菌或真菌性腦膜炎抗體包被的乳顆 粒，一旦與含有相應抗原的腦脊液混合， 便可發(fā)生凝集， 可進行快速診斷。 故凝集反響即可 測定抗原，也可測抗體，方法簡便、敏感。3. 抗球蛋白試驗 抗球蛋白試驗antiglobulin test,coombs test的原理為間接凝集試驗。 例如應用于診斷自身免疫溶血性貧血癥時，Rh+紅細胞與抗 Rh血清間的反響。因抗 Rh抗體是IgG只有兩個結合價，分子較小不如 IgM結合價多，分子大很難直接引起 Rh+紅 細胞凝集。如果參加抗 IgG 的抗體，就可幫助抗 Rh

15、的 IgG 的抗體凝集紅細胞。也就是經抗 Ig 的作用提高凝集反響的靈敏度。三補體參與抗原抗體反響這一類反響主要包括溶血反響hemolytic assay、補體介導的細胞毒試驗 complementmediated cytotoxicuty test 及補體結合試驗 complement fixation test 。1. 溶血反響抗體與紅細胞外表抗原相遇，形成紅細胞-抗體復合物即可使參加反響中的補體活化， 導致紅細胞溶解， 此方法可用于紅細胞的各種抗原或相應抗體的檢測， 此法 比凝集反響敏感。溶血反響也是用于抗體分泌細胞即空斑形成細胞PFC檢測的原理。2. 補體介導的細胞毒試驗各種有核細胞與

16、針對其外表抗原的抗體相遇，所形成的免疫復合物能活化反響中的補體， 引起細胞膜穿孔， 在一定時間內， 細胞仍能維持一定的形態(tài)不 破碎，參加水溶性染如伊紅Yeosin Y丨或臺盼藍trypan blue丨后，染料即可進入被活化補體穿孔的細胞， 不帶相應抗原細胞膜保持完整的活細胞不著色。 此方法可用于帶各種抗原 的細胞的檢測， 如進行細胞 MHC 抗原的鑒定， 和進行淋巴細胞中 T 細胞總數(shù)或其亞類的計 數(shù)。在一些免疫學實驗中也可用這種方法，根據(jù)需要特異地消除帶某種抗原的細胞。3. 補體結合試驗當抗原可溶性或顆粒性與相應抗體結合，由于濃度低不出現(xiàn)可見反響時， 應用補體結合試驗可檢出此抗原抗體反響，

17、它比凝集反響或沉淀反響靈敏度高。 本 法包括兩個抗原抗體系統(tǒng)。一為檢測系統(tǒng)由待檢樣品與抗原或抗體組成； 另一為指示系統(tǒng)，由綿羊紅細胞SRBC和抗SRBC組成。另參加作為補體的新鮮豚鼠血清。試驗 時試管中先參加檢測系統(tǒng)和補體，混合經37C 30分鐘使抗原、抗體、補體形成復合物，再參加指示系統(tǒng)， 如出現(xiàn)溶血現(xiàn)象， 說明檢測系統(tǒng)中沒有相對應的抗原抗體， 補體是游離的指 示系統(tǒng)的 SRBC 和抗體結合而出現(xiàn)溶血，即為反響陰性。如不出現(xiàn)溶血，說明檢測系統(tǒng)中 有抗原抗體復合物并結合補體，那么指示系統(tǒng)無多余的補體作用而沒有溶血現(xiàn)象，即為陽性。在敏感的抗原、抗體檢測方法如酶標方法出現(xiàn)之前補體結合試驗曾廣泛用于

18、檢測 各種細菌、病毒或螺旋體如梅毒的抗原或抗體，由于本試驗影響因素多，結果不穩(wěn)定現(xiàn) 已被新檢測方法所代替。四、用標記抗體或抗原進行的抗原、抗體反響 用熒光素、同位素或酶標記抗體或抗原，用于抗原或抗體檢測是目前廣泛應用的敏感、 可靠的方法。 上述三種常用的標記物與抗原或抗體化學連接之后不改變后者的免疫特性。本方法可用于定性、定量或定位檢測。1. 免疫熒光技術 免疫熒光技術 immunofluorescence techni 是用化學方法使熒光素 標記的抗體或抗原與組織或細胞中的相應抗原或抗體結合，進行定性定位檢查抗原或抗體的方法。1直接熒光法：把熒光抗體加到待檢的細胞懸液，細胞涂片或組織切片上進

19、行染色，經抗原抗體反響后，洗去未結合的熒光抗體，將待檢標本在熒光顯微鏡下觀察，有熒光的部位即有相應抗原存在，此法可用于病毒感染細胞、帶某種特異抗原的細胞如T細胞和B細胞或病原菌的檢查，也可用于組織中沉著的免疫復合物的檢查。本法的缺點是檢查多種抗原，就需分別制備相應的多種標記抗體。2間接熒光法：可克服直接法需制備多種熒光抗體的復雜操作。將組織或細胞上的 抗原直接與相應抗體 不標記熒光結合，此為第一抗體，再把能與第一抗體特異結合的熒 光標記的抗免疫球蛋白抗體參加，此為熒光標記的第二抗體， 觀察結果與直接法相同。 間接法比直接法敏感性高，如果用于檢查抗原的第一抗體是人或動物的只需制備一種抗人或動物

20、的免疫球蛋白熒光抗體圖 5。圖5免疫熒光直接法及間接法原理示意圖免疫熒光技術在傳染病診斷上有廣泛的用途，如在細菌、病毒、螺旋體感染的疾病， 檢查抗原或抗體，如查出IgM抗體，可做為近期接觸抗原的標志，所以使用熒光標記抗IgM 可診斷近期感染。除微生物學方面的應用外，還可利用單克隆抗體鑒定淋巴細胞的亞類。 使 用流式細胞儀(fluorescene-activated cell sorting,FACS)，能自動檢測細胞的大小、熒光強度。針對細胞外表不同抗原，可以使用兩種不同的熒光染料，如用異硫氰熒光素FITC丨發(fā)黃綠熒光，用羅丹明TMRITC丨發(fā)紅色熒光。由于熒光顏色不同標記兩種不同的抗體，對同

21、 一細胞進行雙標記染色。 對淋巴細胞亞類鑒定起著巨大推動作用。應用間接熒光法也用于自身免疫病的抗核抗體檢查。2. 放射免疫分析法 放射免疫分析法radioimmunoassay RIA應用競爭性結合的原理， 應作放射性同素標記抗原或抗體與相應抗體或抗原結合，通過測定抗原抗體結合物 的放射活性判斷結果，本方法可進行超微量分析，敏感性高，可用于測定抗原、抗體、抗原 抗體復合物。本法常用的同位素有125 I和131 I。放射免疫分析常用的有液相法和固相法兩種：1液相法：將待檢標本例如含胰島素抗原 與定時的同位素標記的胰島素抗原和定時的抗胰島素抗體混合，經一定作用時間后，別離收集抗原抗體復合物及游離的

22、抗原， 測定這兩局部的放射活性， 計算結合率。在反響系統(tǒng)中，待檢標本的胰島素抗原與同位素標 記的胰島素競爭奪戰(zhàn)性與胰島素抗體結合。 非標記的抗原越多，標記抗原與抗體形成的復合物越少。非標記抗原含量與標記抗原抗體復合物的量呈一定的函數(shù)關系。預先用標準的非標記抗原作成標準曲線后，即可查出待檢標本中胰島素的含量圖6。 殖時性憂記"軸壓 O 黑總呂顯M素出檢繃初折貶抗徉笫含 OO*o 1 ic未標記附抗原魅度圖6液相放射免疫分析法原理及標準曲線2固相法：將抗原或抗體吸附到固相載體外表，然后加待檢標本，最后加標記抗體。測定固相載體的放射活性，常用的固相載體有溴化氰CNBr海豹化的紙片或聚苯乙烯

23、小管圖7。0丄iclontj未標記的杭厲議度圖7固相放射免疫分析法原理放射免疫分析法應用范圍廣泛，包括多種激素胰島素、生長激素、甲狀腺素等維 生素、藥物、IgE等。3. 酶聯(lián)免疫分析法 酶聯(lián)免疫分析法 enzyme immunoassay,EIA是當前應用最廣泛的 免疫檢測方法。本法將抗原抗體反響的特異性與酶對底物高效催化作用結合起來，根據(jù)酶作用底物后顯色，以顏色變化判斷試驗結果，可經酶標測定儀作定量分析，敏感度可達ng水平。常用于標記的酶有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)、堿性磷酶alkal ine phosphatase等。它們與抗體結合不影響抗體活性。這些酶具有一定的穩(wěn)定性，制成酶標抗 體可保存較長時間。目前常用的方法有酶標免疫組化法和酶聯(lián)免疫吸附法。前者測定細胞外表抗原或組織內的抗原；后者主要測定可溶性抗原或抗體。本法既沒有放射性污染又不需昂貴的測試儀器，所以較放射免疫分析法更易推廣。Q域杖述機牝勒齡圖8生物素-酶標親合素系統(tǒng)反響示意圖1酶聯(lián)免疫吸附試驗enzyme linked immunosorbent