動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究方式與其在中醫(yī)研究中應(yīng)用

1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究方式與其在中醫(yī)研究中應(yīng)用大家上過“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)”沒有？動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是近代生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)展起來的重要手段，生命科學(xué)的許多重大發(fā)現(xiàn)和突破均建立在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之上。 美國心理學(xué)會(huì)動(dòng)物研究指導(dǎo)總則“動(dòng)物行為研究者應(yīng)努力促進(jìn)對(duì)基本行為原理的理解和/或?yàn)樘岣呷祟惖慕】岛托腋Ｗ髫暙I(xiàn)。為達(dá)到這些目標(biāo)，研究者要保證動(dòng)物的權(quán)利和人道地對(duì)待它們。雖然有法律和規(guī)定，但一只動(dòng)物的即時(shí)保護(hù)則有賴于科學(xué)家的個(gè)人良知。”（B.H.坎特威茨等. 實(shí)驗(yàn)心理學(xué), 116）美國心理學(xué)會(huì)還提供了學(xué)生研究者的指導(dǎo)原則。總體上，“當(dāng)采用動(dòng)物被試時(shí)，應(yīng)精心照料并盡可能減少它們的痛苦和不適?！?（B.H.坎特威茨等. 實(shí)驗(yàn)心理學(xué), 124）

2、 中醫(yī)能不能采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物？突出的問題是四診困難、情志難以把握，大家有什么看法。有利的因素、不利的因素分別有哪些？有人懷疑心理學(xué)研究的價(jià)值，責(zé)問政府何以資助小白鼠走迷津。這是他們對(duì)于心理學(xué)研究的期望不恰當(dāng)，而不在于心理學(xué)研究的本身。（B.H.坎特威茨等. 實(shí)驗(yàn)心理學(xué), 24）有人通過幾年的研究發(fā)現(xiàn)，盡管不同地區(qū)山雀的“方言”不同，但在同一地區(qū)生活的山雀所發(fā)出的入侵警報(bào)模式確可以穩(wěn)定地延續(xù)幾代。（B.H.坎特威茨等. 實(shí)驗(yàn)心理學(xué), 35）雄獅實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的重要性（教材第二段）：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)中醫(yī)學(xué)的重要組成部分和重要的研究方法和手段，無論對(duì)中醫(yī)學(xué)數(shù)千年來所積累的疾病認(rèn)識(shí)、防治豐富經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證和總

3、結(jié)，對(duì)歷代醫(yī)家理法方藥的研究，對(duì)中醫(yī)學(xué)理論的研究和發(fā)展，還是對(duì)當(dāng)前中醫(yī)藥學(xué)各個(gè)學(xué)科的教學(xué)、科研，對(duì)新的治療方法（包括應(yīng)用藥物和非藥物療法）的發(fā)展，乃至對(duì)新的中醫(yī)藥學(xué)理論體系的創(chuàng)立，等等，都是不可缺少的。近幾十年來，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)已經(jīng)作為一門獨(dú)立的學(xué)科迅速地發(fā)展起來。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)、繁殖、馴化、監(jiān)測(cè)和開發(fā)應(yīng)用，以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的規(guī)范和要求形成了一整套完整的理論和方法，這些同樣適用于中醫(yī)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，中醫(yī)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)又有其自身特點(diǎn)，其研究、發(fā)展還將豐富實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)的內(nèi)容。第一節(jié) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的主要要求和特點(diǎn)一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的定義：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是指以實(shí)驗(yàn)研究為目的，在一定的環(huán)境條件控制下，經(jīng)過培

4、養(yǎng)馴化，具有明確的生物學(xué)特性和清楚的遺傳和微生物背景的動(dòng)物。圖1 小鼠 圖2 裸小鼠 圖4 裸大鼠 圖5 大鼠 圖6 白兔 圖7 兔的飼養(yǎng)圖8 比格犬及其飼養(yǎng) 圖9 馬及其飼養(yǎng)常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類繁多，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)根據(jù)課題的需要和動(dòng)物的特性加以選擇，使研究目的與動(dòng)物的種屬、特性和個(gè)體差異相吻合，才能保證研究工作的順利進(jìn)行。不同的科學(xué)實(shí)驗(yàn)要求選擇和開發(fā)最適宜的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。正確選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)周密詳盡，可以節(jié)省人力、動(dòng)物和時(shí)間，以最小的代價(jià)，最大限度地獲得可靠的研究結(jié)果。否則，不僅會(huì)造成不必要的浪費(fèi)，嚴(yán)重的還會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷，甚至導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗。因此，選擇和開發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

5、的首要環(huán)節(jié)，至關(guān)重要，應(yīng)予以足夠的重視。在醫(yī)學(xué)研究中首先要從研究目的和實(shí)驗(yàn)要求來選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其次要考慮是否容易獲得、是否經(jīng)濟(jì)及容易飼養(yǎng)等因素。三個(gè)基本要求：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物通常應(yīng)該具備個(gè)體間的均一性、遺傳性能的穩(wěn)定性和比較容易獲得這三個(gè)基本要求。具體要求如下：1盡量選用機(jī)能、代謝、結(jié)構(gòu)及其它方面機(jī)能與人相似的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般來說，動(dòng)物的進(jìn)化階段愈高，機(jī)能、代謝、結(jié)構(gòu)愈復(fù)雜，也就愈接近人類。2選用標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指遺傳背景明確、飼養(yǎng)環(huán)境與動(dòng)物體內(nèi)的微生物得到控制、符合一定標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。 只有選用標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，而且實(shí)驗(yàn)過程也在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中飼養(yǎng)的動(dòng)物，在實(shí)驗(yàn)中才能排除因動(dòng)物雜交、遺傳上的不均質(zhì)

6、及環(huán)境條件的變化，所引起的個(gè)體反應(yīng)不一致，排除因動(dòng)物攜帶細(xì)菌、病毒、寄生蟲和潛在疾病的影響，才能便于分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高科學(xué)性，準(zhǔn)確性，把所獲得的結(jié)果與同類研究進(jìn)行比較、交流，并得到承認(rèn)。在實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)避免使用隨意交配繁殖的動(dòng)物，而應(yīng)根據(jù)研究目的選擇用遺傳學(xué)控制的方法培育出來的近交系、突變系、系統(tǒng)雜交或封閉群動(dòng)物。同時(shí)應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行微生物控制，發(fā)展使用無菌動(dòng)物、已知菌動(dòng)物或無特定病原體（SPF）動(dòng)物。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分類 按遺傳控制分類： （1）近交系，即純系動(dòng)物：其動(dòng)物遺傳的均質(zhì)性保證了實(shí)驗(yàn)反應(yīng)的穩(wěn)定性。 （2）封閉群動(dòng)物：能較好地代表自然群體的遺傳特性。 （3）雜交一代動(dòng)物（F1

7、）：在一定程度上，兼有近交系和封閉群的特點(diǎn)。 （4）突變動(dòng)物：往往具有鮮明的人類疾病模型特征。 按微生物控制的程度，我國將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四個(gè)等級(jí)： （1）普通級(jí)動(dòng)物：一般為教學(xué)示范用。 （2）清潔級(jí)動(dòng)物：國內(nèi)科研工作要求的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物，適合于大多數(shù)科研課題。 （3）無特定病原體動(dòng)物（SPF動(dòng)物）：國際標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。 （4）無菌動(dòng)物（CF動(dòng)物）和悉生動(dòng)物：僅在特殊課題需要時(shí)使用。圖10 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心 圖11 清潔級(jí)準(zhǔn)備室圖12 清潔級(jí)走廊 圖13 小鼠飼養(yǎng)室3選用解剖、生理特點(diǎn)符合實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊蟮膶?shí)驗(yàn)動(dòng)物催吐實(shí)驗(yàn)適宜選用猴、貓，不選用大小鼠，因?yàn)樾?大鼠無嘔吐反應(yīng)。膽囊功能實(shí)驗(yàn)不選用大鼠，因?yàn)榇笫鬅o膽囊

8、。發(fā)汗中藥的研究不能選用小鼠（無汗腺）。慢性支氣管炎的實(shí)驗(yàn)不能選用大小鼠，因?yàn)樾?大鼠氣管及支氣管腺不發(fā)達(dá)。計(jì)劃生育研究常選用小鼠和大鼠。因繁殖力強(qiáng)，性周期和妊娠期短，生長快。如常用小鼠做抗生育、抗著床、抗早孕、抗排卵等實(shí)驗(yàn)應(yīng)用上的首選動(dòng)物。心血管病研究豬(辛克萊小型豬/廣西巴馬小型豬/歐米尼豬)。豬冠狀動(dòng)脈，在解剖學(xué)、血液動(dòng)力學(xué)上與人類相似。對(duì)高膽固醇食物的反應(yīng)與人一樣，很容易出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化的典型病灶。實(shí)驗(yàn)外科學(xué)研究犬(比格犬/華北犬/西北犬/狼犬)。內(nèi)臟與人相似，比例近似。臨床醫(yī)生在研究新的手術(shù)或麻醉方法時(shí)往往選用犬來做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，取得經(jīng)驗(yàn)和技巧后用于臨床。如心血管外科，腦外科，斷肢再植，

9、 器官和組織移植等。行為學(xué)和精神病及神經(jīng)生物學(xué)研究獼猴。制造和鑒定脊髓灰質(zhì)炎疫苗獼猴是唯一的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。4選用不同種屬品系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物某些特殊反應(yīng)，使適合于不同研究目的的需要腫瘤研究常選用近交系小鼠，如AKR小鼠白血病 發(fā)生率可達(dá)90；C3H小鼠乳腺癌發(fā)病率達(dá)97，而不選用C57BL等小鼠，因其乳腺癌發(fā)病率極低(5)。發(fā)熱、解熱和檢查致熱源實(shí)驗(yàn)適宜選用兔做實(shí)驗(yàn)，因?qū)俸銣貏?dòng)物，對(duì)致熱物質(zhì)反應(yīng)敏感。高血壓病研究選用SHR大鼠，因自發(fā)性高血壓，心血管疾病發(fā)病率高，對(duì)降壓藥物有反應(yīng)。耳科學(xué)研究豚鼠聽神經(jīng)對(duì)聲波特別是7002000Hz的純音最敏感，常用于聽覺和內(nèi)耳疾病的研究。免疫學(xué)研究豚鼠易引起變態(tài)反應(yīng)，產(chǎn)生

10、大量補(bǔ)體，是過敏性休克和變態(tài)反應(yīng)研究的首選動(dòng)物。5實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬、品系的選擇如果實(shí)驗(yàn)結(jié)論只針對(duì)某一品系則使用一個(gè)品系。如果實(shí)驗(yàn)結(jié)論針對(duì)整個(gè)物種在內(nèi)的一般性研究則使用多個(gè)不同來源的品種、品系。一般對(duì)多物種進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)先選小型動(dòng)物，再推廣到大型物種；要求只能建立在對(duì)多個(gè)物種進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，才能推廣到人類，也稱動(dòng)物實(shí)驗(yàn)外推。常用順序時(shí)小鼠、大鼠、兔、犬、猴。6遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的一般規(guī)則 （1）年齡、體重應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩磉x擇適齡動(dòng)物。一般實(shí)驗(yàn)均用成年動(dòng)物進(jìn)行；幼齡動(dòng)物一般較成年動(dòng)物敏感；老年動(dòng)物的代謝活動(dòng)及各種機(jī)能低下，反應(yīng)遲鈍，除了作老年醫(yī)學(xué)研究外，其它專業(yè)很少應(yīng)用。同一實(shí)驗(yàn)所選動(dòng)物年齡應(yīng)一致，體重大

11、致相近，一般不應(yīng)相差10%。（2）性別不同性別動(dòng)物對(duì)同一實(shí)驗(yàn)處理（如藥物、刺激等）的感受性常有差異，在實(shí)驗(yàn)研究中如無特殊要求，一般宜選用雌雄各半做實(shí)驗(yàn)。（3）生理狀態(tài)與健康情況動(dòng)物的不同生理狀態(tài)如懷孕、授乳時(shí)對(duì)外界刺激的反應(yīng)常有所改變，在一般研究中應(yīng)從實(shí)驗(yàn)組中刪除；必須選用健康動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（4）實(shí)驗(yàn)季節(jié)和晝夜過程不同季節(jié)和不同晝夜，動(dòng)物機(jī)體反應(yīng)性會(huì)有一定改變，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇中也應(yīng)予以注意。（5）實(shí)驗(yàn)的重復(fù)與肯定由于不同種動(dòng)物有不同的功能和代謝特點(diǎn)，所以在肯定一個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，往往采用兩種以上動(dòng)物進(jìn)行比較觀察，尤其將動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷到人的實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)該慎重。例如，所選的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如一種為嚙齒類動(dòng)物，另

12、一種應(yīng)該為非嚙齒類動(dòng)物。常用的序列是小鼠、大鼠、狗或猴。二、中醫(yī)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的注意點(diǎn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在中醫(yī)實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用和發(fā)展中，建議注意以下幾個(gè)方面。1中醫(yī)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)以中醫(yī)理論為指導(dǎo)2中醫(yī)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)從中醫(yī)臨床出發(fā)3中醫(yī)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)突出中醫(yī)治療原則一、證動(dòng)物模型的開創(chuàng)和發(fā)展自本世紀(jì)60年代以來，在中醫(yī)證的動(dòng)物模型制作與研究方面做了大量的研究工作。迄今證的動(dòng)物模型逾150多種。其中包括各種虛證（陰虛、陽虛、氣虛、血虛、各臟腑虛）、血瘀證、肝郁證、寒證、熱證、溫病衛(wèi)氣營血諸證、里實(shí)證等模型，等等。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模型應(yīng)用于中醫(yī)臨床研究，為中醫(yī)診療方法研究提供了大量的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，為臨床理論的深化與新理論的形

13、成提供了便利。教材上的事例很好。第二節(jié) 中醫(yī)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的主要內(nèi)容二、以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證臨床治療方法，探求其作用機(jī)理臨床治療方法的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究主要包括以下幾方面（以下的例子很好，可以選擇性介紹）：1研究經(jīng)方的作用機(jī)理（如姜廷良的桂枝湯研究）2研究名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)療法的作用機(jī)理（如二仙湯的研究）3應(yīng)用于新藥開發(fā)（如譚日強(qiáng)肝達(dá)康片的研制）三、中醫(yī)基礎(chǔ)理論的研究及其在教學(xué)上的應(yīng)用四、其它研究與應(yīng)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在中醫(yī)研究中已滲入到各個(gè)領(lǐng)域。除以上所介紹的外，較多的應(yīng)用領(lǐng)域有中藥藥理（包括性味歸經(jīng)）的實(shí)驗(yàn)研究、中草藥毒理的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、各類常用中草藥有效成份的藥理、毒理和代謝，中草藥原料開發(fā)、保健品和化妝品等開發(fā)，以及

14、對(duì)其安全性評(píng)價(jià)等等。從生物學(xué)觀點(diǎn)看，人與動(dòng)物既有特殊性也有其共同，正因?yàn)槿伺c動(dòng)物存在著共同性，所以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)人是有參考意義的，而且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以根據(jù)研究目的需要進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)，容許嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，可以重復(fù)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行多指標(biāo)觀察與損害性觀察。因此利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)合臨床觀察，已成為中醫(yī)藥研究必要手段。由于辨證為中醫(yī)的特點(diǎn)之一，因此動(dòng)物證的研究被列為研究中醫(yī)的突破口，用動(dòng)物模擬“證”的實(shí)驗(yàn)研究。然而，復(fù)制中醫(yī)“證”的動(dòng)物模型工作復(fù)雜、難度大、任務(wù)艱巨。盡管如此，近年來在廣大中、西醫(yī)和中西醫(yī)結(jié)合科研工作者的努力下，研制出了大量的動(dòng)物模型。其復(fù)制方法主要有3類：第三節(jié) 證動(dòng)物模型研究范例1依據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理

15、論。2依據(jù)西醫(yī)臨床、藥學(xué)知識(shí)。3根據(jù)科研成果。教材介紹了三個(gè)范例。一、寒涼藥、溫?zé)崴幩潞C、熱證動(dòng)物模型二、乙酰苯肼致血虛證動(dòng)物模型三、風(fēng)寒濕邪家兔痹證模型問題是，常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，大鼠、小鼠能不能實(shí)現(xiàn)四診，能不能實(shí)現(xiàn)基于四診的辨證，以及辨證論治？小鼠辨證論治方法的由來和進(jìn)展方肇勤方肇勤 潘志強(qiáng)潘志強(qiáng) 陳曉陳曉 盧文麗盧文麗 付曉伶付曉伶李海燕李海燕 陳德溯陳德溯 侯俐侯俐 廖明娟廖明娟 湯偉昌湯偉昌管冬元管冬元 吳中華吳中華 許敏許敏 闞衛(wèi)兵闞衛(wèi)兵 許家佗許家佗上海中醫(yī)藥大學(xué)上海中醫(yī)藥大學(xué) 引 言 辨證論治是中醫(yī)學(xué)的優(yōu)勢(shì)。在新形式下，如何深入揭示辨證論治的機(jī)制、提高辨證論治的療效，是中醫(yī)、中西

16、醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)學(xué)科的重要研究方向。 辨證論治的基礎(chǔ)研究主要借助于小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。為了滿足研究的需要，國內(nèi)學(xué)術(shù)界業(yè)已發(fā)展出200余種證候的動(dòng)物模型，集中在常見的氣、血、陰、陽虛證和實(shí)熱、血瘀等實(shí)證。在很大程度上彌補(bǔ)了辨證論治研究動(dòng)物模型的欠缺，促進(jìn)了辨證論治基礎(chǔ)研究與發(fā)展。 但是迄今為止，尚缺乏小鼠四診和基于四診的辨證論治方法和技術(shù)，這成為新時(shí)期中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究的瓶頸。 那么，為什么要實(shí)現(xiàn)基于四診的小鼠辨證？這是因?yàn)橐恍W(xué)術(shù)問題已凸現(xiàn)出來： （1）證候是體內(nèi)多系統(tǒng)、組織、細(xì)胞、分子等不同層次生物學(xué)變化外在的綜合反映。由于缺少小鼠四診方法，以往有關(guān)小鼠證候判斷，主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)數(shù)據(jù)，或治療反證，一直未

17、能建立起證候與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)一一對(duì)應(yīng)的聯(lián)系。而大量的研究表明，目前一些常用實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)還不能代表證候。 （2）實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，大多要求損傷、處死動(dòng)物，如此難以動(dòng)態(tài)觀察證候的自然演變和辨證論治療效。 （3）實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，大多成本高、檢測(cè)周期長，不利于辨證論治基礎(chǔ)研究和發(fā)展的高效、批量要求。 （4）大量的證候動(dòng)物模型、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和方證論治一再證明，實(shí)驗(yàn)用大鼠、小鼠是存在證候的。 （5）我們長期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，一再觀察到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠、小鼠存在體質(zhì)差異，以及同病異證、異病同證的現(xiàn)象，不加辨證的單方治療，療效往往受到限制，甚至?xí)a(chǎn)生副作用。 因此，我們提出，實(shí)現(xiàn)小鼠基于四診的辨證是學(xué)術(shù)發(fā)展的必然趨勢(shì)和要求。 那么，如何

18、實(shí)現(xiàn)小鼠的四診呢？比如問診如何問？中醫(yī)四診重視面色和舌診，小鼠頭面布滿被毛，舌又不會(huì)配合地伸出來，如何望診？小鼠如何把脈？一些學(xué)者還一直對(duì)中醫(yī)四診有顧慮，不能量化，小鼠四診能否量化？對(duì)此我們開展了長期的探索和研究，結(jié)果如下： 圖1 正常與晚期荷瘤小鼠面容 圖2 正常小鼠 圖3 腫瘤壓迫張口呼吸小鼠 一、疾病小鼠存在證侯及其演變圖4 早期荷瘤昆明種小鼠 圖5 中期荷瘤氣虛小鼠 圖6 中晚期荷瘤氣虛小鼠 圖7 中晚期荷瘤陰虛小鼠 圖8 晚期荷瘤陰陽兩虛小鼠 以下為不同組別荷瘤小鼠爪： 圖11 爪消瘦而略紅 圖12 爪淡掌略胖圖9 正常小鼠爪 圖10 爪淡伸展無力以下為編號(hào)為H9荷瘤小鼠不同日期拍攝

19、的爪： 圖15 腫瘤接種第2周 圖16 腫瘤接種第2.5周圖13 腫瘤接種第1周 圖14 腫瘤接種第1.5周二、正常小鼠存在體質(zhì)差異/證候差異 圖17 正常昆明種小鼠后爪 圖18 偏虛證的正常昆明種小鼠后爪 圖19 正常昆明種小鼠后爪R值的正態(tài)分布 圖20 正常昆明種小鼠體重的正態(tài)分布 三、小鼠如何問診 人、鼠對(duì)話是困難的，但是問診所期望采集的信息卻大多是可以獲得的，而且部分信息的完整性、可靠性還優(yōu)于普通臨床上的問診。 為什么呢？眾所周知，問診歸納起來是十問：一問寒熱二問汗，三問頭身四問便，五問飲食六胸腹，七聾八渴俱當(dāng)辨，九問舊病十問因，還要參考服藥。臨床上，患者的一般情況也是問診的重要內(nèi)容。

20、對(duì)此，小鼠可以通過以下途徑實(shí)現(xiàn)： 1. 問寒熱。小鼠畏寒，往往表現(xiàn)為扎堆，飼養(yǎng)中可以觀察到；畏寒的另一特點(diǎn)是畏寒的局部體表溫度下降，通過體表紅外成像數(shù)碼拍攝和圖像處理，可以精確定量；而體內(nèi)和體表溫度的改變，可以分別通過肛溫、腋溫、尾溫、爪溫檢測(cè)獲得。因此，以上檢測(cè)可以很好地達(dá)到問寒熱的主要目的，而且部分實(shí)現(xiàn)了量化。 2. 問汗。有報(bào)道嘗試通過特殊染色技術(shù)，檢測(cè)爪面出汗點(diǎn)和數(shù)量多寡；有的實(shí)驗(yàn)觀察了皮毛潮濕的程度，部分彌補(bǔ)了問汗的困難。 3. 問頭身。頭身的感受可以綜合兩個(gè)方面的信息獲得：1）造模方法，如果這些方法在臨床上可能造成頭身證候的，比如頭顱手術(shù)、高血壓、感冒等，可以參考；2）小鼠曠場(chǎng)自主

21、探究和活動(dòng)、抖攏檢測(cè)，如果頭身痛楚，則小鼠活動(dòng)和探究頻率和幅度會(huì)減少。 4. 問便。飼養(yǎng)可以直接觀察大便的數(shù)量和質(zhì)量，小便可以通過代謝籠完整回收，觀測(cè)其數(shù)量和性狀。 5. 問飲食。攝食量和飲水量可以精確測(cè)量，嚙齒頻率（通過聲音采集與分析）可以部分反映其脾胃健康與否。 6. 胸腹。方法類似于問頭身。 7. 聾。生理學(xué)有聽覺反應(yīng)檢測(cè)，可以采用；小鼠曠場(chǎng)、抖攏檢測(cè)可以觀察小鼠反應(yīng)的靈敏與遲鈍，間接反映其聽覺。 8. 渴。飲水量的精確測(cè)量，以及結(jié)合代謝籠尿液收集數(shù)量、顏色，判斷其可能水分通過呼吸、汗液、尿液代謝的途徑：陽熱盛往往表現(xiàn)為飲多而尿少且赤；下消則飲一溲一，等等。 9. 問舊病。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的疾病

22、遺傳，以及疾病或證候造模方法是明確的，而臨床卻往往做不到。 10. 問病因。同上，而且造模藥物干預(yù)過程也是明確的。 11. 參服藥。治療干預(yù)記錄是十分明確的。 12. 一般情況。包括動(dòng)物購入和實(shí)驗(yàn)日期、品系、月齡、性別，飼養(yǎng)、繁殖背景等均是明確的。 因此，小鼠雖然難以實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)意義上的問診，比如疼痛的性質(zhì)或持續(xù)時(shí)間，但問診許多重要內(nèi)容，卻是可以詳細(xì)、準(zhǔn)確獲得的。而且，大多可以精確地定量，因而其可靠性、準(zhǔn)確性往往還要優(yōu)于通常意義上的臨床問診。 四、小鼠如何望診 1. 望面色 以下圖右是正常小鼠，腫瘤虛證小鼠在左側(cè)。從圖中可以看到，正常小鼠頭部上抬，直視相機(jī)鏡頭，很關(guān)注；眼裂寬，眼色紅潤、有神；吻部

23、飽滿、紅潤；腫瘤虛證小鼠則相反，頭低垂、目光呆滯，失去了好奇；雙目色暗；吻部瘦削、色暗滯。21 正常與腫瘤小鼠面容與體態(tài) 2. 望舌 清醒狀態(tài)下，小鼠舌不易自主伸出，如果強(qiáng)迫其伸出，必然嚴(yán)重干擾氣血運(yùn)行，不符合中醫(yī)四診原則。當(dāng)小鼠麻醉后，可以方便地輕輕撐開小鼠嘴，使其舌自然伸出口腔之外，采用顯微放大（8-15），是可以清晰觀察到的。其表現(xiàn)與人類舌象十分相似。血虛舌淡，陰虛陽盛舌偏紅。 但是，麻醉會(huì)干擾小鼠氣血運(yùn)行；不同模型小鼠對(duì)麻醉的耐受度還不同，甚至難以接受；麻醉過深會(huì)導(dǎo)致小鼠死亡，過淺則小鼠會(huì)出現(xiàn)掙扎、不配合等等。因此，常規(guī)地開展舌診，有一定的限制。有沒有部分可以替代的方法？ 圖22正常小

24、鼠舌 圖23環(huán)磷酰胺模型 圖24乙酰苯肼模型 圖25甲狀腺素模型 圖26丙基硫氧嘧啶模型 圖27正常小鼠爪 圖28環(huán)磷酰胺模型 圖29乙酰苯肼模型 圖30甲狀腺素模型 圖31丙基硫氧嘧啶模型 圖32正常小鼠尾 圖33環(huán)磷酰胺模型 圖34乙酰苯肼模型 圖35甲狀腺素模型 圖36丙基硫氧嘧啶模型 小鼠舌象與爪尾的比較 3. 望爪和尾 與人類不同，小鼠爪、尾的角化質(zhì)比較薄，可以較好地反映氣血充盈和陰陽盛衰的表現(xiàn)。以上不同模型小鼠爪、尾（8）各取自以上舌象的同一小鼠。就紅色的程度而言，各模型舌、爪、尾是一致的，爪、尾色可以部分替代舌色和面色。 將以上標(biāo)準(zhǔn)拍攝的顯微數(shù)碼照片輸入電腦，采用計(jì)算機(jī)和Phot

25、oshop7.0圖像軟件，可以對(duì)所規(guī)定的區(qū)域提取色素，圖像挖掘。所獲得的國際標(biāo)準(zhǔn)色R、G、B數(shù)值（R代表紅色，G代表綠色，B代表藍(lán)色），可以換算出紅色程度的分量值r。r=R/（R+G+B）。將以上不同模型舌、爪、尾小鼠r提取并作圖如下： 以上結(jié)果說明： （1）舌、爪、尾顏色的變化趨勢(shì)是一致的，r值的變化趨勢(shì)也一致。 （2）反映紅色的程度，舌優(yōu)于爪、爪優(yōu)于尾。因此，要觀察氣血寒熱，優(yōu)先觀察舌、其次是爪。 （3） 通過標(biāo)準(zhǔn)顯微攝影和經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像處理，可以實(shí)現(xiàn)部分小鼠望診的標(biāo)準(zhǔn)化、客觀化和計(jì)量化。圖37 計(jì)算機(jī)圖像處理后各組小鼠爪、尾、舌r值 4. 望診其他采集內(nèi)容 包括：稱重、望形體虛實(shí)、望形體神

26、、望形體寒熱、望運(yùn)動(dòng)步態(tài)、望精力、望毛色虛實(shí)、望呼吸狀況、望眼神、望耳、望鼻、望唇、望腹、望二陰、望大便、望小便、望爪、望尾、望睡眠、爪和尾顯微拍照（顏色、胖瘦、光澤、爪舒展、爪伸展、爪老嫩、爪潔凈、爪潰爛）。 5.不同品系小鼠爪等的證候表現(xiàn)非常一致 以上望診方法，是否適用于常見不同品系小鼠？黑色與白色小鼠是否一致？我們比較了常用不同品系小鼠C57小鼠（黑色）、BALBc、ICR、昆明小鼠（均為白色）的四診表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)具有很高的一致性。這一結(jié)果提示，我們所建立的望診方法是適用于常用不同品系小鼠的。以下是不同品系小鼠的爪： 圖38 C57小鼠爪 圖39 BALBc小鼠爪 圖40 ICR小鼠爪 圖4

27、1 昆明小鼠爪 五、小鼠如何切診 1. 小鼠如何把脈 我們沒有開展小鼠把脈的研究，主要是擔(dān)心會(huì)干擾其氣血運(yùn)行。然而，我們建立了小鼠自然狀態(tài)下心電的快速采集。該設(shè)計(jì)思路和采集裝置已經(jīng)獲得中華人民共和國專利，專利號(hào)為：ZL03116816.7?？梢灶愃朴跈z測(cè)脈的至數(shù)與節(jié)律，如促、結(jié)、代、數(shù)、疾、緩、遲等脈象。 2. 切診的其他項(xiàng)目與內(nèi)容 包括體溫和膚之溫涼、腫塊的大小與質(zhì)地、肌力的強(qiáng)弱等，不同疾病和證候動(dòng)物還會(huì)有一些特殊的檢測(cè)內(nèi)容。 六、小鼠如何聞診 小鼠聞診內(nèi)容目前主要為嗅氣味，聲音的標(biāo)準(zhǔn)采集和分析將有助于判斷小鼠的虛實(shí)。 七、小鼠四診的標(biāo)準(zhǔn)化、客觀化、計(jì)量化采集與分析 為實(shí)現(xiàn)小鼠非創(chuàng)傷性的標(biāo)準(zhǔn)

28、化、客觀化、計(jì)量化四診檢測(cè)，我們提出并初步建立了小鼠四診工作站。 1. 思路和原則 繼承中醫(yī)四診和辨證論治的理論與方法，模擬中醫(yī)臨床四診信息的采集方式，實(shí)現(xiàn)小鼠的非創(chuàng)傷性四診檢測(cè)，同時(shí)部分實(shí)現(xiàn)四診檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化、量化，提高四診檢測(cè)速度，以適應(yīng)大樣本的檢測(cè)之需。即： （1）非創(chuàng)傷性檢測(cè)； （2）標(biāo)準(zhǔn)化、客觀化、計(jì)量化； （3）可操作原則，即操作容易和方便，便于掌握和普及； （4）低成本原則，利于普及； （5）流水作業(yè)原則，以提高檢測(cè)速率。 2. 小鼠四診工作站內(nèi)容 （1）小鼠行為學(xué)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)單元 （2）小鼠爪、尾顯微放大拍攝單元 （3）小鼠舌顯微放大拍攝單元 圖42 小鼠曠場(chǎng)檢測(cè) 圖42-1 小

29、鼠爪尾顯微放大拍攝單元（4）小鼠自然狀態(tài)下心電快速采集單元 圖43 小鼠清醒狀態(tài)下前后肢引導(dǎo)出的心電圖423 小鼠爪持法 圖423 小鼠尾持法（5）小鼠腋溫采集單元（6）小鼠體重采集單元 （7）小鼠整體外觀攝影單元（8）小鼠抖攏自主活動(dòng)狀況采集單元（9）小鼠攝食量稱量單元（10）小鼠飲水量測(cè)量單元（11）荷瘤小鼠瘤徑的測(cè)量（12）信息綜合處理單元3. 小鼠四診檢測(cè)操作流程和原則（1）操作流程（2）操作原則八、小鼠常見證候辨證標(biāo)準(zhǔn)1四診信息的標(biāo)準(zhǔn)采集2建立各四診信息的正常參考值（1）建立實(shí)驗(yàn)前各四診信息的正常參考值（2）建立正常對(duì)照組動(dòng)態(tài)的正常參考值（3）部分檢測(cè)數(shù)據(jù)基數(shù)校正3癥狀歸類預(yù)處理表1

30、 形質(zhì)、遲動(dòng)、淡、紅、青紫、瘀、寒熱癥狀類類別癥狀形質(zhì)減少如消瘦、體重減輕/偏輕、爪和尾瘦癟，等形質(zhì)增加如胖、體重偏重/重、爪和尾胖/腫，等動(dòng)心率偏數(shù)/數(shù)、吻和軀體移動(dòng)增加，等遲心率緩/遲、吻和軀體移動(dòng)減弱，等淡唇、耳、爪、尾淡/偏淡等紅唇、耳、爪、尾紅/偏紅等熱腋溫偏高/高等寒腋溫低/偏低、蜷縮、扎堆、發(fā)抖等青紫、瘀唇、耳、爪、尾暗、偏暗/青紫、腫塊，等表2 虛實(shí)、濕、毒、病因病邪、病態(tài)癥狀歸類類別癥狀實(shí)如：病邪造模、腫瘤，等虛如：老年、發(fā)育不良，食量減少、體重減輕等濕大便偏濕、粘液便、皮毛濕，等毒如癌腫等病因病邪如接種腫瘤、血管結(jié)扎、失血，等病態(tài)如爪不潔、污物附著，等表3 五臟定位癥狀歸類

31、類別癥狀心神志異常、眼中無神、嗜臥、心臟病變等肝筋脈拘攣、目疾、多怒撕咬、或肝臟病變等脾飲食減少、腹脹滿、肌體羸瘦、瀉利等肺皮膚病變、喘急、鼻孔見有出血和撓鼻等腎老年、羸瘦、發(fā)育不良、生殖及生殖器異常等 4常見的寒熱、虛實(shí)、氣血、陰陽、病邪、五臟證候辨證標(biāo)準(zhǔn) （1）寒、熱、虛、實(shí)等的辨證標(biāo)準(zhǔn) 表4 寒、熱、虛、實(shí)等的辨證標(biāo)準(zhǔn)證辨證標(biāo)準(zhǔn)寒證寒表現(xiàn)1項(xiàng)或以上偏寒證寒表現(xiàn)1項(xiàng)或以上，權(quán)重分值低熱證紅、熱表現(xiàn)1項(xiàng)或以上偏熱證紅、熱表現(xiàn)1項(xiàng)或以上，權(quán)重分值低虛證虛、形質(zhì)減少、遲、色淡等表現(xiàn)1項(xiàng)或以上，項(xiàng)目多，程度重偏虛證虛、形質(zhì)減少、遲、色淡等表現(xiàn)1項(xiàng)或以上，權(quán)重分值低實(shí)證實(shí)、形質(zhì)增加、濕、毒、病因病邪

32、等表現(xiàn)1項(xiàng)或以上，愈重愈實(shí)偏實(shí)證實(shí)、形質(zhì)增加、濕、毒、病因病邪等表現(xiàn)1項(xiàng)或以上，權(quán)重分值低（2）陰虛證、陰虛火旺、陽虛證、陰陽兩虛、氣虛證、血虛證等的辨證標(biāo)準(zhǔn) 表5陰虛證、陰虛火旺、陽虛證、陰陽兩虛、氣虛證、血虛證等的辨證標(biāo)準(zhǔn)證辨證標(biāo)準(zhǔn)陰虛證形質(zhì)減少1項(xiàng)，或虛證+紅、熱、動(dòng)1項(xiàng)或以上偏陰虛證形質(zhì)減少1項(xiàng)，或虛證+紅、熱、動(dòng)1項(xiàng)或以上，權(quán)重分值低陰虛火旺證陰虛證+火征，紅、熱、動(dòng)分值高陽虛證虛證+（寒1項(xiàng)或以上，或+遲、淡2項(xiàng)或以上）偏陽虛證虛證+（寒1項(xiàng)或以上，或+遲、淡2項(xiàng)或以上，權(quán)重分值低）陰陽兩虛證虛證分值高（有別于氣虛），或陽虛證+陰虛證1項(xiàng)或以上氣虛證遲、虛證權(quán)重分值低氣偏虛證遲、虛

33、證權(quán)重分值更低血虛證淡+可能的失血現(xiàn)象血偏虛證淡+可能的失血現(xiàn)象，權(quán)重分值低氣血兩虛證氣虛+血虛證 （3）部分病邪的辨證標(biāo)準(zhǔn) （4）五臟證候的辨證標(biāo)準(zhǔn) 表6 部分病邪的辨證標(biāo)準(zhǔn)病邪辨證標(biāo)準(zhǔn)濕證濕類證候1項(xiàng)或以上濕熱證濕證+熱證，或肛門紅腫充血，1項(xiàng)或以上毒（熱毒）毒類證候1項(xiàng)或以上血瘀證青紫、瘀1項(xiàng)或以上表7 五臟證候的辨證標(biāo)準(zhǔn)五臟辨證標(biāo)準(zhǔn)心表4-6證候+心定位表現(xiàn)1項(xiàng)或以上肝表4-6證候+肝定位表現(xiàn)1項(xiàng)或以上脾表4-6證候+脾定位表現(xiàn)1項(xiàng)或以上肺表4-6證候+肺定位表現(xiàn)1項(xiàng)或以上腎表4-6證候+腎定位表現(xiàn)1項(xiàng)或以上目前，我們已經(jīng)編寫出方法學(xué)專著：辨證論治實(shí)驗(yàn)方法學(xué)實(shí)驗(yàn)小鼠診法與辨證 九、發(fā)表

34、的學(xué)術(shù)論文 1. 方法學(xué)學(xué)術(shù)論文 1 方肇勤, 潘自強(qiáng), 付曉伶, 等. 小鼠四診采集項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)的建議. 中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 11(9): 692-694 2 方肇勤. 昆明種小鼠辨證標(biāo)準(zhǔn)的建議. 全國辨證論治研討會(huì)(上海)2004,3. 3 方肇勤,潘志強(qiáng),湯偉昌,等. 小鼠四診工作站構(gòu)建與操作標(biāo)準(zhǔn). 上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 20(1) 4 潘自強(qiáng), 方肇勤, 闞衛(wèi)兵, 等. 正常昆明種小鼠后爪圖譜及RGB值. 上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2003,17(3):46-47 5 潘自強(qiáng), 方肇勤, 闞衛(wèi)兵, 等. 荷瘤小鼠后爪部分證的標(biāo)志圖譜. 中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志, 2004, 10(2): 27-29 6 潘自強(qiáng), 方肇勤, 付曉伶, 等. 荷瘤小鼠若干典型證的演變及其后爪圖像特征. 上