納米鋁佐劑禽流感疫苗(H5N1)對肉雞外周血中巨噬細胞活性的影響.docxVIP

1、納米鋁佐劑禽流感疫苗（H5N1）對肉雞外周血中III巨噬細胞活性的影響徐愛平械，黎曉敏】，祝明I湛淋麗】，馬金花之（1.西南大學動物科技學院，重慶北暗400716；2.重慶市農業(yè)學校動物科學系，重慶九龍坡401329）中圖分類號：S852.5；S852.65十9.5文獻標識碼：B文章編號：0529-6005（2010）05-0036-03禽流感是多種家禽共患的重大動物疫病，分布廣，傳播快，已被國際動物衛(wèi)生組織（OIE）列為A類傳染病。禽流感曾在世界上許多國家流行，造成的損失數(shù)不勝數(shù)。1997年我國香港地區(qū)暴發(fā)禽流感，不僅造成損失約達8000萬港幣，并發(fā)生H5N1亞型AIV直接感染人并引起死亡的

2、事件。此后，H5N1亞型禽流感感染人并導致死亡的事例在全球范圍內流行，這引起了人們對禽流感病毒的巨大恐慌。更令人擔憂的是其毒力不斷增強、宿主范圍不斷擴大嚴重影響了畜禽業(yè)的健康發(fā)展及人類自身的安全。目前國內外使用的禽流感疫苗主要是滅活油佐劑疫苗K】，但禽流感滅活油佐劑疫苗首免后常常需1015d才能產生有效的免疫保護抗體，而在接種至機體產生有效保護抗體的這段時間動物沒有保護性，一旦發(fā)生禽流感將造成巨大的經濟損失。另外,機體對油乳苗的吸收速度慢，容易在注射部位形成腫塊，這對于生長周期短的肉雞來說，嚴重影響了胴體品質，因此需尋找一種高效旦能誘導機體提前產生抗體的新型疫苗佐劑。納米技術是21世紀的前沿技

3、術，它的推出給這一問題的解決帶來了曙收稿日期：2009-08-25基金項目：重慶市科委攻關課題（2006AC1014）作者簡介：徐愛平（1983），女，助理講師.碩士，從事微生物與動物防疫等研究，E-mail:tracy520927通訊作者:黎曉敏，E-mail：lixiaomin662光。1981年Kreuter等首次將納米材料應用于疫苗佐劑，發(fā)現(xiàn)納米材料用作疫苗佐劑，包裹或表面結合抗原的納米粒子能使蛋白抗原的表面充分暴露,同時使抗原結構更穩(wěn)定，且能促進淋巴集結的攝取，在體內能引起強烈的特異的免疫反應在國內，湯承，呂風林等將納米氫氧化鋁佐劑用于獸醫(yī)疫苗也發(fā)現(xiàn)，納米材料是一種很好的新型免疫佐劑

4、仍句。本課題組采用納米A1（OH）3,通過物理吸附與油乳劑禽流感疫苗中抗原含量相同的禽流感H5抗原（AIVH5）,制作AI納米氫氧化鋁佐劑疫苗，以肉雞為試驗對象，研究其對肉雞的免疫效果。本文就肉雞注射疫苗后巨噬細胞活性進行了檢測和分析。1材料與方法1.1主要材料及儀器A1（OH）3納米顆粒由本課題組研制，經重慶科美藥友納米生物技術開發(fā)有限公司使用激光粒度儀檢測平均粒徑為197.2nm,顆粒近球形，分布均勻；常規(guī)A1（OH）3佐劑由武漢生物制品研究所提供，平均粒徑為1398.4nm；禽流感H5N1亞型油佐劑商品疫苗由廣東永順生物制藥有限公司生產（批號：2008072）；納米鋁和常規(guī)鋁佐劑禽流感H

5、5N1滅活疫苗由本課研究組制作，制苗用滅活病毒尿囊液由廣東永順生物制藥有限公司提供（批號：2008072）,其尿囊液批次、抗原效價及同體積免疫量中的病毒含量與所選對照商品苗相同；綜上所述，SLT-Ue能刺激微血管內皮細胞對IL-8和IL6的分泌增加，刺激相應炎性細胞增殖,促進釋放炎性物質，加重炎癥反應，改變微血管通透性，進而形成水腫，這可能是SLT-fle的致病機理之一；PGL的分泌增加，其維持微血管正常舒縮的功能失調，導致血管通透性發(fā)生改變,進而引起水腫，這可能是SLT-Ue的另一致病機制。參考文獻：，KauscheFM,DeanEA,ArpLI,etal.Anexperimentalmod

6、elforsubclinicaledemadiseaseEscherichiacolientertoxemia）manifestasvascularnecrosisinpicsfJ.AmJVetRes.1992,53(3):281-287.1 Waddell1'E,CoomberBL,GylesCL.Localizationofpotentialbindingsitesfortheedemadiseaseverotoxin(VT2e)inpigsfjj.CanadianJournalofVeterinaryResearch,1998,62(2) ：81-86.2 索占偉，穆祥，許劍琴，

7、等.犬鼠腸黏膜微血管內皮細胞的體外培養(yǎng)J.解剖學報，2005,36(2):214-217.3 鄒敏君，劉肖布.李毅,等.IL-8誘導血管內皮細胞遷移的實驗研究.生物醫(yī)學工程學雜志,2006；23(5)：1013-1016.4 KochAE»PolveriniPJ,KunkelSL,etal.Interleukin-8asamacrophage-derivedmediatorofangiogenesisJScience,1992,258(5089)；1798-1801.5 朱金水，朱勵，余小虎，等.氧化苦參堿對肝纖維患者IL-6JL-8JL10水平影響JI中國免疫學雜志，2003,19

8、(3):191-192.印度墨汁，購于北京市西中化工廠，批號050301;LSZ試劑盒，購于南京建成生物工程研究所（批號20081013）。1.2 試驗動物分組及處理1日齡健康雛雞240只，購于榮昌廣順。按常規(guī)方法免疫及飼養(yǎng)。14日齡時，將試驗動物隨機分為4組，即油乳劑疫苗組（OE）、納米疫苗組（NAHA）,常規(guī)無機鋁組（AHA）,對照組（C）。每組隨機抽取10只抽血測母源抗體。隨后油苗組左側胸肌注射油乳苗0.5mL/只，納米疫苗組左側胸肌注射納米佐劑苗0.5mL/只，常規(guī)無機鋁組左側胸肌注射常規(guī)鋁疫苗0.5mL/只，對照組左側胸肌注射滅菌生理鹽水0.5mL/只。1.3方法3.1巨噬細胞吞噬功

9、能的測定（碳廓清試驗）被試4組雞，每組隨機取5只，分別在21日齡、35日齡、49日齡時，每千克體重翅內靜脈注入1：3稀釋的印度墨汁。.2mL,并立即計時，注入墨汁后2min、10min分別從心臟采血20L,加到2mL的0.1%Na2CO3溶液中搖勻，用721分光光度計于600nm波長處比色，測定光密度OD值（分別用OD2和OD。表示2min和10min時所取血樣的光密度），用0.1%Na2CO3溶液做空白對照。然后將雞處死，取肝臟和脾臟稱重，計算吞噬指數(shù)。吞噬指數(shù)a=（體重/肝臟重+脾臟重）XKl/3說明：a為吞噬指數(shù)；K為碳廓清率，K=lg（ODJ-lgCOD2）/T2-T19OD】、OD2

10、分別為2、10min時取血制得的待測液的透光率；T】、T2為注射印度墨汁后的采血時間。1.3.2 血清溶菌酶（LSZ）含量的測定在21日齡、35日齡、49日齡時每組隨機取5只，采血0.5mL分離血清，將血清與應用菌液反應,測定透光度，計算溶菌前含量，公式為：溶菌酶含量（jug/mg）=測定管透光度一空白管透光度）/（標準管透光度一空白管透光度）。具體方法見試劑盒。1.4數(shù)據(jù)分析與處理所有數(shù)據(jù)均以平均值土標準誤表示。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行方差分析。2結果與分析1巨噬細胞吞噬指數(shù)的測定見表lo表1巨噬細胞吞噬指數(shù)注：表內數(shù)字為X土SE,同列上標小寫字母不相同者差異顯著（P<0.05

11、）；相同者或無字母標記者為差異不顯著（P>0.05）,下表同日齡/組別21d35d49d納米組7.89土0.32b8.86±0.1610.39±0.52油苗組6.32±0.9.04±0.2411.55±0.56常規(guī)鋁組6.67±0.45ab8.83±0.3810.81±0.43對照組6.32±0.878.33±0.2310.28±0.24由表1可知：21日齡時，納米蛆巨噬細胞的吞噬指數(shù)明顯高于其他三組，且與油苗組和對照組差異顯著（PV0.05）；35日齡時，油苗組巨噬細胞的吞噬指

12、數(shù)最高，納米組次之，各組差異均不顯著（P>0.05）；49日齡時，油苗組巨噬細胞的吞噬指數(shù)依然最高，常規(guī)鋁組次之，對照組最低，納米組與其他組差異依然不顯著（P>0.05）o2.2血清LSZ含量的測定見表2。表2血清溶菌酶含量日齡/組別21d35d49d納米組41.17土1.4砂51.86±2.1260.72±1.70油苗組36.03±2.4P53.92±3.7062.46土L91常規(guī)鋁組39.76±0.81ab48.67±3.5860.67±2.47對照組36.55±1.60a47.22±4.

13、4759.26±1.33由表2可知：21日齡時，納米組溶菌酶的含量最高，與油苗組、對照組差異顯著（PV0.05）,與常規(guī)鋁組差異不顯著（F>0.05）；35日齡時，從溶菌酶含量數(shù)值來看，油乳劑組納米組>常規(guī)鋁組>對照組，其他組與納米組差異不顯著（P>0.05）；49日齡時，油苗組溶菌酶的含量仍然最高，其他組與納米組差異依然不顯著（P>0.05）。3討論1本試驗分別在21日齡、35日齡、42日齡測定了肉雞巨噬細胞吞噬指數(shù)以及血清中溶菌酶的含量，發(fā)現(xiàn)21日齡時納米組巨噬細胞的吞噬指數(shù)以及血清溶菌酶的含量均明顯高于其他三組，與油苗組和對照組差異顯著（P<

14、0.05）,其他各組之間差異不顯著（P0.05）,兩項試驗結果基本相同，均表明納米疫苗在肉仔雞生長的早期階段具有促進巨噬細胞活性的作用。丁小波等報道，將氧化鋅納米化，以硫酸鋅為對照，研究其對AA肉雞血液溶菌酶含量的影響，結果顯示，納米氧化鋅能極顯著提高血液中溶菌酶的含量（F<0.01）且其含量約為硫酸鋅的2倍，表明納米氧化鋅能提高機體的非特異性免疫功能李艷芬等研究納米二氧化鈦經器官染毒對大鼠肺巨噬細胞免疫功能的影響，結果顯示，不同粒徑的納米二氧化鈦的暴露均可增強大鼠PAM的吞噬功能，大鼠PAM的NO合成釋放量高于對照組（PV0.05）幻。何萍等用納米鋁佐劑吸附HBsAg,研究其免疫學效應

15、時也觀察到與陰性對照組比較,兩組鋁佐劑對小鼠腹腔巨噬細胞非特異吞噬能力均顯著提高（P<0.05）。采用皮下一次免疫程序，納米鋁佐劑組的。1）62。值略高于常規(guī)鋁佐劑組，結果表明，納米鋁佐劑對提高小鼠腹腔巨噬細胞的非特異吞噬能力強于常規(guī)鋁佐劑（雖然二者無顯著性差異）。本試驗結果與上述報道基本一致，納米鋁佐劑輔佐的禽流感疫苗能提高外周血中巨噬細胞的活性，對非特異性免疫有一定的增強作用。外源激素PMSGHCG對休情期毋拶卵篥組農的影響劉平，呂占軍，李明輝，黃偉平(東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江哈爾濱150030)中圖分類號：S859.79+3；S857.2*2文獻標識碼：B文章編號：0529

16、-6005(2010)05-0038-01貉是珍貴的毛皮動物，也是我國生產的主要毛皮動物之一，由于貉屬季節(jié)性一次發(fā)情動物，如果當年不能配種，則影響母貉的利用率。對此萬國有等曾采用絨毛膜促性腺激素(HCG)使兩年均未發(fā)情收稿日期：2009-0416基金項目：東北農業(yè)大學科學研究基金作者簡介：劉平(1984)，女，碩士,從事臨床獸醫(yī)產科方面的研究9E-mail:liuping20060807通訊作者：呂占軍，E-mail：lzhj_2004YAYAY>«AAYAYAVAY,AyAAYAY3.2巨噬細胞主要參與動物機體的非特異性免疫反應，可以通過吞噬作用殺傷病原微生物和腫瘤細胞，還可

17、釋放一些細胞因子和效應分子來發(fā)揮多種生物學作用，是機體產生特異性免疫應答的基礎和機體維持內環(huán)境穩(wěn)定的重要因素。大多數(shù)抗原經巨噬細胞處理后，免疫原性會大大增強，從而刺激機體產生良好的免疫應答，因此，測定機體巨噬細胞的功能，對了解機體的非特異性免疫功能具有非常重要的意義。目前評價巨噬細胞吞噬能力的指標有以下兩個.用碳廓清試驗測定吞噬細胞的吞噬指數(shù)，以反映機體內單核-巨噬細胞的吞噬活性，巨噬細胞的吞噬能力與其激活程度有關；2.通過測定血清中溶菌酶含量來評價機體吞噬系統(tǒng)功能。據(jù)文獻報道，巨噬細胞的碳粒廓清指數(shù)反映了單核喬噬細胞系統(tǒng)的吞噬功能苻口。顆粒異物經靜脈注射進人血循環(huán)后，迅速為單核吞噬細胞所消除

18、，其中主要被定居在肝和脾臟的巨噬細胞所吞噬。胡福良也報道，若將異物量固定，則自血液中消除的速率可以反映單核吞噬細胞的吞噬功能:戚。血清溶菌酶是由巨噬細胞合成并能迅速釋放到細胞外的一種重要水解前。當血清溶菌酶活力增加時，吞噬細胞活性增加，將導致吞噬細胞產生大量活性物質，這些活性分子對腫瘤細胞、病原體細胞都有強大的殺傷作用，并將進一步調節(jié)機體免疫細胞的功能，介導體液免疫和細胞免疫，促進機體的免疫保護機制高水平的溶菌酶含量表明吞噬細胞處于兒乎活化狀態(tài)以及抗原遞呈作用的增強，從而增強機體的抗菌防御機能。3.3納米粒子一般是指粒徑在1100nm范圍內的超微粒子3】，它具有獨特的生物學性質和載體結構特性。

19、將氫氧化鋁佐劑制備成納米顆粒，具有表面反應活性高、表面活性中心多、吸附能力強等這些及發(fā)情不正常的母貉均發(fā)情配種李志狀等用孕馬血清促性腺激素(PMSG)使繁殖率差空懷率高的母貉均交配，受胎率83.3%。但這有關母貉生殖的研究多在繁殖季節(jié)進行，而本試驗則在母貉非繁殖季節(jié)(12月初)對初產貉肌肉注射不同劑量的PMSG和HCG,以其誘導發(fā)情，誘發(fā)卵泡發(fā)育，為今后母貉人工繁殖技術的普及、人工同期發(fā)情和配種、保存優(yōu)良品種而進行的胚胎移植技術的研究等提供理論基礎。<AyAA»<一A優(yōu)異性質.從而可能吸附更多的抗原，包裹或表面結合抗原的納米粒子能使蛋白抗原的表面充分暴露，同時使抗原結構更穩(wěn)定，且能促進淋巴集結的攝取，在體內能引起強烈的特異的免疫反應，而且納米材料所運載或包裹的抗原正是巨噬細胞和樹突狀細胞的首選吞噬目標，為實現(xiàn)有效的抗原提呈完成了重要一步，也為機體的免疫應答奠定了堅實的物質基礎。參考文獻：I 金寧一.高致病性禽流感的流行及其預防控制J.中國免疫學雜志.2006,22(1):5-12.2_ShaneS.Avianinfluenza.ControlandpreventJPoultryInternational.1998,37(4)：312-315.3