光遺傳學(xué)技術(shù)在神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展及應(yīng)用_圖文

1、2014年第49卷第11期生物學(xué)通報(bào)51光遺傳學(xué)技術(shù)光遺傳學(xué)技術(shù)是一種利用光學(xué)原理與基因工程相結(jié)合,使特定細(xì)胞類群表達(dá)或缺失某項(xiàng)功能的新興實(shí)驗(yàn)技術(shù)?；谠擁?xiàng)技術(shù)目的性強(qiáng)、精確度高等特點(diǎn),近年來,在復(fù)雜的生物學(xué)機(jī)制尤其是腦科學(xué)、神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的研究中得到了廣泛應(yīng)用,被Nature Methods定義為2010年的年度新興實(shí)驗(yàn)方法1,光遺傳學(xué)技術(shù)被譽(yù)為21世紀(jì)神經(jīng)生物學(xué)最有影響力的技術(shù)方法。1.1光遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展過程光遺傳學(xué)技術(shù)起源于神經(jīng)生物學(xué),1979年Francis Crick等認(rèn)為神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域中面臨的最大挑戰(zhàn)是:如何在腦神經(jīng)研究中精確控制一類被研究的神經(jīng)元而不影響其他周邊神經(jīng)元的功能。傳

2、統(tǒng)研究一般采用的方法是電極刺激或藥物處理,然而電極刺激的針對性不強(qiáng),藥物處理作用時(shí)間周期太長、作用靶細(xì)胞多樣等局限性因素,并不能很好地解決此類問題。在20世紀(jì)70年代人們對光激活細(xì)胞表達(dá)機(jī)制還不是很清楚,Crick提出可否用光控制細(xì)胞中的特定事件。40年前,微生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)一些微生物可產(chǎn)生光門控蛋白,能直接調(diào)控質(zhì)膜離子通道, 1971年Stoeckenius和Oesterhelt研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌視紫紅質(zhì)作為一種離子通道能被光迅速激活,1977年Matsuno-Yagi和Mukohata發(fā)現(xiàn)了鹽細(xì)菌視紫紅質(zhì),Hegemann等發(fā)現(xiàn)了光敏感通道。傳統(tǒng)認(rèn)為外來膜蛋白對神經(jīng)細(xì)胞具有毒害作用,所以感光蛋白的研

3、究并沒有引起神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域?qū)W者的重視。隨著基因工程的發(fā)展和綠色熒光蛋白在生命科學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,通過引進(jìn)外來吸光復(fù)合物對相應(yīng)蛋白進(jìn)行研究示蹤,人們才把視線重新轉(zhuǎn)移到視蛋白的研究上。2005年發(fā)現(xiàn)了一種微生物視蛋白,該視蛋白在沒有添加任何化學(xué)或光敏感復(fù)合體的情況下就可以極為敏感地響應(yīng)光刺激。2010年研究證明通道視紫紅質(zhì)、細(xì)菌視紫紅質(zhì)和鹽細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白在不同光作用下對神經(jīng)細(xì)胞可以迅速、安全地起到“開關(guān)”作用。后期發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物體內(nèi)含有光控蛋白輔因子全反式視黃醛,隨著GPRS信號(hào)通路的研究發(fā)現(xiàn),光遺傳學(xué)的應(yīng)用在活體哺乳動(dòng)物體內(nèi)具有更廣闊的前景2。1.2光遺傳學(xué)技術(shù)作用機(jī)理生物體中存在一類膜蛋白可以

4、感受不同波長光的刺激并對該光學(xué)刺激產(chǎn)生一系列效應(yīng)的響應(yīng)機(jī)制,該類蛋白被稱為視蛋白(opsin。視蛋白屬于一類視紫紅質(zhì)通道蛋白,可分為2種類型:typeI為一類微生物視蛋白,typeII為一類動(dòng)物視蛋白。兩者均需要視覺色素視黃醛作為輔基。視蛋白的種類和結(jié)構(gòu)不同,導(dǎo)致蛋白對光的吸收峰有所不同。2種類型視蛋白雖然都可編碼7次跨膜的蛋白,但序列同源性系數(shù)極低,相似性系數(shù)跨度達(dá)到25%80%3。typeI 在原核生物、藻類和真菌中表達(dá),是個(gè)龐大的亞家族,功能主要是感光和作為離子通道,作用原理為typeI編碼的視紫紅質(zhì)通道蛋白與全反式視黃醛共價(jià)結(jié)合,當(dāng)一定波長的光照時(shí),全反式視黃醛異構(gòu)化為13-順式視黃醛

5、,引起通道蛋白構(gòu)象變化,打開離子通道,完成細(xì)胞生理功能;typeII在高等真核生物中表達(dá),功能主要是視覺通路、晝夜節(jié)律和色覺分辨通路,作用原理為typeII基因編碼GPCRS(G蛋白偶聯(lián)受體,在黑暗環(huán)境中與11-順式視黃醛結(jié)合,當(dāng)視蛋白GPRS吸收光后,共價(jià)結(jié)光遺傳學(xué)技術(shù)在神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展及應(yīng)用邴杰(北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院北京100875摘要光遺傳學(xué)技術(shù)是基因工程學(xué)與光學(xué)相結(jié)合的一項(xiàng)新興技術(shù)。簡要介紹了光遺傳學(xué)技術(shù)的概念、發(fā)展過程及作用機(jī)理,概述了光遺傳學(xué)技術(shù)中通道視蛋白的類型和該技術(shù)在神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。關(guān)鍵詞光遺傳學(xué)技術(shù)視蛋白光學(xué)技術(shù)神經(jīng)生物學(xué)中國圖書分類號(hào):Q31文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A6

6、生物學(xué)通報(bào)2014年第49卷第11期合的視黃醛異構(gòu)化為全反式視黃醛,與視蛋白水解,引起視蛋白構(gòu)象變化,進(jìn)而引發(fā)視覺通路的第二信使級(jí)聯(lián)反應(yīng),光異構(gòu)化后,GPCRS與視黃醛水解后,GPCRS再與新的11-順式視黃醛開始新一輪的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)2。該項(xiàng)技術(shù)的核心是將視蛋白膜通道蛋白用轉(zhuǎn)基因?qū)W的方法,構(gòu)建改造成能在生物活體組織或培養(yǎng)的細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)且不影響生物體自身正常功能的轉(zhuǎn)基因蛋白,根據(jù)改造后不同的視蛋白結(jié)構(gòu)、功能及吸光系數(shù)的不同,利用不同波長的光照射受體組織,從而引起轉(zhuǎn)基因視蛋白構(gòu)象改變,通道打開,產(chǎn)生相應(yīng)膜內(nèi)外離子差,造成膜電位改變,從而激活或抑制特定神經(jīng)細(xì)胞活性,如下圖所示。該項(xiàng)技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域可控

7、制某一類細(xì)胞的激活或抑制,控制細(xì)胞生理機(jī)能,在研究大腦感覺、運(yùn)動(dòng)通路等重大神經(jīng)生物學(xué)問題上有廣闊的發(fā)展空間,可用于探究神經(jīng)生物學(xué)行為學(xué)領(lǐng)域的疑難問題,以及細(xì)胞內(nèi)部亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位與功能研究等生物研究領(lǐng)域4。光遺傳學(xué)技術(shù)作用機(jī)理圖2,52感光蛋白2.1細(xì)菌視紫紅質(zhì)(Bacteriorhodopsin BR細(xì)菌視紫紅質(zhì)是鹽生嗜鹽菌(Halobacterium salinarium等細(xì)菌的跨膜蛋白質(zhì),含有248個(gè)氨基酸,具有7次跨膜的螺旋結(jié)構(gòu),216位的Lys通過希夫堿與視黃醛分子相連接,在吸收光能后,視黃醛由全反式視黃醛13順式視黃醛全反式視黃醛,異構(gòu)化作用觸發(fā)細(xì)菌視紫紅質(zhì)構(gòu)象變化,把質(zhì)子從細(xì)胞質(zhì)泵

8、到細(xì)胞外。最大吸收波長為560nm黃光6。2.2鹽細(xì)菌視紫紅質(zhì)(Halorhodopsin HR鹽細(xì)菌視紫紅質(zhì)通道蛋白是能被560580nm黃光激活的介導(dǎo)Cl-的通道蛋白,陰離子內(nèi)流引起神經(jīng)元細(xì)胞超級(jí)化抑制神經(jīng)元的活性。早期發(fā)現(xiàn)NpHR 在高水平表達(dá)時(shí)會(huì)在細(xì)胞中產(chǎn)生聚合態(tài)影響該蛋白的功能,但是隨后對NpHR改造后的2代eNpHR2.0和3代eNpHR3.0不會(huì)產(chǎn)生聚合體并且具有超級(jí)化功能。最新篩選的微生物視蛋白Arch-3(Archaerhodopsin-3細(xì)菌視紫紅質(zhì)和黑脛病視蛋白(Mac,當(dāng)NpHR失活時(shí),此2個(gè)離子泵被激發(fā),進(jìn)而可抑制神經(jīng)元的活性7。2.3視紫紅質(zhì)光敏感通道(Channe

9、lrhodopsin視紫紅質(zhì)光敏感通道是一種光門控陽離子通道,在萊茵衣藻(Chlammydomonas reinhardti中發(fā)現(xiàn)7次跨膜藍(lán)光激活的非選擇性陽離子通道蛋白,最大吸收波長為470nm。光照下ChR2共價(jià)結(jié)合的全反式視黃醛變?yōu)?3-順式視黃醛,造成ChR2構(gòu)象的改變,通道打開,細(xì)胞外陽離子大量內(nèi)流,而陽離子內(nèi)流造成神經(jīng)元細(xì)胞去極化并激活動(dòng)作電位。最新工程學(xué)設(shè)計(jì)了ChR2突變體標(biāo)記ChETA 標(biāo)簽,該標(biāo)簽可減少光相應(yīng)中的雙標(biāo)記示蹤,并且可以在200Hz下被光激活,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過許多細(xì)胞正常表達(dá)ChR2范圍4050Hz8。2.4OptoXR OptoXR為視蛋白typeII型,應(yīng)用GPCR信

10、號(hào)通路在活體小鼠體內(nèi)進(jìn)行精確控制, OptoXRs是視紫紅質(zhì)-GPCR即G蛋白偶聯(lián)受體的嵌合體,可被500nm的綠光激活后參與細(xì)胞內(nèi)循環(huán),OptoXRs細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步激活Gq、Gs或Gi, Gq激活下游IP3和DAG,或Gs和Gi可激活下游cAMP,該小GTPase在黃素或膽綠色發(fā)光團(tuán)的參與下更易被激活2。其中,GPCR不僅可響應(yīng)多巴胺能、血清素和腎上腺能通路的信號(hào)傳遞,而且還可回應(yīng)諸如GABA或谷氨酸酯等神經(jīng)遞質(zhì)的信號(hào)傳遞功能9。3光遺傳學(xué)技術(shù)在神經(jīng)生物學(xué)方面的應(yīng)用光遺傳學(xué)在生物學(xué)很多領(lǐng)域尤其是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域中取得了很大的進(jìn)展2,利用光遺傳學(xué)技術(shù),已經(jīng)能很好地解釋一些神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的現(xiàn)象。在線蟲

11、中,2005年Nagel等發(fā)現(xiàn)被ChR2重組的線蟲,其肌肉壁運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和動(dòng)力感覺神經(jīng)元的活性是可控的;2007年Zhang等將ChR2和NpHR 雙重組到秀麗隱桿線蟲的肌肉壁細(xì)胞中,用光激活該細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)肌肉壁細(xì)胞的收縮,這一現(xiàn)象與線蟲受到外界機(jī)械刺激產(chǎn)生的反應(yīng)一致;在斑馬魚軀體感覺神經(jīng)元中的重復(fù)實(shí)驗(yàn)也表明,光激活下2014年第49卷第11期生物學(xué)通報(bào)7該神經(jīng)元的反應(yīng)驅(qū)動(dòng)斑馬魚產(chǎn)生的游泳行為與通常的逃避行為很類似10。Low等利用Gal4/UAS體系和光遺傳學(xué)工具在斑馬魚的系統(tǒng)發(fā)生體系中成功檢測并控制了斑馬魚心血管功能的發(fā)生機(jī)制。在果蠅中,激活ChR2的上游基因序列研究果蠅疼痛機(jī)制和厭食反應(yīng)機(jī)制

12、時(shí)發(fā)現(xiàn),一定波長的光波輻射可以打開ChR2通道,即引起神經(jīng)遞質(zhì)一元胺的釋放,一元胺進(jìn)入血清素/多巴胺厭食循環(huán),引起厭食反應(yīng)11;與此同時(shí)在哺乳動(dòng)物中利用光遺傳學(xué)技術(shù)也取得了相應(yīng)進(jìn)展,在轉(zhuǎn)基因小鼠中雙重組ChR2和eNpHR后的一系列細(xì)胞神經(jīng)元(例如下丘腦分泌素細(xì)胞、藍(lán)斑核去甲腎上腺素激活神經(jīng)元、VTA腹側(cè)被蓋區(qū)多巴胺神經(jīng)元、棘神經(jīng)元以及類膽堿能中間神經(jīng)元可以利用光波對這些神經(jīng)元的活性進(jìn)行精確控制;該技術(shù)的可控性已經(jīng)應(yīng)用到小鼠的睡眠與覺醒、多巴胺上癮機(jī)制、獎(jiǎng)賞機(jī)制以及可卡因依賴癥等諸多方面,并取得了突破性進(jìn)展;在轉(zhuǎn)基因鼠Thy:ChR2的研究中,鼠前額葉伽馬震蕩和信息處理的關(guān)系、運(yùn)動(dòng)皮層不同神經(jīng)

13、元的空間位置皮質(zhì)突觸抑制性及對杏仁核在恐懼和焦慮中的作用也有了不同的研究。在大鼠中,利用光遺傳學(xué)技術(shù)的精確可控性,將ChR2轉(zhuǎn)基因到Cre轉(zhuǎn)基因鼠系的特異神經(jīng)元亞型,例如非兒茶酚胺能神經(jīng)元,發(fā)現(xiàn)血氧水平依賴性回路功能和動(dòng)物在麻醉與覺醒中的心血管功能、呼吸和血壓的變化關(guān)系。在研究果蠅norpA缺失突變體(無視覺時(shí),將eNpHR3.0重組進(jìn)該突變體后,發(fā)現(xiàn)該突變體果蠅對藍(lán)光非常敏感;在盲斑馬魚中的研究也發(fā)現(xiàn)將ChR2轉(zhuǎn)基因到盲斑馬魚視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元后,26%的視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元對黃光的感應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通盲斑馬魚;在此基礎(chǔ)上,將eNpHR2.0轉(zhuǎn)入人體外培養(yǎng)的色素性視網(wǎng)膜炎相關(guān)細(xì)胞中,體外加入視黃醛后,

14、發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的細(xì)胞具有了方向敏感性和光引導(dǎo)行為2,這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明光遺傳學(xué)在研究視覺通路及恢復(fù)視覺領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。4前景隨著光學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,微型光纖設(shè)備的研制開發(fā)及分子轉(zhuǎn)基因技術(shù)在安全性上的不斷成熟,可廣泛地將光遺傳學(xué)技術(shù)應(yīng)用到神經(jīng)生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。該技術(shù)中重要的視蛋白在靶細(xì)胞中的表達(dá)、亞細(xì)胞中的運(yùn)輸機(jī)制等研究將擴(kuò)大光遺傳學(xué)在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用,如亞細(xì)胞的定位等。在哺乳動(dòng)物體內(nèi),typeII型光蛋白與G蛋白偶聯(lián)的信號(hào)通路間的關(guān)系研究,將為研究激酶及轉(zhuǎn)錄因子等方面提供新的研究工具。經(jīng)細(xì)胞生物學(xué)修飾后,微生物視蛋白在活體人神經(jīng)組織中具有強(qiáng)大的光遺傳性功能,在人類健康方面,目前光遺傳學(xué)只是作為

15、一種研究工具,還不能直接用于人類的疾病診斷,例如對帕金森癥的研究9,但隨著該項(xiàng)技術(shù)的不斷成熟,從2010年開始至今該技術(shù)已經(jīng)在神經(jīng)環(huán)路基礎(chǔ)研究、運(yùn)動(dòng)障礙、睡眠焦慮等神經(jīng)生物學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用12,相信該項(xiàng)技術(shù)將在神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域及臨床醫(yī)學(xué)等各個(gè)方面取得更廣闊的發(fā)展空間。主要參考文獻(xiàn)1Karl Deisseroth.Optogenetics.Nature Methods,2011,1(8: 2629.2Lief Fenno,Ofer Yizhar,Karl Deisseroth.The Development and Application of Optogenetics.Annual Revi

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