新城疫疫苗的研究進(jìn)展(1).docx

1、新城疫疫苗的研究進(jìn)展楊煦I劉玉芬-劉懷然3(哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150025；2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物功能基因逝點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)浣哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/禽傳染病研究室)摘要嫁述了常規(guī)疫苗和基因工程疫苗2種類型新城疫疫苗的研完進(jìn)展，分析制城疫疫苗的發(fā)展方向，以促進(jìn)新城疫疫苗的璘充。關(guān)詞新戚疫；病斗；疫苗；研完進(jìn)展中圖分類號(hào)S851文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文童編號(hào)1007-5739(2012)02-0325-03ResearchProgressesofNewcastleDiseaseVaccineYANGXu1LIUYu-fen1LH)Huai-ran3(1

2、CollegeofLifeScienceandTechnology,HarbinNormalUniversity,HarbinHeilongjiang150025;2KeyLaboratoryofBiologicalFunctionalGenes,NortheastAgriculturalUniversity;3DivisionofAvianInfectiousDiseases,StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology,HarbinVeterinaryResearchInstitute,CAAS)AbstractResearchprogresses

3、ofncwcastlediseasevaccinewereoverviewed.includingconventionalvaccineandgeneticengineeringvaccine.Thedevelopmentdirectionofnewcastlediseasevaccinewasanalyzed.Itcouldpromotethestudyofnewcastlediseasevaccine.Keywordsnewcastledisease；virus；vaccine；researchprogresses新城疫病毒屬于副粘病毒科副粘病毒屬，為有囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒叫其基因組編

4、碼6個(gè)蛋白:RNA依賴的RNA聚合酶。基因）、血凝素神經(jīng)氨酸酶（HN）、融合蛋白（P基因）、基質(zhì)蛋白（M基因）、磷蛋白（P基因）、核蛋白（作者簡(jiǎn)介楊威（1987），女，*龍江哈爾濱人，在讀碩士研克生。研究方佝：動(dòng)物生物化學(xué)與分子生物學(xué)。通訊作者收稿日期2011-12-09基因）囚。其中F蛋白有使病毒囊膜與宿主細(xì)胞融合進(jìn)而導(dǎo)致病毒傳入宿主細(xì)胞膜的作用，是決定病毒毒力的關(guān)鍵因子。而HN蛋白是NDV的另一種重要的致病因子，它的主要作用是參與病毒粒子與細(xì)胞受體的最初吸附以及破壞這種吸附作用間。此外,HN蛋白還可使F蛋白充分接近受體而發(fā)生病毒與細(xì)胞膜的融合而致病。因此,NDV表面的HN-F糖蛋白在病毒的

5、傳染性和治病性上起到至關(guān)重要的作用，許多新城疫基因工程疫苗的研制都依賴于F、HN蛋白。新城疫（ND）是一種侵害禽類的急性高度接觸性傳染病，由新城疫病毒引起。自1926年首次在印度尼西亞的爪哇島和英國(guó)的新城暴發(fā)以來(lái)，至今已有4次世界范圍內(nèi)的大流行，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。NDV基因型已經(jīng)發(fā)生了很大的差異（I一XI）Z。雖然現(xiàn)有的滅活苗和弱毒苗能獲得較好的免疫效果，但是近年來(lái)由強(qiáng)毒引起的非典型ND在免疫雞群中時(shí)有發(fā)生，因而研究出安全、高效的新型疫苗一直備受有關(guān)學(xué)者的關(guān)注。目前，亞單位疫苗、活載體疫苗、新城疫病毒載體疫苗、DNA疫苗等都被廣泛研究。1常規(guī)疫苗1.1滅活苗滅活苗一般是由滅活的感染

6、性尿囊液與載體佐劑混合后制得，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，使抗體以較高的水平在體內(nèi)持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，且易于儲(chǔ)存。目前，廣泛使用的滅活苗為油乳劑滅活苗，多用Ulster2e、Bl、LaSota及Rokin等作毒種來(lái)生產(chǎn)，這些毒株在雞胚中均能大量增殖，多用于二聯(lián)苗或多聯(lián)疫苗的制造，使用多聯(lián)苗可以節(jié)省勞動(dòng)力，免疫效力受母源抗體影響較小，免疫后副作用小。但由于注射劑量和疫苗對(duì)免疫效果有很大的影響，且滅活疫苗中需要添加AvridineJSCOMS弗氏完全佐劑、礦物油、動(dòng)植物油、脂質(zhì)體等佐劑，導(dǎo)致免疫成本大大提高。同時(shí)，接種滅活苗的機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)病毒的特異性抗體，干擾臨床檢測(cè)檢疫以及流行病學(xué)調(diào)查，這是以滅活

7、苗防治ND的最大障礙。L2活疫苗活疫苗一般由感染胚尿囊液凍干而成，通過(guò)飲水、進(jìn)食、噴霧、氣霧等途徑大規(guī)模免疫雞群。通常NDV活疫苗分為緩發(fā)型和中發(fā)型。B1株和Lasota株是天然弱毒株，幾乎無(wú)致病性，可作為緩發(fā)型疫苗，經(jīng)滴鼻、點(diǎn)眼、飲水、氣霧等途徑接種免疫，保護(hù)效果較好。而H株、Roakin株等屬中發(fā)型的疫苗，由于毒力較強(qiáng)，只能用于二次免疫。也有用CS2株、V4株等作活疫苗的，也能達(dá)到良好的免疫效果?；畈《靖腥灸艽碳C(jī)體產(chǎn)生局部免疫,免疫后可較快得到保護(hù),一般接種后A5d就能產(chǎn)生抗體，抗體一般可維持20-30do主要產(chǎn)生黏膜抗體（IgA）,對(duì)機(jī)體呼吸道、消化道等局部獨(dú)膜免疫具有重要作用，是阻止

8、外界病毒入侵的屏障。活疫苗易于大規(guī)模使用,較便宜，且疫苗毒還可以使免疫雞傳給未免疫雞，但由于環(huán)境條件及并發(fā)感染,可能引發(fā)疾病.母源抗體對(duì)初次免疫影響較大。此外，若在生產(chǎn)過(guò)程中控制不當(dāng)，活疫苗易被滅活、污染，有毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)。因此，為了使NDV得到更好的控制，人們又開(kāi)發(fā)了其他類型的疫苗。2基因工程疫苗2.1亞單位疫苗利用重組DNA技術(shù)輔以佐劑將NDV保護(hù)性抗原基因在高效的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)而制成亞單位疫苗。目前，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是研究ND亞單位疫苗的主要常用工具oNagyetal分別利用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)了NDV的F及HN蛋白，對(duì)雛雞進(jìn)行免疫。結(jié)果表明，表達(dá)的F和HN蛋白能夠產(chǎn)生很好的免疫保護(hù)作用。丁

9、壯等何應(yīng)用該系統(tǒng)表達(dá)NDV四平和長(zhǎng)春2個(gè)分離株的HN,用NDV強(qiáng)毒攻毒后，分別達(dá)到65%（四平株）和100%（長(zhǎng)春株）的保護(hù)率。聞曉波等5構(gòu)建含有NDV的M、NP、F、HN4個(gè)基因的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體，并得到了共表達(dá)的NDV的M、NP、F、HN4個(gè)蛋白，為進(jìn)一步研究亞單位疫苗及NDV結(jié)構(gòu)蛋白之間的相互作用奠定了基礎(chǔ)。Kapczynskiet訕同用處理NDV的不具感染性的病毒HN和F蛋白免疫雞，經(jīng)驗(yàn)證這些病毒亞單位成分具有良好的免疫保護(hù)效果。亞單位疫苗具有安全性高、穩(wěn)定性好、運(yùn)輸方便、批量生產(chǎn)容易的優(yōu)點(diǎn)，是ND疫苗未來(lái)發(fā)展的一個(gè)重要方向，但是由于生產(chǎn)成本高，價(jià)格受限，很難真正用于疫苗生產(chǎn)，除非改進(jìn)

10、表達(dá)技術(shù)，顯著降低成本。2.2新城疫病毒組活載體疫苗近年來(lái)，采用以病毒或細(xì)菌為載體研究新城疫活疫苗的技術(shù)路線被多數(shù)學(xué)者主張。將NDVF和HN基因在動(dòng)物病毒弱毒或無(wú)毒株(如腺病毒、痘苗病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒等)等載體上進(jìn)行表達(dá),均已獲得成功。目前，痘病毒、腺病毒和艷疹病毒等都是較為理想的病毒載體。1990年Tayloretal醐將新城疫病毒Texas株F基因插入禽痘病毒中，在培養(yǎng)細(xì)胞中得以表達(dá)，經(jīng)糖基化修飾后切割成F1和F2,通過(guò)點(diǎn)眼或口服重組病毒可獲得部分攻毒保護(hù)，而通過(guò)肌肉注射或翅下刺種，免疫1次就可獲得完全攻毒保護(hù)oMorganet將NDV的F、HN基因分別克隆入火雞抱疹病毒的復(fù)制非必需區(qū)(US

11、2),利用Rous肉瘤病毒LTR的強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建重組病毒，用其腹腔接種SPF白來(lái)航雞，第28天后肌肉注射攻毒，表達(dá)F蛋白的重組病毒的保護(hù)率高達(dá)90%。曹殿軍等回將NDVHN基因在重組雞痘病毒中表達(dá)，以NDV強(qiáng)毒株F48E9攻毒發(fā)現(xiàn),接種重組病毒UTpfu/只時(shí)，保護(hù)力可達(dá)80%,而KTpfu/只時(shí)，保護(hù)力可達(dá)60%。說(shuō)明該重組病毒對(duì)雛雞具有一定的保護(hù)作用，且該保護(hù)作用與接種劑量有一定的相關(guān)性。梁雪芽等回將含NDVF48E9株融合蛋白(F)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3-F的減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌ZJ111株(ZJ111/PCDNA3-F)口服接種小鼠和雛雞，表明利用該減毒株作為載體傳遞DNA疫苗具有

12、相對(duì)安全性。用ZJ111/PCDNA3-F以108cfu/只免疫雛雞，2周后二免，二免后4周攻擊致死劑量的強(qiáng)毒株F48E9。結(jié)果表明：重組ZJ111/PCDNA3-F菌株不僅能誘導(dǎo)法氏囊B淋巴細(xì)胞和胸腺T淋巴細(xì)胞的增值反應(yīng)，而且能誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生NDV抗體，對(duì)強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)率高于PCDNA3-F裸質(zhì)粒DNA疫苗注射免疫組(50.00%),達(dá)66.7%?；钶d體疫苗是當(dāng)今及未來(lái)疫苗開(kāi)發(fā)與研制的主要方向之一，其不僅具有傳統(tǒng)疫苗的許多優(yōu)點(diǎn)，而且還為多價(jià)苗及聯(lián)苗的生產(chǎn)開(kāi)辟了新道路。23新城疫病毒截體疫苗隨著反向遺傳學(xué)的發(fā)展，重組NDV載體巳成為當(dāng)今病毒載體系統(tǒng)研究的熱點(diǎn)之一。基于NDV可以誘導(dǎo)機(jī)體的體液免疫

13、和細(xì)胞免疫能在體內(nèi)增值,并長(zhǎng)期表達(dá)抗原基因，使機(jī)體得到較強(qiáng)且較持久的免疫保護(hù)，且是一種RNA病毒，不會(huì)與宿主基因組整合，安全性較高，被學(xué)者們認(rèn)為是很好的疫苗載體。Zhaoetal網(wǎng)分別在NDV強(qiáng)毒株和弱毒株的4個(gè)不同基因間區(qū)域插入外源基因，結(jié)果表明:NDV作為疫苗載體是完全可行的，因?yàn)椴《镜膹?fù)制效率和滴度并沒(méi)有受到影響。Peetemet應(yīng)叫以含禽副粘病毒4型基因的雜合體HN基因取代NDVHN基因，構(gòu)建的嵌合體病毒作為活疫苗可以產(chǎn)生對(duì)NDV的免疫保護(hù)以及對(duì)F蛋白的中和抗體,不僅能夠抵制致死劑量NDV的攻擊，而且根據(jù)其對(duì)HN所產(chǎn)生的抗體及血清分析即可區(qū)別于野生毒感染。2.4核酸疫苗核酸疫苗最早是由

14、Wolffetal的于1990年發(fā)現(xiàn)。他們注意到給小鼠直接肌肉注射質(zhì)粒DNA,質(zhì)粒及純化的DNA或RNA重組表達(dá)載體，可使載體上的基因在局部肌肉細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，這種表達(dá)可持續(xù)數(shù)日甚至終身，且沒(méi)有檢出注射的外源核酸與宿主染色體的混合，之后William,Tangetal也證實(shí)了這點(diǎn)。1994年其被世界衛(wèi)生組織(WHO)正式統(tǒng)一命名為核酸疫苗(nucleicacidvaccine)o它是指把外源基因克隆到真核質(zhì)粒表達(dá)載體上，然后將重組的質(zhì)粒DNA直接注射到動(dòng)物體內(nèi)，使外源基因通過(guò)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白，刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。NDVDNA疫苗是將病毒的HN

15、或F基因通過(guò)表達(dá)質(zhì)粒DNA導(dǎo)入機(jī)體，產(chǎn)生針對(duì)這些抗原的特異性免疫反應(yīng)。對(duì)于DNA疫苗來(lái)說(shuō)，載體質(zhì)粒要能在大腸桿菌中高拷貝地?cái)U(kuò)增，且在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)能高效表達(dá)，但不能復(fù)制，也不能含有向宿主細(xì)胞基因組內(nèi)整合的序列。目前，常用的是含有巨噬細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動(dòng)子的載體質(zhì)粒oSakaguchimetal闡于1996年用小雞作模型進(jìn)行包含新城疫F基因的質(zhì)粒DNA免疫雞試驗(yàn)，結(jié)果表明：2/5用線性的F基因質(zhì)粒免疫雞產(chǎn)生了特異抗體，新城疫病毒DNA疫苗研究由此開(kāi)始。陳吉祥等阿用表面活性劑CATB/DOPE脂質(zhì)體包裹DNVHN基因的真核表達(dá)質(zhì)粒PcHNM免疫5周齡雛雞，免疫1周后，.即可在雞血清中測(cè)出特異性H

16、I抗體，但裸DNA免疫HI抗體水平比脂質(zhì)體DNA免疫組要低。最后用強(qiáng)毒攻擊后，CTAB脂質(zhì)體DNA免疫組保護(hù)率能達(dá)到100%,而裸DNA只有81.82%,表明該質(zhì)粒DNA被脂質(zhì)體包裹后，提高了特異性抗體產(chǎn)生能力，加強(qiáng)了對(duì)強(qiáng)毒的抵抗力oYinetal曜究表明，利用r-干擾素和左旋咪哩2種佐劑協(xié)同作用制備的DNA疫苗，比單用DNA疫苗免疫效果更好,對(duì)試驗(yàn)雞抵抗致死劑最NDV的保護(hù)率達(dá)80%。新城疫DNA疫苗具有免疫效果好，不存在散毒和毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)；免疫應(yīng)答持久；方法簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉；可加工成干燥的小粒，便于貯藏和運(yùn)輸。但是目前核酸疫苗的安全性、作用機(jī)理及如何提高免疫水平仍需進(jìn)一步研究。3研究展望新

17、城疫是家禽傳染性疾病中危害最嚴(yán)重的疫病之一，對(duì)世界養(yǎng)食業(yè)危害極大，因此新城奇疫苗的開(kāi)發(fā)和研制一直以來(lái)都是許多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。目前，世界上常用疫苗為滅活苗和弱毒苗,它們?cè)诤艽蟪潭壬峡刂屏诵鲁且叩穆?，但也存在不足之處?；钜呙缈赡芤l(fā)疾病，有毒力返強(qiáng)的可能。油乳劑滅活苗不僅生產(chǎn)成本高，且不利于對(duì)疾病的監(jiān)控。隨著對(duì)NDV分子生物學(xué)特性的深入了解，基因工程疫苗越來(lái)越受人們的關(guān)注，但目前基因工程疫苗的研制仍存在一些問(wèn)題。亞單位疫苗免疫周期短，成本較高;新城疫活載體疫苗和病毒載體疫苗在免疫效果上雖有很大突破，但對(duì)母源抗體的干擾仍有待完善;核酸疫苗尚處于起始階段之外，作用機(jī)理及生物安全性等問(wèn)題都有待于提高。

18、因此，如何克服這些缺點(diǎn),得到安全性高、免疫效果好、易于生產(chǎn)和成本低廉的新城疫基因工程疫苗是目前研究的重點(diǎn)。4參考文獻(xiàn)ALEXANDERDJ.Newcastlediseaseandotheravianparamyxovirusesfj.RevSciTech,2000,19(2)：443-462.1 KATTENBELTJA,STEVENSMP,GOULDARSequencevariantionintheNewcastlediseasevirusgenomeJJ.VirusResearch,2006,116(3)：168-184.2 聞曉波，閆麗輝,曹殿軍，等.新城疫病毒F48E9株M,NP,F和

19、HN基因的真核表達(dá)J.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2006,36(6):429-433.3 HERCZEGJ.WEHMANNE,BRAGGRR,etal.Twonovelgeneticgroups(VIband)responsibleforrecentNewcastlediseaseoutbreaksinSouthernAfrica,one(VDb)ofwhichreachedSouthernEuropeJ.ArchVirol,1999,144(11)：2087-2099.4 LIUXP,WANHQ,NIXX,etal.Pathotypicalandgenotypicalcharacteriza-Tiono

20、fstrainsofNewcastlediseasevirusisolatedfromoutbreaksinchickenandgoo-seflocksinsomeregionsofChinaduring1985-2001J.ArchVirol,2003,148(7):1387-1403.5 NAGY,DERBYSHIREBB.DOBOSP,etal.CloningandexpressionofNDVhemagglutinin-neuraminidasecDNAinabaculovirusexpressionvectorsystem(J.Virology,1990,176(2)：426-438

21、.6 丁壯，金寧一，王興龍，等.雞新城疫病毒HN基因亞單位疫苗誘導(dǎo)免疫保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究J.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2002,23(1)：49-51.7 KAPCZYNSKIDR.TUMPEYTM.DevelopmentofavirosomevaccineforNewcastlediseasevini(J.AvianDis,2003,4(73):578-587.8 TAYLORJ.EDBAUERC,REY-SENELONGE,etal.Newcastledisease(上接第322頁(yè))食量。二是確保飼料質(zhì)量。飼料以高蛋白、高消化率、高適口性的全價(jià)飼料為宜，不宜飼喂懷孕母豬的飼料。三是確保母豬分娩后能盡早吃足

22、，忌長(zhǎng)時(shí)間控制母豬的飼料fit。四是確保斷奶前不減料。為了促進(jìn)母豬盡快發(fā)情和多排卵，斷奶后繼續(xù)以泌乳料飼喂母豬，并且不控制其采食量。五是確保飲用水干凈、充足。高溫季節(jié)，要求一次性對(duì)仔豬進(jìn)行斷奶。當(dāng)仔豬吃補(bǔ)料超過(guò)600g,體重超過(guò)7kg,即可順利進(jìn)行斷奶叫仔豬太早斷奶，會(huì)影響其成活率；太晚斷奶，又會(huì)降低(上接第323頁(yè))蛹繭、潮繭。特別要杜絕收購(gòu)人情繭叫蠶繭既烘部門(mén)要對(duì)當(dāng)?shù)匦Q繭生產(chǎn)情況進(jìn)行全面了解，收購(gòu)前要至足人員、配齊用具、調(diào)試好設(shè)備。蠶繭烘干過(guò)程中，必須嚴(yán)格按照烘繭標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)規(guī)程正確操作，做到適溫烘繭，防止高溫急烘或低溫長(zhǎng)烘，不烘過(guò)老繭和過(guò)嫩繭，要求適干叫.貯藏時(shí)，干繭首先選擇標(biāo)準(zhǔn)的庫(kù)房，干

23、繭不打熱包，堆放整齊。定人保管，定時(shí)翻包，開(kāi)窗換氣，防止發(fā)生霉變和鼠害。virusfusionproteinexpressedinafowlpoxvirusrecombinantconferepro-tectioninchickeJJVirol,1990,64(4):1441-1450.9 MORGANRW.GELBJ.SCHREURSCS,etal.ProtecUonofchickensfromNewcastleandMarksdiseasewitharecombiantheip-scrivusofturkeys*vaccineexpressingtheNewcastlediseasevir

24、usfusionproteinJ.AvianDisease,1992(36):858-870.10 曹殿軍，劉惠莉，王莉林，等.新城疫病毒HN基因在重組雞痘病毒中的表達(dá)及其保護(hù)性的研究中國(guó)免疫學(xué)雜志,1998,14(1)：61-64.11 梁雪芽，方維煥,江玲麗.雞新城疫口服DNA疫苗的安全性、穩(wěn)定性與免疫效力JJ.生物工程學(xué)報(bào),2003,19(1)：24-28.12 ZHAOH,BENP.PECTERSH,etal.RecombinantNewcastlediseasevirusasaviralvector：effectofgenomiclocationofforeigngeneongene

25、expressionandvirusrelicalionJJGenVirol,2003,84(4)：781-788.13 PEETERSBPH.DELEEUW0S.KOCHG.etal.RescueofNewcastlediseasevirusfromclonedCdna:EvidencethatcleavabilityofthefusionproteinisamajordeterminantforvirulenceJ).JournalofVirology,1999,73(6):5001-5009.14 WOLFFJA.MALONERW,WILLIAMSP.etal.Directgenetra

26、nsferintomousemuscleinvivo(J5cience,1990,247(4949):1465-1468.15 SAKAGUCHIM,NAKAMURAH.SONODAK,etal.ProtectionofchickenafromNewcastlediseasebyvaccinationwithalinearplasmidDNAexpressingtheFproteinofNewcastlediseaseviruesJ.Vaccine,1997(14):742-752.16 陳吉祥，藤飛群,CTAB脂質(zhì)體介導(dǎo)雞新城疫病毒核酸免疫研究平J.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2001,22(1):41-43.17 YINJ.JINH.YANGF.etal.SynergisticeffectsofadjuvantsinterferongammaandlevamisolonDNAvaccinationagainstinfectionwithNewcastlediseasevirus(J.ViralInununol,2007,20(2)：288-299.+母豬繁殖力。因此，農(nóng)村養(yǎng)豬時(shí)仔豬奶斷奶時(shí)間以28日齡為宜。8參考文獻(xiàn)統(tǒng)崇鵬，毛婭卿，戴旭.提高母豬生殖力