固有腸內(nèi)菌對大腸粘膜特性的活化和修飾--

1、固有腸內(nèi)菌對大腸粘膜特性的活化和修飾-    2004-08-08 16:05:00 關(guān)鍵字：  腸道菌群  大腸粘膜特性包括人類在內(nèi)，在動物腸道內(nèi)的每克內(nèi)容物中，定植著101112的腸道細(xì)菌，其種類也是極其多樣的。如今，雖然將這些復(fù)雜的微生物統(tǒng)稱為腸道菌群，但是，關(guān)于其構(gòu)成以及對機(jī)體的作用，仍有很多不明之處。可是，如同在益生菌等所見到的那樣，在世界范圍內(nèi)，正在嘗試著積極利用常居性腸道細(xì)菌，以期待著闡明腸道菌群的作用。本綜述將介紹把特定的腸道細(xì)菌種單獨(dú)或混合定植于由無菌動物來說的悉生動物的試驗(yàn)成

2、果，進(jìn)而來論述腸道菌群的作用。從比較無菌動物和清潔動物(主要為大鼠)的試驗(yàn)成果來說，腸道菌群的存在，對于宿主動物的生理，尤其對腸道影響很大。這方面雖然受到了啟發(fā)，但是還有許多基本的疑點(diǎn)。例如：疑點(diǎn)1使無菌動物腸粘膜的特征普通化所必需的細(xì)菌種是什么?如上所述，觀測腸內(nèi)容物、糞便中的100種以上的微生物，雖然形成腸道生態(tài)系，但是，腸粘膜的特征向普通動物型變化，是否需要如此之多種多量的腸道細(xì)菌?另外，各菌種的有用率是否相同?(根據(jù)腸粘膜各自的特征，能夠充分地予測到有用的腸道細(xì)菌的菌種是不同的，所以，首先有必要特定腸粘膜的特征。)疑點(diǎn)2腸道菌群對小腸發(fā)揮著怎樣的作用機(jī)理?迄今，在比較和研究無菌動物和普

3、通化動物過程中，絕大多數(shù)認(rèn)為小腸的特征有著明顯的差異。不言而喻，雖然認(rèn)為對小腸的理解較大腸有所進(jìn)展，但是，一般來說，小腸的腸道細(xì)菌的菌種、菌量都少。對小腸粘膜帶來特征變化的腸道細(xì)菌，究竟是存在于小腸內(nèi)的腸道細(xì)菌中呢?還是通過棲息在大腸內(nèi)的大量的腸道細(xì)菌，間接地誘導(dǎo)小腸粘膜的變化呢?疑點(diǎn)3腸道菌群和宿主動物的結(jié)合有特異性嗎?各種動物構(gòu)成了各具特征的腸道菌群，用顯微鏡觀察鼠和人類糞便菌群的涂片標(biāo)本，能很容易地判斷其差異。一般認(rèn)為，兩者的差異主要起因于梭菌屬是否含有梭形菌型(Fusiform type)。但是，從分類學(xué)上，多是以種的標(biāo)準(zhǔn)表示著在腸道菌群不同種動物的構(gòu)成差異。這種情況究竟是暗

4、示了宿主動物和腸道菌群的密切結(jié)合呢?還是反映了食性差異等環(huán)境要因呢?腸道菌群的構(gòu)成及其宿主動物種間是否有著必然的聯(lián)系?上述疑問，在影響腸道細(xì)菌種及其腸道細(xì)菌的宿主動物方面，特定其特征，如果能夠正確了解其對應(yīng)關(guān)系的話，則都能夠很明確地搞清楚。1分節(jié)絲狀體細(xì)菌的存在及其細(xì)菌學(xué)方面的性質(zhì)如在疑問2所提及的那樣，與大腸相比，小腸中的腸道細(xì)菌非常少。既使在內(nèi)容物開始滯留的回腸部內(nèi)，也僅是大腸中的千分之一的程度。但是，我們了解在多數(shù)動物種中，結(jié)合并棲息在小腸上皮細(xì)胞管腔內(nèi)的腸道細(xì)菌種。在顯微鏡下觀察到的用福爾馬林固定小鼠回腸絨毛的標(biāo)本，有竟達(dá)到數(shù)百微米的分節(jié)絲狀細(xì)菌。這就是分節(jié)絲狀菌(segmented&

5、#160;filamentous bacteria)。如果提高倍數(shù)，可以看到裂殖體進(jìn)入菌體中的現(xiàn)象。如后所述，我們制作并解析了裂殖體細(xì)菌單獨(dú)定植小鼠和大白鼠，明確了該細(xì)菌引起宿主方面的的特征、尤其修飾和活化小腸粘膜的特征。于是，首先決定該細(xì)菌的16SrRNA的堿基配列，為了劃定細(xì)菌學(xué)上的應(yīng)有位置，進(jìn)行了系統(tǒng)分類。迄今，在我們的研究組和Snell的研究組中，決定了小鼠、大白鼠、猴、雞的4種6系統(tǒng)動物的裂殖體細(xì)菌的16SrRNA堿基配列。一般認(rèn)為裂殖體細(xì)菌間的相同性極高，形成一種自然群。雖然認(rèn)為在已知的細(xì)菌種中，分節(jié)絲狀菌是從梭菌屬的某個種中分岔出來的，但是，從堿基置換率來看，其距離相距

6、很遠(yuǎn)，分節(jié)絲狀菌以其自身形成一個獨(dú)立群的想法大概是事實(shí)。Tannock等和Koopman等報答了分節(jié)絲狀菌在小鼠和大白鼠之間也不能互相交叉定植，證實(shí)了系統(tǒng)分類的結(jié)果。其他普通細(xì)菌學(xué)性質(zhì)，因不能在試管內(nèi)培養(yǎng)，是今后待研究的課題。2無菌動物和普通化動物為了解腸道細(xì)菌的作用，比較無菌動物和普通化動物是最合適的手段。試驗(yàn)成果指出，二者之間，不僅在消化道，而且在全身都存在著明顯的差異。本文的焦點(diǎn)放在腸粘膜免疫系統(tǒng)、尤其放在最近被重視的腸上皮細(xì)胞淋巴細(xì)胞(IEL)上，試圖解析腸道菌群的成分。首先，將小鼠自身的糞便菌群強(qiáng)制地定植地?zé)o菌小鼠內(nèi)，追蹤腸道菌群形成時IEL的行跡。無菌小鼠的rTCR陽性細(xì)胞(rIE

7、L)比TCR陽性細(xì)胞(IEL)多3倍，但普通化后，IEL和rIEL的比率發(fā)生逆轉(zhuǎn)，清潔化2周以后，IEL則處于優(yōu)勢。如果用細(xì)胞數(shù)進(jìn)行比較的話，rIEL的細(xì)胞數(shù)僅有少量增加，而IEL則增加10倍以上。另外，Thy-1陽性IEL也明顯增加。大約rIEL的全部和IEL的大部分為CD8陽性，其中，在IEL中有特征性的CD8的同型二聚體占50%以上。上述結(jié)果從給無菌、普通及清潔小鼠注射胸腺嘧啶核甙的類似體溴脫氧尿核甙(BrdU)，并進(jìn)行連續(xù)標(biāo)記時，從IEL的各亞群的BrdU標(biāo)記率的變化中也能夠得到證實(shí)。以上試驗(yàn)顯示了，把握IEL和rIEL兩個亞群的動態(tài)，在解析腸道菌群的效果方面，能夠形成有效的參數(shù)。因此

8、，作為解析腸道菌群的第1階段，將IEL的兩個亞群的比率作為指標(biāo)，來劃分腸道菌群分離源的不同影響和腸道菌群。3修飾、活化小腸粘膜特征的腸道菌群分離源的影響和腸道菌群成分的劃分為了評價腸道菌群對機(jī)體的作用，如前所述，以IEL特征作為指標(biāo)，調(diào)查了宿主方面的應(yīng)答。尤其著眼于迄今已知的將無菌鼠的盲腸尺寸縮小到清潔小鼠的大小的厭氧性有芽胞菌，將各種動物的糞便和用氯仿處理的糞便投入到無菌小鼠內(nèi)。如前所述，將小鼠的IELT細(xì)胞的構(gòu)成比變成清潔小鼠型，僅限于小鼠糞便菌群或用氯仿處理的糞便菌群。人和大白鼠的糞全未見效果。另外，搞清楚了該結(jié)果不單單是IEL的構(gòu)成比，關(guān)于IEL的細(xì)胞障礙活性和腸上皮細(xì)胞的各種特征、盲

9、腸大小也得出同樣的結(jié)果。因此，雖然是在所限定的種的范圍內(nèi)，但是，使小鼠腸粘膜的特征變成清潔小鼠型，暗示出是需要來源于小鼠的腸道菌群。這種情況可以推測出以前所提倡的原藉菌群的通用結(jié)果。將耐氯仿的腸道菌群在試管內(nèi)用EG瓊脂培養(yǎng)基作厭氧培養(yǎng)，無選擇地收集100個菌落，將它們投到無菌小鼠，但其劃分未發(fā)現(xiàn)效果，使腸粘膜特征變成普通型的腸道細(xì)菌是耐氯仿的，至少可以推測是用EG培養(yǎng)基不能培養(yǎng)的腸道細(xì)菌種。尤其在鼠的腸內(nèi)容物中，所觀察到的菌數(shù)和能夠培養(yǎng)的菌數(shù)的差距是極大的，這種耐氯仿的腸道細(xì)菌，不能培養(yǎng)的居多，極難于進(jìn)一步劃分，目前尚未著手。然而，先前所介紹的粘附于小腸上皮細(xì)胞的分節(jié)絲狀菌因耐氯仿(具有形成芽

10、胞的性能)，目前也尚未培養(yǎng)成功，是無菌小鼠普通化所必需的腸道細(xì)菌的一個侯補(bǔ)。從迄今的結(jié)果來看，任這種分節(jié)絲狀菌單獨(dú)定植的悉生動物中，除了盲腸尺寸外，我們所解析的小腸粘膜特征都變成普通化小鼠型，分節(jié)絲狀菌不是單一侯補(bǔ)，正在成為極為有力的候補(bǔ)。4用悉生動物解釋動物腸道菌群和宿主動物相互作用采用已經(jīng)單獨(dú)定植分節(jié)絲狀菌的小鼠，將其糞便用生理鹽水制成懸液，經(jīng)口投入無菌小鼠(BALB/C)，在無菌隔離室內(nèi)飼養(yǎng)。其后，逐時殺死，測定腸上皮細(xì)胞間淋巴細(xì)胞(IEL)的細(xì)胞數(shù)、表現(xiàn)型、細(xì)胞障礙活性、腸內(nèi)容物的IgA量、以及小腸上皮細(xì)胞(IEC)的分裂指數(shù)、組織相容性復(fù)合體組分子的發(fā)現(xiàn)、糖脂質(zhì)GM1 fucosy1化、吸收細(xì)胞/杯狀細(xì)胞的比率、二糖類分解酶活性。4.1對腸粘膜免疫系統(tǒng)的效果在裂殖體細(xì)菌投入前和投入后，在腸粘膜的機(jī)體