微生物限度檢查方法及其驗(yàn)證報(bào)告(修改)

1、頁眉內(nèi)容頁眉內(nèi)容73021文件編號(hào)：微生物限度檢查方法及其驗(yàn)證報(bào)告目錄1樣品相關(guān)信息1.1基本信息2主要儀器設(shè)備和試驗(yàn)耗材信息2.1主要使用的儀器設(shè)備2.2試驗(yàn)用培養(yǎng)基2.3試驗(yàn)用試劑2.4試驗(yàn)用菌種3試驗(yàn)環(huán)境3.1無菌室3.2潔凈工作臺(tái)3.3生物安全柜4試驗(yàn)方案4.1驗(yàn)證試驗(yàn)?zāi)康?.2微生物限度檢查方法草案5方法驗(yàn)證試驗(yàn)5.1菌液制備5.2計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查5.3控制菌檢查用培養(yǎng)基使用性檢查5.4供試液制備5.5方法驗(yàn)證5.5.1菌落計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證試驗(yàn)5.5.2控制菌檢查方法的驗(yàn)證5.6方法驗(yàn)證結(jié)論6供試品微生物限度檢查結(jié)果1樣品相關(guān)信息1.1基本信息（三批）品名多烯酸乙酯軟膠囊或蛹油a亞麻

2、酸乙酯膠丸規(guī)格0.25g/粒，30 粒/瓶 或 0.3g/粒，30 粒/瓶批號(hào)2主要儀器設(shè)備和試驗(yàn)耗材信息2.1主要使用的儀器設(shè)備儀器名稱型號(hào)編號(hào)培養(yǎng)箱HH-360ZL-025MJX-150ZL-042SPX-150BZL-046JJ-5ZL-026電子天平JY1001ZL-013超凈工作臺(tái)JH-DCBZL-028生物安全柜BSC-1100U A2ZL-0292.2 試驗(yàn)用培養(yǎng)基2.2.1對(duì)照培養(yǎng)基培養(yǎng)基名稱批號(hào)生產(chǎn)廠家胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基中國食品藥品檢定研究院胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基沙氏匍萄糖瓊脂培養(yǎng)基沙氏匍萄糖液體培養(yǎng)基麥康凱液體培養(yǎng)基麥康凱瓊脂培養(yǎng)基RV沙門增菌液體培養(yǎng)基2.2.2試驗(yàn)用培養(yǎng)

3、基培養(yǎng)基名稱配制批號(hào)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基沙氏匍萄糖瓊脂培養(yǎng)基沙氏匍萄糖液體培養(yǎng)基麥康凱液體培養(yǎng)基麥康凱瓊脂培養(yǎng)基RV沙門增菌液體培養(yǎng)基2.3試驗(yàn)用試劑試劑名稱配制批號(hào)含1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液含0.05%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.9%氯化鈉1%紅四氮唑2.4試驗(yàn)用困種菌種名稱菌種編號(hào)工作用菌種批號(hào)及代數(shù)信息大腸埃布困CMCC (B) 44 102E3-02枯草芽抱桿菌CMCC (B) 63 501E3-02金黃色葡糖球菌CMCC (B) 26 003E3-02乙型副傷寒沙門菌CMCC (B) 50094E3-02白色念珠

4、菌CMCC (F) 98 001E3-02黑曲霉CMCC (F) 98 003E3-023試驗(yàn)環(huán)境中國藥典2015版規(guī)定，微生物限度檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局 部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。本公司微生物限度室、陽性對(duì)照室、生物安全柜及超凈工作臺(tái)潔凈度檢測無 特殊情況下每季度進(jìn)行一次。3.1無菌室無菌室按醫(yī)藥工業(yè)潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范GB 50457-2008監(jiān)測，靜態(tài)潔凈度檢測結(jié)果符合 GB50457-2008對(duì)10000級(jí)潔凈度要求。3.2超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái)按醫(yī)藥工業(yè)潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范GB50457-2008監(jiān)測，靜態(tài)潔凈度檢測結(jié)果符合GB50457-2008對(duì)100級(jí)潔凈度要

5、求。超凈工作臺(tái)沉降菌檢測記錄沉降菌落數(shù)左 0中 0右 0空白對(duì)照03.3生物安全柜生物安全柜按生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范GB50346-2011監(jiān)測，靜態(tài)潔凈度檢測結(jié)果符合 GB50457-2008對(duì)100級(jí)潔凈度要求。生物安全柜沉降菌監(jiān)測記錄沉降菌落數(shù)左 0中 0右 0空白對(duì)照04 試驗(yàn)方案按中國藥典2015年版第四部：（通則1105）非無菌產(chǎn)品微生物限度 檢查：微生物計(jì)數(shù)法、（通則1106）非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢 查法、（通則1107）非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)及（通則 1121）抑菌效力檢 查法規(guī)定，本品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)為：1g供試品中，需氧菌總數(shù)不得過1000cfu, 霉菌和酵

6、母菌總數(shù)不得過100cfu，大腸埃希菌不得檢出。4.1驗(yàn)證試驗(yàn)?zāi)康拇_認(rèn)所采用的方法適合于本品的微生物限度檢查。即確認(rèn)本品在該檢查量 及該檢驗(yàn)條件下無抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不計(jì)。保證 檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠及檢驗(yàn)方法的完整性。4.2微生物限度檢查方案對(duì)三批產(chǎn)品進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)。取本品10g，加含1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，振搖至供試品分散均勻，制成1： 10的供試液。取1： 10的供試液1ml，加含1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化 鈉-蛋白胨緩沖液至9ml，即為1： 100的供試液。微生物計(jì)數(shù)法，取1： 10的供 試液1ml，注入

7、平皿中，依法檢查（中國藥典2015年版四部通則1105）;控制菌 檢查法，取1： 10的供試液10ml，置胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100ml中，依法檢 查（中國藥典2015年版四部通則1106）。5 方法驗(yàn)證試驗(yàn)對(duì)上述非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查方法方案進(jìn)行驗(yàn)證。5.1菌液制備（1）接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽抱桿菌、沙門菌的新鮮培養(yǎng) 物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，3035 °C培養(yǎng)1824小時(shí)；接種白色念珠菌的 新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，2025C培養(yǎng)23天。上述培養(yǎng)物用 H7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于 100cfu的菌懸液

8、。（2）接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，2025C培養(yǎng)57天，加入3ml 0.05%聚山梨酯80的H7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9% 無菌氯化鈉溶液，將抱子洗脫。然后，過濾菌絲吸出抱子懸液至無菌試管內(nèi)，用 0.05%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制 成每1ml含抱子數(shù)小于100cfu的抱子懸液。5.2 計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查（實(shí)驗(yàn)時(shí)間：取上述制備好的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌菌液各1ml（小于100cfu），分別注入無菌平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，每株 試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平板，混勻，凝固，置3035C培

9、養(yǎng)35天，計(jì)數(shù)；取上 述制備好的白色念珠菌、黑曲霉菌液各1ml （小于100cfu），分別注入無菌平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平板，混勻，凝固，置2025C培養(yǎng)57天，計(jì)數(shù)；同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng) 基進(jìn)行上述試驗(yàn)。若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均 數(shù)的70%，且菌落形態(tài)大小與對(duì)照培養(yǎng)基的菌落一致，判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。試驗(yàn)結(jié)果如表1:表1培養(yǎng)基適用性檢查結(jié)果金黃色葡萄球 菌枯草芽抱 桿菌大腸埃布 菌黑曲霉白色念珠 菌對(duì)照培養(yǎng)基12；平均被檢培養(yǎng)基12平均回收率%菌落形態(tài)大小 是否一致結(jié)果判斷5.3 控制菌檢查用培養(yǎng)基

10、適用性檢查（實(shí)驗(yàn)時(shí)間：5.3.1控制菌（大腸埃希菌）檢查用培養(yǎng)基適用性檢查麥康凱液體培養(yǎng)基促生長能力和抑制能力檢查： 接種不大于100cfu的大腸埃 希菌于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中， 在4244°C培養(yǎng)2448小時(shí)，結(jié)果見表2。 接種不少于100cfu的金黃色葡萄球菌于麥康凱液體培養(yǎng)基中，在 4244C培養(yǎng) 2448小時(shí)，結(jié)果見表2。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基促生長能力和指示特性檢查：接種不大于100cfu的大腸埃希菌與被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在3035C培養(yǎng)1872小時(shí)，結(jié)果見表2。表2控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查結(jié)果檢測項(xiàng)目培養(yǎng)基試驗(yàn)用 菌促生長能力抑制能力指示特性對(duì)照培養(yǎng)基被檢培養(yǎng)基對(duì)

11、照培養(yǎng)基被檢培養(yǎng)基對(duì)照培養(yǎng)基被檢培養(yǎng)基大腸埃希菌麥康凱 液體培 養(yǎng)基大腸+/金葡/+/麥康凱 瓊脂培 養(yǎng)基大腸+/+結(jié)論注：表中“ +”標(biāo)示有能力，“-”標(biāo)示沒有能力，“/”標(biāo)示不要求做5.4供試液制備（實(shí)驗(yàn)時(shí)間：取本品10g,加含1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至 100ml，振搖至供試品分散均勻，制成1： 10的供試液。取1： 10的供試液1ml， 加含1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9ml，即為1： 100的供 試液。5.5方法驗(yàn)證（實(shí)驗(yàn)時(shí)間：5.5.1菌落計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證試驗(yàn)（1）菌液組：分別取菌液1ml，采用平皿計(jì)數(shù)法，測定上述備好的菌液中每毫升的

12、活菌數(shù)，測定結(jié)果見表3（2）供試品對(duì)照組：取1: 10的供試液1ml，注入平皿中，測定供試品本底 的需氧菌總數(shù)，測定結(jié)果見表 4。取1： 10的供試液1ml，注入平皿中，測定供 試液品本底的霉菌和酵母菌總數(shù)，測定結(jié)果見表 4.（3）試驗(yàn)組：取1： 10的供試液1ml和上述控制菌菌液1ml （小于100cfu試 驗(yàn)菌）分別注入同一平皿中，測定結(jié)果見表 5,回收率見表6。另取1： 10的供 試液的供試液1ml和上述真菌菌液1ml （不大于100cfu試驗(yàn)菌），分別注入同一 平皿中，測定結(jié)果見表5,回收率見表6。（4） 稀釋劑對(duì)照組：取1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 1ml、p

13、H7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1ml分別注入平皿中，測定結(jié)果見表 7。 上述已注入供試液的平皿（其中試驗(yàn)組在注入供試液和控制菌菌液后應(yīng)立即傾注培養(yǎng)基），需氧菌總數(shù)，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置3035C培養(yǎng)35天逐日觀察結(jié)果，霉菌和酵母菌總數(shù)，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，待 凝固后，置2025C培養(yǎng)57天逐日觀察結(jié)果。表3菌液組菌落計(jì)數(shù)（cfu/皿）大腸埃布困金黃色葡萄 球菌枯草芽抱桿 菌白色念珠菌黑曲霉12平 均表4供試品對(duì)照組菌落計(jì)數(shù)（cfu）試驗(yàn)次數(shù)需氧困總數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)1ml平均1ml平均123表5試驗(yàn)組菌落計(jì)數(shù)（cfu）試驗(yàn) 次數(shù)大腸埃希菌金黃色葡萄 球菌枯草芽抱 桿菌

14、白色念珠 菌黑曲霉112平均212平均312平均表6試驗(yàn)組回收率測定結(jié)果試驗(yàn)次數(shù)回收率%大腸埃布困金色葡萄球 菌枯草芽抱桿 菌白色念珠菌黑曲霉123表7稀釋液對(duì)照組試驗(yàn)次數(shù)pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1%聚山梨酯80的pH7.0無 菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液123平均經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用上述方法方案進(jìn)行本品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母 菌總數(shù)可使用回收率達(dá)到要求。5.5.2控制菌檢查方法的驗(yàn)證(實(shí)驗(yàn)時(shí)間：菌液制備接種大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至 10ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33C培養(yǎng)24小時(shí)。用0.9%無菌氯化鈉溶液9ml制成每1ml含菌數(shù)為10cfu100cfu菌懸液。(1) 供試品組：取1:

15、 10的供試液10ml，加至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100ml 中，置33r培養(yǎng)24小時(shí)。(2) 陰性對(duì)照組：取稀釋液10ml，加至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100ml中，置 33r培養(yǎng)24小時(shí)。(3) 取上述培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，置 43C培養(yǎng)24 小時(shí)，觀察結(jié)果，見表7。表8大腸埃希菌檢查結(jié)果大腸埃布困胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基麥康凱液體培養(yǎng)基供試品組陰性對(duì)照組表8結(jié)果顯示，表明本品在該條件下對(duì)大腸埃希菌無抑菌作用或其抑菌作 用可以忽略不計(jì)。說明采用該法進(jìn)行本品的大腸埃希菌檢查可行。5.6方法驗(yàn)證結(jié)論上述驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果證明，非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查方法方案可行。依據(jù)驗(yàn)證結(jié)果，制定非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查方法如下：微生物限度 取本品10g，加含1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白 胨緩沖液至100ml，使供試品分散均勻，制成1： 10的供試液。必要時(shí)，取1： 10的供試液1ml，置含1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至9ml 中，即為1： 100的供試液。需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)，分別取1： 10的供試液1ml，注皿，微生物計(jì)數(shù)法，取1： 10