道地藥材五鶴續(xù)斷基因組脫氧核糖核酸提取方法的改進(jìn)

1、 11-04-24 11:20:00 作者：羅洪斌，張健，丁莉編輯：studa20【摘要】 目的為研究道地藥材五鶴續(xù)斷的遺傳多樣性、種類鑒定和基因指紋圖譜的構(gòu)建等提供基本保證。方法以中藥材五鶴續(xù)斷藥源植物的鮮嫩葉片為材料，采用CTAB法并加以改進(jìn)從中提取出基因組脫氧核糖核酸(DNA)，并檢測其提取效果。結(jié)果使用改進(jìn)的CTAB法從鮮葉中提取五鶴續(xù)斷的基因組DNA濃度較高，能滿足PCR反應(yīng)的要求。結(jié)論自行改進(jìn)的CTAB法提取道地藥材五鶴續(xù)斷基因組DNA效果較好。 【關(guān)鍵詞】 五鶴續(xù)斷; 脫氧核糖核酸(DNA)提取; CTAB法; 改進(jìn)道地藥材是傳統(tǒng)中醫(yī)藥文化中的精品，是在特定產(chǎn)區(qū)的外界環(huán)境和產(chǎn)區(qū)內(nèi)

2、該物種的地方種群遺傳性狀等綜合因素的作用下，形成的品質(zhì)優(yōu)、療效佳的中藥材1。道地藥材與非道地藥材是不同產(chǎn)區(qū)的生物品，藥材品質(zhì)存在差異，但兩者的形態(tài)和組織構(gòu)造差異往往不明顯，難以運(yùn)用傳統(tǒng)方法準(zhǔn)確鑒別藥材道地性。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA分子鑒定技術(shù)及方法已廣泛運(yùn)用于中藥材道地性與非道地性的鑒定2。而DNA的分離純化是DNA分子鑒定等分子生物學(xué)操作中的重要步驟，同樣也是藥用植物分子診斷技術(shù)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于中藥材中含有的小分子次生物質(zhì)，如萜類、黃酮、香豆素、有機(jī)酸、鞣質(zhì)等含有酚羥基的化合物，氧化后易與DNA結(jié)合，引起DNA降解或抑制酶的活性;而廣泛存在的多糖類由于與DNA同屬大分子化合物，在一般

3、提取過程中很難完全去除。因此有必要不斷摸索并建立不同條件下簡單、快捷、高純度的中藥材基因組DNA提取方法。本實(shí)驗(yàn)就是以道地藥材五鶴續(xù)斷的幼嫩葉片為試驗(yàn)材料，采用自行探索改良的CTAB法對五鶴續(xù)斷基因組DNA進(jìn)行了提取，得到了質(zhì)量較高的五鶴續(xù)斷基因組DNA，為應(yīng)用于五鶴續(xù)斷的遺傳多樣性、種質(zhì)鑒定和基因指紋圖譜的構(gòu)建等分子水平的研究提供了基本保證，也為其他道地藥材在分子生物學(xué)水平方面的研究提供了一定的參考資料。1 材料與儀器1.1 材料五鶴續(xù)斷葉片均采自湖北省恩施土家族苗族自治州鶴峰縣走馬鎮(zhèn)萬寺坪道地藥材五鶴續(xù)斷GAP研究及種植基地，經(jīng)湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院中藥教研室袁成玉副教授鑒定，用干燥劑將葉片干

4、燥后置于-80冰箱備用。1.2 試劑1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，3 mol/L 乙酸鈉，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，1 mol/L NaC1，氯仿/異戊醇241，異丙醇，無水乙醇，70%乙醇，10%CTAB溶液，1.5 x CTAB提取液，CTAB沉淀液，5 mol/L NaC1，1 mol/L乙酸鈉，10mg/ml RNaseA，高鹽TE(含1 mol/L NaC1)，1TE緩沖液，以上部分是用分析純配制試劑;Taq DNA聚合酶、dNTPs等，購自大連寶生物有限公司;十六烷基三甲基溴化錠(CTAB)為Geneview分裝，購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司;

5、瓊脂糖購自北京華美公司。1.3 儀器SANYO超低溫冰箱，Eppendorf 低溫高速離心機(jī)，Eppendorf 梯度PCR儀，BeckmanD/U530紫外分光光度計(jì)，恒溫水浴鍋，DYY-10C水平電泳儀，BIORAD凝膠成像系統(tǒng)，研缽和研棒，移液器。2 方法2.1 基因組DNA的提取DNA提取以CTAB常規(guī)法3，4為基礎(chǔ)。為了克服多酚、多糖等次生物質(zhì)對DNA純度的干擾，提高獲得DNA的數(shù)量和質(zhì)量，同時(shí)還受到條件的限制，本研究對其進(jìn)行了改良：選取新鮮幼嫩的五鶴續(xù)斷葉片，酒精消毒后快速放入超低溫冰箱;在沒有液氮的情況下，利用超低溫冰箱的冷凍作用和暗視野效應(yīng)，再用預(yù)冷的研缽和研棒快速粉碎五鶴續(xù)斷

6、葉片;不用飽和酚，增加一次氯仿/異戊醇的用量，避免殘留蛋白質(zhì)和酚等物質(zhì)影響DNA的質(zhì)量;用1 mol/L NaCl，除去多糖物質(zhì)，同時(shí)可減輕DNA的褐化。改良后的CTAB法具體提取步驟如下：快速取出保存在超低溫冰箱中的新鮮葉片3 g，放入已預(yù)冷凍的研缽中，迅速研磨成粉末，移入50 ml 離心管;然后加入8 ml的CTAB提取液(先預(yù)熱到80)，充分混勻，65水浴中保溫60 min，其間每20 min反轉(zhuǎn)搖勻1次，取出樣品，冷卻至室溫;加入4 ml氯仿，混勻后，平放在震蕩器上搖動(dòng)10 min至抽提液與氯仿完全混合，室溫下4 000 r/min離心15 min;將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中;加入1/

7、10量的10%CTAB液，搖勻;加入等體積的氯仿/異戊醇(241)，震蕩15 min至混勻，室溫下4 000 r/min離心5 min;取上清液重復(fù)此步驟;取上清液，加入等量的沉淀液，搖勻，室溫放置10m in，然后4 000 rmin離心10 min;取上清液加入1倍體積的預(yù)冷異丙醇，混勻，-20靜置20 min使沉淀生成，12 000 r/min離心5 min;棄上清液，加入5 ml高鹽TE(含1 mol/L NaCl)和5 l 10 mg/ml RNase A 在55搖床中輕搖至完全溶解;加入1/10體積的3 mol/L乙酸鈉和2倍體積的冰凍無水乙醇，充分混勻，-20靜置20 min，使

8、沉淀凝聚，用玻璃棒鉤出呈絮恕狀的DNA，在70%乙醇中洗滌23次，最后去除乙醇將沉淀放置風(fēng)干，加入300 l TE緩沖液至完全溶解沉淀，再短暫離心。2.2 DNA的檢測用紫外分光光度法測定 DNA 260 nm 及280 nm 吸光值，然后根據(jù)A 260/280值判斷DNA純度并根據(jù)DNA 260 nm檢測其濃度。用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA樣品：取8 l DNA樣品在1.0%的瓊脂糖凝膠(含0.5 l/ml的EB溶液染色)中進(jìn)行電泳分離，在紫外透射儀下檢測DNA的純度及降解情況。用瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR產(chǎn)物：取8 l PCR產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠(含0.5 l/ml的EB溶液染色)中

9、進(jìn)行電泳分離，在紫外透射儀下檢測PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增效果。3 結(jié)果與分析3.1 提取方法的凝膠檢測和PCR反應(yīng)檢測分析從圖1可以看出，基因組DNA濃度較高，呈現(xiàn)一條亮帶，無降解，說明對五鶴續(xù)斷鮮葉采用改進(jìn)的CTAB法效果較好，能提取得到完整潔凈的基因組DNA。從圖2可明顯發(fā)現(xiàn)，用改進(jìn)后的8個(gè)不同來源的基因組DNA為模板在五鶴續(xù)斷18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增中均得到理想的帶型。1.利川 2.恩施 3.建始 4.咸豐 5.宣恩 6.鶴峰 7.巴東圖1 五鶴續(xù)斷不同產(chǎn)地的樣品DNA電泳圖1.利川 2.恩施 3.建始 4.咸豐 5.宣恩 6.鶴峰 7.巴東圖2 不同產(chǎn)地的五鶴續(xù)斷18S rRNA基因的PCR產(chǎn)物電泳圖3.2 紫外分光光度計(jì)檢測由表1可見，對于新鮮葉子采用