實時熒光定量PCR

1、PCR技術的基本原理 類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；引物的延伸：DNA模板-引物結合物在TaqDNA聚合酶(Taq DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性是該酶用于PCR反應的前提條 件)的作用下，以dNTP(dNTP，deoxy-ribonucl

2、eoside triphosphate（脫氧核糖核苷三磷酸）的縮寫。是包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP,dUTP等在內(nèi)的統(tǒng)稱，N是指含氮堿基，代表變量指代A、T、G、C、U等中的一種。在生物DNA、RNA合成中，以及各種PCR（RT-PCR、Real-time PCR）中起原料作用)為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘， 23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍實時熒光定量PCR原理所謂實時

3、熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。 1. Ct 值的定義在熒光定量PCR技術中，有一個很重要的概念 - Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如圖1所示）。 2. 熒光域值（threshold）的設定PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10 SDcycle 3-15 3. Ct值與起始模板的關系研究

4、表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 4. 熒光化學熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下： 1）TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'3

5、9;外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術平臺。 2）SYBR熒光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。 編輯本段內(nèi)標在傳統(tǒng)定量中的意義1 幾種傳統(tǒng)定量

6、PCR方法簡介：1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的內(nèi)標和引物，內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內(nèi)標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標為對照定量待檢測模板。 2）競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知

7、模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。 3）PCRELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCRELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標，作出標準曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。 4）微譜分析法：主要是用來分析產(chǎn)品的成分，對各個成分進行定性定量分析，是一種集光譜、能譜、質(zhì)譜、色譜等微觀譜圖于一體使用、或者是指結合使用其中的兩到三種方式的綜合性定性定量分析方法。 2內(nèi)標在傳統(tǒng)定量中的作用由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測，即PCR到達平臺期后進行檢測，而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴增到達平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差。

8、同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復實驗，所得結果有很大差異（見圖4），因此無法直接從終點產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。 編輯本段內(nèi)標對熒光定量PCR的影響1實時熒光定量PCR無需內(nèi)標實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎之上的： 1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正

9、的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。 2）Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。 2內(nèi)標對實時熒光定量PCR的影響若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標，則PCR反應變?yōu)殡p重PCR，雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標。也正是

10、這個原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標，但仍然只是一種半定量的方法。 美國Texas大學的科研人員進行了外標法定量和內(nèi)標法定量的方法學比較，得出的結論是：內(nèi)標法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標準曲線的定量方法是一種準確的、值得信賴的科學方法。 Applied Biosystems公司的7700型實時熒光定量PCR儀是全球公認的熒光定量PCR的金標準，可實現(xiàn)多色熒光同時檢測，但定量檢測仍然采用外標準曲線的方法，而不用內(nèi)標進行定量。 綜上所述，利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體

11、檢測等諸多領域。 熒光PCR是分子診斷的熱點技術，它將先進的定量PCR與實時PCR技術相結合，西安天隆生產(chǎn)的國產(chǎn)實時熒光定量PCR儀為肝炎艾滋病等重大疾病的定量核酸檢測及分子診斷、同時也為沙門氏菌阪崎氏腸桿菌等食品安全檢測提供了先進手段。即使在發(fā)達國家，熒光定量PCR儀和基因擴增儀都被廣泛用于臨床及生物學、醫(yī)學研究。由于其極高的靈敏度、極寬的檢測范圍，以及精確定量、方便快速、無窗口期等優(yōu)點，美國FDA及我國國家標準已將定量PCR儀規(guī)定為確診禽流感等傳染病以及奶粉等食品安全檢測的必備儀器。 實時熒光定量PCR儀（real-time qPCR）的發(fā)明實現(xiàn)了榮獲諾貝爾化學獎的PCR核酸檢測、分子診斷

12、的技術飛躍。 編輯本段PCR儀在國內(nèi)的發(fā)展狀況西安天隆科技有限公司生產(chǎn)的處于國際領先水平的TL988型實時熒光定量PCR儀適用于臨床及科研以聚合酶鏈式反應為特征的、以實時熒光定量檢測分析DNA/RNA為目的的病原體檢測及基因分析。 臨床疾病診斷：各型肝炎、艾滋病、禽流感、結核、性病等傳染病診斷和療效評價；地中海貧血、血友病、性別發(fā)育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優(yōu)生優(yōu)育檢測；腫瘤標志物及瘤基因檢測實現(xiàn)腫瘤病診斷；遺傳基因檢測實現(xiàn)遺傳病診斷。 動物疾病檢測：禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等、炭疽芽孢桿菌。 食品安全：食源微生物、食品過敏源、轉基因、

13、乳品企業(yè)阪崎腸桿菌等檢測。 科學研究：醫(yī)學、農(nóng)牧、生物相關分子生物學定量研究。 應用行業(yè)：各級各類醫(yī)療機構、大學及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。 由于qPCR是實時定量檢測致病病原體基因核酸，因此它比化學發(fā)光、時間分辨、蛋白芯片等免疫學方法更具獨到優(yōu)勢。 技術原理：微譜分析實驗室將標記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性，低溫復性，適溫延伸的熱循環(huán)，并遵守聚合酶鏈反應規(guī)律，與模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷，熒光素游離于反應體系中，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長，通過實時檢測與之對應的隨擴

14、增而變化熒光信號強度，求得CT值，同時利用數(shù)個已知模板濃度的標準品作對照，即可得出待測標本目的基因的拷貝數(shù)。 性能標準及參數(shù)標本載體 0.2ml薄壁PCR離心管 標本數(shù)量 標本數(shù)量36個，包括4個標準品 試 劑 SYBR Green I，F(xiàn)AM，Tex Red，F(xiàn)ITC等熒光染料，開放式PCR試劑 反應體系 10-100L 建議質(zhì)控 四個陽性標準品、陰性對照 指標 熒光激發(fā)波長 470nm 熒光發(fā)射波長 530nm，640nm，710nm 570nm，605nm 熒光檢測方式 光開關陣列組合光電倍增管PMT方式 控溫范圍 4.0-99.0 熱蓋溫度 100120 升/降溫速度 4.0/S（Ma

15、x） 溫度均勻性 ±0.3 溫度精確度 ±0.3 溫度顯示精度 0.1 檢測范圍 1011010DNA/RNA copy/ml CT值重復性誤差 CV2.1% 核酸精度相關系數(shù) R0.997 軟件 溫階 19 循環(huán) 199 保溫時間 19999秒 文件 19個連接 升級方式 遠程硬件內(nèi)控軟件升級 系統(tǒng)接口 RS-232C串行接口，雙向數(shù)據(jù) 主機操作系統(tǒng) Windows2000/XP 產(chǎn)品外形尺寸 50cm × 40cm × 35cm 產(chǎn)品重量 25kg 使用環(huán)境 溫度540，相對濕度80% 使用電源 AC220 × (1±10%)V,

16、50 × (1±2%)HZ 功耗 1100VA 多規(guī)格 提供96孔，多通道/多色、36孔等不同規(guī)格產(chǎn)品 專利技術應用實現(xiàn)快速高效均衡擴增檢測由光開關陣列、自聚焦透鏡和尾纖準直器及變增益微光O/E裝置組成的MEMS有機整體，在以16位單片機為核心的電控裝置管理下，能在毫秒級時間內(nèi)完成多個標本快速均衡掃描檢測，避免了機械掃描方式或CCD掃描方式引起的時間滯后或漸暈誤差。實現(xiàn)標準樣本的PCR熱循環(huán)擴增及高通量實時熒光激發(fā)和定量檢測。 編輯本段產(chǎn)品突出特性« 走在PCR技術的前列 在PCR儀研發(fā)和市場化領域中歷史悠久； 將標準化的PCR檢測技術成功廣泛用于臨床；

17、 « 快速實時PCR技術實現(xiàn)了DNA/mRNA檢測的快速性 實時檢測啟用熒光探針標記特定核酸的方法使準確性更高； 簡化了傳統(tǒng)PCR方法； 使用最少的樣本量，在一小時左右出結果； « 簡便閉管分析使您完成加樣后就無須再接觸樣本 減少樣本消耗殆盡風險； 縮短了出報告時間； 簡化了試驗步驟； « 提高了用戶高級應用的靈活性 提供了用戶自定義PCR操作平臺； 建立您的用戶自定義應用； 分析用戶自定義試驗； « 高性能 高靈敏度； 高特異性； 寬的動態(tài)范圍； « 強大的軟件數(shù)據(jù)管理系統(tǒng) 完整的病例檔案；

18、集成化的網(wǎng)絡服務功能； 圖標顯示； 自動試劑及結果跟蹤； 客戶使用界面友好； « 開放式、個性化儀器易于適應您的實驗室環(huán)境 « 免維護光源系統(tǒng) 高亮度窄帶LED光源，工作穩(wěn)定，使用壽命長，終身免維護 « 靈敏精確的光電系統(tǒng) 熒光激發(fā)/檢測單色器采用美國原產(chǎn)濾光片；檢測器采用日本原產(chǎn)金屬封裝式光電倍增管PMT，具有靈敏度高、快速、穩(wěn)定的特點；準直器、光開光陣列、光纖組件、電控裝置全部采用進口期間；精度高，一致性好。 « 先進的溫控系統(tǒng) 本儀器采用膜加熱及半導體熱泵制冷技術保證了升降溫的快速穩(wěn)定、儀器壽命長的特點，加有熱蓋保證了PCR無礦物油操作，避免了人為原因造成的污染。 « 先進的溫控系統(tǒng) 本儀器采用膜加熱及半導體泵制冷技術保證了升降溫的快速穩(wěn)定、儀器壽命長的特點，加有熱蓋保證了PCR無礦物油操作，避免了人為原因造成的污染。 « 友好的軟件系統(tǒng) 中文Windows傳統(tǒng)界面更符合國人操作習慣，多個標準參數(shù)填空式輸入降低了因參數(shù)設置所造成的事物；參數(shù)輸入