用射線照射的B7-1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行腫瘤疫苗的研究.docx

1、用射線照射的B7-1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行腫瘤疫苗的研究劉巖王曉民徐萬(wàn)海【摘要】目的探討用放射的B71轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行腫瘤疫苗療法的效果。方法將重組人B7-1基因其核表達(dá)載體導(dǎo)入QXK-1腎細(xì)胞瘤細(xì)胞，利用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞治療觀察其抗腫瘤效果。結(jié)果轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的腫瘤原性較CAKl/Wt、CAK-l/pCDNA3組明顯降低(PV0.001)。同時(shí)免疫原性明顯增強(qiáng)，以Co照射的CAK-1/I571細(xì)胞免疫后.小鼠體內(nèi)誘發(fā)了抗CAK-1/Wt的系統(tǒng)性、保護(hù)性免疫。用“'Cq滅活的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作為痛苗進(jìn)行實(shí)騷性治療.能夠延K小鼠的生存時(shí)間，減慢腫瘤的生K速度XAK-1/B7-1的應(yīng)用提高了腫瘤治療效果(PV0.0

2、1)。結(jié)論放射的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及其表達(dá)的R7細(xì)胞因了可以有效地激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答.B71表達(dá)腫瘤細(xì)胞應(yīng)用可以成為一種很有前景的腫瘤疫苗。關(guān)鍵詞B7-1癌疫苗基因治療中圖分類號(hào)R394.21文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼AStudyofCancerVaccinewithIrradiatedB7-1TransgenicCellsLIUYan,WANGXiao-min.XUWan-hai»etal.DepartmentofUrology«TheFourthAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity.HarbinHeilongjiang.ChinaAbst

3、ractObjectiveToinvestigatethesynergisticallyeffectofirradiatedB7Ttransfcclantcellsascancervaccine.MethodsTheeukaryoticexpressionvectorencodingB7-1genewastransfectedintoCAK-1renalcellcarcinomacells.Thecellswereusedtotreatthemiceandthethera|>euticeffectswereassessed.ResultsIncontrasttothemiceinCAK1

4、/WtorC'AK-l/pCDNA3groups*thetumorigenicityofCAK-l/B-7transfectantdecreased(P<0.()()1).Immunizationofmicewith“CoirradiateCAK-1/B7-1tumorcellsshowedsignificantsystematicprotectiveeffectsagainstthesequencerc-challengeofCAK-1/Wt.Vaccinationwith">CoirradiatedCAK1/B-7cellsdelayedtheoccurren

5、ceoftumorandprolongedthesurvivalperiodofmicewithtumor.ThevaccineofCAK-I/B71inducedanenhancedtherapeuticeffect(PVO.()1).ConclusionIrradiatedtransgeniccellscouldenhancetheantitumorimmunityofthehost.VaccinesofCAK1/B7-1canimproveimmunityofhostandarepromisingcancervaccines.【Keywordsj137-1；Cancervaccine；G

6、enetherapy目前對(duì)腎腫瘤的免疫治療有使用里組白細(xì)胞介素-2或白細(xì)胞介素2與干擾素-a同時(shí)使用，以及輸入經(jīng)體外擴(kuò)增的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞或日體瘤細(xì)胞疫苗的方法，但療效都不甚理想，其主要原因在于腫瘤抗原進(jìn)入體內(nèi)后不能被有效地提呈。腫瘤疫苗與傳統(tǒng)疫苗在概念上不同，它主要不是用于腫瘤的預(yù)防，而是通過(guò)瘤苗的接種刺激機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答來(lái)治療腫瘤。由于人腫瘤相關(guān)抗原的免疫原性很弱，不足以有效地刺激機(jī)體的免疫應(yīng)答，因此單純用自身或同種腫瘤細(xì)胞作瘤苗治療腫瘤的效果不好。B7因子主要存在于活化的B細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞表面。在通常性況下，腫瘤細(xì)胞合成的胞內(nèi)抗原經(jīng)胞內(nèi)降解、處理后,形成的腫瘤肽抗原與MHC1類分子

7、結(jié)合后，共表達(dá)于痛細(xì)胞表面。其表面的肽抗原-MHCI類分子復(fù)合物被TC細(xì)胞識(shí)別，同時(shí)其表面B7因子也與TC細(xì)胞的CD28分子結(jié)合，這樣TC細(xì)胞就可被活化，從而殺傷帶有該肽抗原的腫瘤細(xì)胞。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞由于沒(méi)有B7因子，因此腫瘤細(xì)胞雖具有肽抗原與MHCI類分子的匆合物，但由于不能提供第二信號(hào)，所以不能活化TC細(xì)胞本研究旨在利用B7基因轉(zhuǎn)染腎腫瘤細(xì)胞.使之表達(dá)膜B7因子，形成瘤苗，接種到體內(nèi)后直接活化TC細(xì)胞，誘導(dǎo)其殺傷腎臟腫瘤，從而為腎臟腫瘤的臨床治療提供新的方法和思路。1材料與方法1.1主要試劑Lipofectamine200()轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司；RPM11640、DMEM

8、培養(yǎng)液、胎牛血清和G418均收精日期：2008-11-21基金項(xiàng)目：黑龍江省衛(wèi)生廳科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目(2006-234)作者單位：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院泌尿外科(哈爾濱購(gòu)自Gibco公司。含人B7-1cDNA完整開(kāi)放閱讀框架的真核表達(dá)載體PCDNA3-B7-1由研究室自行構(gòu)建。1.2細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物CAK-1腎癌細(xì)胞系從美國(guó)ATCC獲得，本室常規(guī)培養(yǎng)。C57BL/6小鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院.雌性,68周齡。1.3 方法1.3.1CAK-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染與克隆取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAK-1腎癌細(xì)胞接種于6孔板，每孔5xW5個(gè)，待細(xì)胞融合率達(dá)到9()%時(shí)，分別加入用轉(zhuǎn)染試劑Li-pofenctamine20(X

9、)包被的pCDNA3-B-7重組載體和PCDNA3空載體，培養(yǎng)48h后.加G418(600Mg/ml)繼續(xù)篩選培養(yǎng)，12天后.分別挑去抗藥克隆，用RT-PCR和Westernblot檢測(cè)B7-1表達(dá)的表達(dá)情況.得到轉(zhuǎn)B7-1基因和陰性對(duì)照的CAK-1腎癌細(xì)胞系。1.3.2細(xì)胞的放射處理上述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞依實(shí)驗(yàn)要求用6孔培養(yǎng)板培養(yǎng).實(shí)驗(yàn)前8h用Co進(jìn)行亞致死量照射(5000Rad),經(jīng)檢測(cè)，此時(shí)細(xì)胞的存活率>95%,具有正常表達(dá)及分泌能力。1.3.3 小鼠成瘤試驗(yàn)分別取非照射的1x107CAK-l/WuCAK-l/pCDNA3XAK-l/B7-1細(xì)胞接種C57BL/6小鼠背部皮下，每隔2天觀察

10、并記錄結(jié)節(jié)形成時(shí)間、生長(zhǎng)速度及存活時(shí)間。每組5只，結(jié)節(jié)大小以長(zhǎng)徑X短徑計(jì)算。1.3.4轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的免疫保護(hù)試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分組分別注射經(jīng)SC。照射的CAK1/Wt、CAK-1/pCD-NA3.CAK-1/B7-1細(xì)胞5X1()1()天后皮下接種非照射的CAK-1/Wt細(xì)胞,觀察腫瘤結(jié)節(jié)的生長(zhǎng)情況及小鼠的存活時(shí)間。1.3.5轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的試驗(yàn)性治療以非照射的CAK-1/Wt細(xì)胞1X10$皮下接種C57BL/6小鼠，接種后第3、6、9天以的Co照射的2.5x伸CAK-1/Wt細(xì)胞分別和2.5X10'各種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞1：1混合，再接種對(duì)側(cè)皮下,觀察腫瘤結(jié)節(jié)的生長(zhǎng)情況及小鼠的存活期。1.3.6統(tǒng)計(jì)分析

11、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(x±5)表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理.組間比較采用t檢驗(yàn),PV0.05為具有顯著性差異。2結(jié)果2.1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株的建立對(duì)轉(zhuǎn)染后的CAK-1細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR和Westernblot分析顯示，與pCDNA3空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞相比，pCDNA3-B7載體轉(zhuǎn)染的CAK-1細(xì)胞中B7基因無(wú)論是mRNA水平還是蛋白水平均有明顯升高(圖1：A.RT-PCR檢測(cè)B7基因轉(zhuǎn)錄本的水平；B.Westernblot檢測(cè)B7蛋白的表達(dá)情況)。ABpCDNA3pCDNA-B-7pCDNA3pCDNA-B-7圖1PCDNA3-B7載體轉(zhuǎn)染CAK-1細(xì)胞后B7基因

12、的袤達(dá)檢測(cè)Figure1ExpressionpatternofB-7geneaftertransfectingpCDNA3B-7vectorintoCAK-1cells2.2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的腫瘤原性用1x偵個(gè)非照射的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞CAK-1/B7-1與CAK-1/Wt、CAK-1/pCDNA3腫瘤細(xì)胞接種小鼠皮F，CAK-1/B7-1與CAK-1/Wt.CAK-1/pCDNA3細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)狀況及存活期明顯不同腫瘤結(jié)節(jié)的檢出時(shí)間、生長(zhǎng)速度及存活期差異無(wú)顯著性。而CAK-1/B7-1細(xì)胞組腫瘤的形成時(shí)間明顯推遲，生長(zhǎng)速度明顯減慢，存活期也顯著延長(zhǎng)，見(jiàn)表1。>1CAK-1/B7-1轉(zhuǎn)基因痛苗的

13、致瘤效應(yīng)明顯減弱(x±5)Table1ReducedtumorigenesiscapacityofCAK-1/B71transfcctants(t±s)細(xì)胞出瘤鼠/總鼠數(shù)(只)成痛率成瘤時(shí)間平均存活平均瘤2周3周4周6周()(d)時(shí)間(d)體積(cn?CAK-1/Wt(：AK-l/pCDNA3CAK-1ZB7-13/53/55/5-10018.6±4.232.4±5.28.4±2.72/53/55/5-KX)19.3±5.730.0±2.39.1±1.«0/52/52/53/5.40*28.5±

14、1.8"42.0土().0.3.5±U.6,注:CAK-1/B71與其它兩組比校，PV0.012.3轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的免疫保護(hù)作用的CAK-1/Wt和CAK-l/pCDNA3細(xì)胞未能誘導(dǎo)有用5XIO。個(gè)®Co照射處理的CAK1/B7-1與效的保護(hù)性免疫。在14天左右可檢出腫瘤結(jié)節(jié)，存活CAK-1/Wt、CAK-l/pCDNA3腫瘤細(xì)胞作為瘤苗分別期約45天。而經(jīng)CAK1/B7-1細(xì)胞免疫后的小鼠腫免疫C57BL/6小鼠，10天后接種非照射的CAK-1/瘤生長(zhǎng)明顯抑制，觀察期結(jié)束時(shí)仍有3只小鼠未檢出Wt腫瘤細(xì)胞,觀察免疫保護(hù)作用。結(jié)果表明&>Co滅活結(jié)節(jié)，生

15、存時(shí)間顯著延長(zhǎng)(,PV0.(X)1,見(jiàn)表2)。結(jié)果提示轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的免疫原性顯著增強(qiáng)，并能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的抗腫瘤效應(yīng)。表2CAK-1/B7-1轉(zhuǎn)基因痼苗對(duì)野生型CAK-1細(xì)胞可誘導(dǎo)免疫保護(hù)效應(yīng)Table2AntitumorimmunityprotectioninducedbyCAK1/B7-1againstthechallengewithwildtypeofCAK-1細(xì)胞出瘤鼠/總鼠數(shù)(只)2周3周4周6周CAK-1/Wt2/54/55/5-CAK-1/pCDNA32/54/55/5-CAK-1/B711/51/5-2/5*2/5,注:CAK-1/H7-1組與其它兩組比較，PV0.0012.4

16、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的試驗(yàn)性免疫治療用非照射的CAK-1/Wt腫瘤細(xì)胞IX1(),預(yù)先接種C57BL/6小鼠，在3、6、9天用"Co照射的2.5xW5CAK-1/Wt細(xì)胞分別和2.5xIO'各種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞1：1混合，接種于對(duì)側(cè)皮下,觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。在治療實(shí)驗(yàn)中，接種了CAK-1/B7-1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的小鼠腫瘤生長(zhǎng)較對(duì)照組明顯減慢，此治療可明顯推遲腫瘤結(jié)節(jié)檢出時(shí)間，延緩腫瘤的生長(zhǎng)速度，并有效地延長(zhǎng)了荷瘤宿主的存活時(shí)間(,PV0.01),見(jiàn)表3。表3射線照射的轉(zhuǎn)基因痼苗對(duì)野生型CAK-1細(xì)胞致痛的治療作用G±5)Table3TherapeuticeffectonCAK-1/Wtt

17、umorwithirradiatedtransfectantstreatment(x±s)細(xì)胞出痛鼠，總吸數(shù)(只)成痛時(shí)間平均存活平均痛休2周3周4周6周(d)時(shí)間(d)積(cm5)CAK-1/pCDNA3CAK-1/B7-12/53/50/51/55/5-3/53/514.315.731.0+3.525.311.6-45.0±0.0*11.2±2.63.6±1.4-注:組間比較，PV().()13討論大量的研究表明，將某些細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞制成新型的腫瘤疫苗，可以有效的激發(fā)機(jī)體有效的抗腫瘤免疫功能，此種方法已成為腫瘤基因治療的研究熱點(diǎn)。本研究應(yīng)用

18、B7-1轉(zhuǎn)基因修飾的CAK-1腫瘤細(xì)胞既能表達(dá)活化因子B7,同時(shí)又具有所有的腫瘤細(xì)胞抗原,可激發(fā)抗腫瘤免疫。雖然其體內(nèi)的成瘤性降低，但是直接用此種細(xì)胞進(jìn)行治療的危險(xiǎn)性仍然較大(表1)。作者將細(xì)胞經(jīng)"Co照射后，進(jìn)行了免疫保護(hù)試驗(yàn)和治療性實(shí)驗(yàn)，觀察到明顯的抑瘤效果。眾多實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞因子基因在腫瘤局部的持續(xù)表達(dá)可以有效地改變腫瘤細(xì)胞的免疫微環(huán)境,增強(qiáng)腫痛細(xì)胞特異性的抗原提呈，活化CTL細(xì)胞，從而產(chǎn)生抗腫瘤免疫。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)B7基因修飾后的CAK-1細(xì)胞致瘤原性有很大程度的降低.腫瘤生長(zhǎng)潛伏期及荷瘤生存期明顯延長(zhǎng)。在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞作為痛苗用于小鼠免疫接種的實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)明顯的抑瘤效

19、果，荷瘤小鼠無(wú)論是成瘤時(shí)間，還是存活時(shí)間，都比對(duì)照組有顯著的延長(zhǎng)，腫瘤體積也明顯減小,說(shuō)明經(jīng)過(guò)射線照射和基因修飾的腫瘤疫苗能夠有效并且相對(duì)安全的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫。當(dāng)然，作者在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)B7轉(zhuǎn)基因細(xì)胞不能完全消除腫瘤細(xì)胞的致瘤性，說(shuō)明依賴于單一活化因子具有一定的局限性，并不能提供完全的抗原遞呈及活化效應(yīng)，聯(lián)合不同的細(xì)胞因子，產(chǎn)生協(xié)同作用有可能很好的解決這個(gè)問(wèn)題。如IL-2和IL-6等細(xì)胞因子,它們均可激活T細(xì)胞，誘導(dǎo)NK、LAK、CTL細(xì)胞活性，此外JL-2nf以改變T細(xì)胞的異常信號(hào)傳導(dǎo)，而IL-6可以增強(qiáng)細(xì)胞MHC抗原的表達(dá)旭刃。因此由這些細(xì)胞因子基因修飾的腫瘤細(xì)胞可以從多種機(jī)制獲得更好的抗原遞呈及免疫刺激效果。顯然在腫瘤疫苗應(yīng)用中，如何更好地促進(jìn)腫瘤抗原的遞呈,加強(qiáng)生物安全性，仍是腫瘤生物治療研究中一個(gè)難題。參考文獻(xiàn)1 BrunoS.TcncaC,SaverinoI),etal.Apopiosisofsquamouscellsatdifferentstagesofcarcinogenesisfollowing4HPRtrcatmcntJ.Carcinogenesis,2(X)2,23(3)：447-456HanahanD,WeinbergRA.Thehallmarksofc