木犀草素對卵巢癌細胞株轉移能力的影響_肖大凱_圖文

1、收稿日期2004-09-15 修回日期2004-12-17*基金項目廣東省重點學科課題資助(No.9306;廣東省中醫(yī)藥管理局科研基金資助項目(No.300009Tel:0759-*;E-mail:ncliang文章編號 1000-4718(200606-1199-04木犀草素對卵巢癌細胞株轉移能力的影響*肖大凱1,3, 覃燕梅1, 莫麗兒2, 梁念慈1,2(1廣東醫(yī)學院生化教研室,2廣東天然藥物研究開發(fā)重點實驗室,廣東湛江524023;3上海第二醫(yī)科大學附屬瑞金醫(yī)院,上海血液學研究所,上海200025摘 要 目的:研究木犀草素對卵巢癌細胞株HO-8910PM 的體外侵襲能力的影響,并探討其可

2、能的作用機制。方法:HO-8910PM 細胞經木犀草素處理后用Boyden 小室法檢測其體外、侵襲和運動能力。并采用明膠酶譜法檢測HO-8910P M 細胞分泌的明膠酶活性。RT-PCR 檢測TIMP-1、NM 23基因mRNA 的表達情況,蛋白印跡法檢測ERK2的蛋白表達變化。結果:HO-8910PM 細胞經木犀草素處理后,體外侵襲、運動能力呈劑量依賴性下降。HO-8910PM 細胞MMP-9的分泌下降。ERK2蛋白表達明顯降低,但TIMP-1、NM23基因mRNA 的水平無明顯變化。結論:木犀草素在體外劑量依賴性地抑制卵巢癌細胞HO-8910PM 的轉移能力,這可能與木犀草素抑制MMP-9

3、的分泌及下調ERK2表達有關。關鍵詞 木犀草素;卵巢腫瘤;基質金屬蛋白酶;腫瘤轉移 中圖分類號 R363 文獻標識碼 AEffect of luteolin on metastasis of ovarian carcinoma cell lineXIAO Da-kai 1,3,QIN Yan-mei 1,MO Li-er 2,LIANG Nian-ci1,2(1Department o f Biochemistry ,Guangdon g Medical Colle ge,2Guan gdong Key Laboratory f or Resea rch and Development o f

4、 NaturalDrugs ,Zhanjiang 524023,China ;3Shanghai Institute of H e matology ,Shan ghai Second Me dical School a ff ilia ted Ruijin H ospital ,Shan ghai 200025,ChinaABSTRAC T AIM:To explore the effect of luteolin on the metastasis of ovarian carcinoma HO-8910PM cells in vitro ,and to elucidate its mec

5、hanisms.METHODS:The in vitro invasion and mobili ty of HO -8910PM were measured by Boyden chamber assay after exposure to luteolin for 6h.Gelati nase activi ty was tested by gelatin zymography assay.The expression of tissue inhibitor of metalloproteinase-1(T IMP-1,nm23mRNA and that of ERK2protein we

6、re tested by RT-PCR and Western blot -ting,respectively.RESULTS:Lu teolin significantly inhibi ted in vitro invasiveness and mobility in HO -8910PM cells in a dose dependent manner as measured by Boyden chamber assay.Luteolin inhibi ted the MMP-9secretion from HO-8910PM cells.Lute -olin did not affe

7、ct the mRNA expression of TIMP-1and n m23.Luteolin also decreased ERK2expression.CONCLUSION:Lute -olin dose-dependently inhibited the metastasis of HO-8910PM cells in vitro .Inhibition of MMP-9secreti on and ERK2expres -sion may be involved in the anti-metastasic process of luteolin.KEY WORDS Luteol

8、in;Ovarian neoplasms;Matrix metalloproteinases;Neoplasms metastasis卵巢癌是目前病死率最高的婦科惡性腫瘤之一,腫瘤轉移是卵巢癌患者惡化及術后復發(fā)和致死的主要原因之一,尋找特異性抑制腫瘤細胞轉移的靶向藥物成為近幾年抗腫瘤藥物開發(fā)的熱點。木犀草素(luteolin是一種廣泛分布于植物界的黃酮類化合物,在日常飲食中的含量也極為豐富,藥理作用多樣,如抗癌、抗炎癥和抗過敏、抗氧化等。體外研究發(fā)現(xiàn)木犀草素能夠抑制乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤及白血病等多種腫瘤細胞株的生長,并能夠誘導白血病細胞的凋亡1。本實驗以在體內已經證實有高轉移能力的人卵巢

9、癌細胞株HO-8910PM 作為實驗對象,觀察木犀草素對腫瘤轉移體外模型的影響,為開發(fā)臨床抗腫瘤藥物提供實驗依據(jù)。材 料 和 方 法1 主要試劑逆轉錄試劑盒購自Promega 公司;總RNA 提取#1199#中國病理生理雜志 Chinese Journal of Pathophysiology 2006,22(6:1199-1202試劑盒Trizol Rea gent 購自Gibco 公司。木犀草素購自Sigma,Matrigel 購自BD 公司,纖維連接蛋白(f-i bronectin,FN購自北京醫(yī)科大學生物系。ECL 試劑購自Santa Cruz 公司。聚碳酸酯膜購自Millipore

10、。2 細胞株人高轉移卵巢癌細胞系HO-8910PM 由浙江省腫瘤研究所許沈華等2建立,常規(guī)培養(yǎng),取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。3 木犀草素細胞毒性實驗處于對數(shù)生長期的HO-8910PM 細胞,經過不同濃度藥物和D MSO(011%處理6h 后,臺盼藍拒染法在鏡下記活細胞數(shù),計算不同濃度的藥物對細胞的生長抑制率。4 重組基底膜侵襲實驗3 聚碳酸酯膜的外表面涂FN 5L g,膜內表面涂matrigel 20L g,形成人工重組基底膜;將涂好的膜貼在Boyden 上室,在下室加入011%BSA -RP MI -1640;將含有不同藥物濃度的總數(shù)為2105的細胞懸液200L L 加到Boyden 上室中

11、,細胞培養(yǎng)箱內孵育6h 。取出聚碳酸酯濾膜,擦盡膜上Matrigel 及未穿過的細胞。甲醇固定1min,HE 染色。200倍顯微鏡下計數(shù)穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù)。每膜計數(shù)上下左右中5個隨機不同視野,每組平行設3個樣本。5 細胞運動能力的測定3運動實驗與重組基底膜侵襲方法相似,只是聚碳酸酯膜內表面上不需鋪matrigel 。6 明膠酶譜分析3木犀草素作用于細胞24h 后,收集上清,將培養(yǎng)瓶中的細胞消化,臺盼藍拒染法進行活細胞計數(shù)。按活細胞數(shù)換算成無血清培養(yǎng)上清的體積。 底物酶譜分析參照文獻3,SDS-PAGE 分離膠中含有011%的明膠,調整各無血清培養(yǎng)上清樣品的體積,使其所對應的活細胞數(shù)相同,4

12、e 恒流15mA 電泳,完畢后凝膠移至100mL 215%Triton X-100溶液中,洗脫SDS 。加入明膠酶緩沖液,37e 恒溫搖床中溫浴40h,染色3h,脫色液中脫色至對照出現(xiàn)清晰的負染帶。7 逆轉錄PCR(RT-PC R總RNA 的提取按照Trizol 試劑盒方法操作。c D -NA 第一鏈合成按照試劑盒操作手冊操作。GADP H (擴增產物長度450bp,作為內參照正向引物:5.-ACC ACA GTC C AT GCC ATC AC-3.;反向引物:5.-TCC ACC ACC C TG TTG C TG TA-3.。TIMP-1(擴增產物長度303bp正向引物:5.-C TT

13、CC A CAG GTCCCA CAA CC-3.;反向引物:5.-CAG CCC TGG C TC CCG AGG C-3.。nm23H1(擴增產物長度185bp正向引物:5.-AGG GCA GAC CAC ATT GC T TTT C-3.;反向引物:5.-GC T GGG AGG AAG C AT TTT AAT C-3.。反應參數(shù):熱啟動94e ,2min;94e 1min,58e 1min;72e 1min,共35循環(huán)。72e 延伸10min 。瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察結果、拍照。8 蛋白印跡木犀草素作用細胞24h 后提取總蛋白?？捡R斯亮藍法行蛋白定量。等量蛋白按照順序上樣,1

14、20V 恒壓電泳115h (MINI -PROOTEAN Ò型電泳儀。4e 恒流90mA 條件下12-16h 電轉至PVDF 膜。轉移好的膜經過011%麗春紅染色確定轉移效率及蛋白質marker 位置。PVDF 膜經新鮮配制的封閉液(1TB S,5%脫脂奶粉,0105%Tween-20封閉后,分別與Ñ抗溶液(兔抗E RK2用封閉液1B 1000稀釋、Ò抗溶液反應,清洗,最后進行ECL 試劑發(fā)光,X 光片曝光顯影。9 統(tǒng)計學處理本實驗數(shù)據(jù)資料用 x ?s 表示,SPSS 1010統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。結 果1 木犀草素對卵巢癌細胞HO-8910PM 轉移能力的

15、影響HO-8910P M 細胞經10-40L mol/L 的木犀草素作用6h 后,細胞侵襲人工重組基底膜的能力和體外運動能力明顯降低,這種抑制作用隨著木犀草素的濃度的增加而增強。木犀草素濃度為40L mol/L 時,對細胞體外侵襲人工重組基底膜和運動能力的抑制率分別為(6519?716%和(6813?410%,與對照相比,差異顯著(P <0101(圖1。為了排除木犀草素細胞毒性對實驗結果的影響,采用臺盼藍拒染法檢測木犀草素作用6h 對細胞生長的影響,結果表明10-40L mol/L 的木犀草素作用6h 對細胞的生長無影響(圖1。2 木犀草素對細胞分泌的明膠酶活性的影響 處于對數(shù)生長期的H

16、O-8910PM 細胞改用無血清培養(yǎng)基,同時加入木犀草素,作用24h 后,用明膠酶譜法分析條件培養(yǎng)基中明膠酶的活性。結果表明,HO-8910PM 能夠分泌分子量為92kD 左右MMP -9。木犀草素作用24h 可以明顯抑制MMP-9的分泌。見圖2。#1200#3 木犀草素對TIMP-1、nm23H1mRNA 表達的影響不同濃度的木犀草素作用于HO-8910PM 24h 后,用RT-PCR 的方法檢測TI MP-1、nm23H1mRNA 的表達情況。結果顯示:與內參照GADPH 比較,木犀草素作用后對TI MP-1、nm23H1mRNA 表達無明顯影響。見圖3、4 。Fig 1 Effect o

17、f luteolin on the growth,invasion and mobili ty of HO-8910PM after 6h treatment.*P <0105,vP <0101vsDMSO.圖1 不同濃度木犀草素對HO-8910PM 細胞生長、體外侵 襲和運動能力的抑制作用Fig 2 Effect of luteolin on the activity of MMP-9secreted by HO-8910PM.1:control;2:DMSO (011%;3:10L mol/L;4:20L mol/L;5:40L mol/L.圖2 木犀草素對HO-8910PM

18、細胞的MMP-9 分泌影響Fig 3 Effect of luteolin on the expression of TIMP-1for 24h treat -ment.1:DNA maker;2:control;3:D MSO (011%;4:10L mol/L;5:20L mol/L;6:40L mol/L.圖3 木犀草素對HO-8910PM 細胞TIMP-1m RNA 表達 的影響4 木犀草素對ERK2蛋白表達的影響不同濃度的木犀草素作用于HO-8910PM 24h 后,蛋白印跡結果表明,木犀草素顯著下調E RK2的表達。見圖5。Fig 4 Effect of luteolin on t

19、he expression of NM23H1for 24htreatment.1:DNA marker;2:control;3:D MSO(011%;4:10L mol/L;5:20L mol/L;6:40L mol/L.圖4 木犀草素對HO-8910PM 細胞NM23H1m RNA 表達的影響Fig 5 Effect of luteolin on the expression of ERK2after 24h treat -ment.1:control;2:DMSO (011%;3:10L mol/L;4:20L mol/L;5:40L mol/L.圖5 不同濃度木犀草素對HO-8910P

20、M 細胞ERK2蛋白表達的影響討 論侵襲轉移是惡性腫瘤的本質特性,轉移瘤的快速增殖、多灶性分布、異質性生長是目前手術、放射治療和化學治療等手段常遭受失敗并最終導致癌癥病人死亡的主要原因,抑制腫瘤的侵襲轉移是降低腫瘤死亡率的重要途徑。目前認為,腫瘤細胞需要經過粘附、分泌蛋白水解酶、運動等3個主要步驟完成向深層侵襲的過程。對腫瘤侵襲轉移機制的深入了解,為腫瘤侵襲轉移的防治提供了新的思路,尋找抑制腫瘤轉移各步驟的抑制劑,抑制腫瘤的轉移,是抗癌藥物研究的新方向?；|金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs是一類降解細胞外基質Zn 2+依賴的內源性蛋白水解酶。金屬蛋白酶組

21、織型抑制劑(tissue inhibitor of met -alloproteinases,TI MPs是MMPs 的天然抑制劑,MMPs/TI MPs 的比例對于維持基底膜和細胞外基質的代謝平衡4和腫瘤細胞的轉移具有重要影響5。已經證實木犀草素是拓撲異構酶的抑制劑,能夠抑制腫瘤細胞的增殖。而我們發(fā)現(xiàn),木犀草素在#1201#并不影響細胞活性的情況下,能夠抑制卵巢癌細胞轉移過程中的侵襲、運動環(huán)節(jié),說明木犀草素具有抑制卵巢癌細胞轉移的能力。進一步的實驗結果表明,木犀草素可以顯著抑制HO-8910PM 分泌MMP -9,但對MMP-9內源性抑制劑TI MP-1的表達無明顯影響,提示抑制MMP-9的

22、分泌可能是木犀草素抑制卵巢癌細胞體外侵襲能力的機制之一。 信號轉導系統(tǒng)中的多種激酶在腫瘤細胞的轉移過程中具有重要作用。PKC 、MAPK 、PI3K 等激酶作為中樞分子通過作用于下游效應分子對腫瘤細胞的侵襲轉移行為進行調控。細胞外調節(jié)蛋白激酶包括ERK1和ERK2,是MAPK 信號轉導通路中相當重要的一個環(huán)節(jié),ERK1、ERK2一旦被激活,可以磷酸化一系列的胞漿蛋白,也可以移位至細胞核,活化多種轉錄因子,進而影響各種基因的表達。ERK2激活能增強乳腺癌細胞MCF-7的運動能力6和侵襲細胞外基質的能力7,特異性地抑制ERK 的激活能夠降低頭頸腺癌的體內侵襲能力8,并且能夠抑制MMP-9的表達9,

23、說明ERK 在腫瘤侵襲、運動過程發(fā)揮重要作用。我們的實驗結果表明木犀草素能夠明顯地抑制ERK2的表達,由此我們推斷,抑制ERK 的表達可能參與了木犀草素抑制卵巢癌細胞轉移的過程:木犀草素可能通過抑制ERK,下調MMP-9的分泌,進而抑制卵巢癌細胞的侵襲,或抑制卵巢癌細胞的運動,從而抑制整個轉移過程。但其深入的機制及體內的作用效果尚需進一步研究。參 考 文 獻1 Kang TB,Liang NC.Effect of luteolin on activities of proteinkinase C and tyrosine protein kinase from HL -60cellsJ.Act

24、a Pharmacologica Sinica,1997,18(4:374-376.2 許沈華,牟瀚舟,錢麗娟,等.高轉移人卵巢癌裸鼠移植瘤模型(NMSO的建立及其生物學特性J.中華病理學雜志,1996,25(1:33-35.3 韓 銳.抗癌藥物研究與實驗技術M.北京:北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社,1997.353-362.4 劉金來,關良勁,謝旭晶,等.急性冠狀動脈綜合征患者血漿基質金屬蛋白酶及其抑制因子的變化J.中國病理生理雜志,2004,20(10:1921-1922.5 肖大凱,梁念慈.Ô型膠原酶的研究進展J.國外醫(yī)學:臨床生物化學與檢驗學分冊,2001,22(5:225-227.6 Nguyen DH,Hussaini IM,Gonias SL.Binding of urokinase-type plasminogen activator