木犀草素對(duì)卵巢癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)移能力的影響_肖大凱_圖文

1、收稿日期2004-09-15 修回日期2004-12-17*基金項(xiàng)目廣東省重點(diǎn)學(xué)科課題資助(No.9306;廣東省中醫(yī)藥管理局科研基金資助項(xiàng)目(No.300009Tel:0759-*;E-mail:ncliang文章編號(hào) 1000-4718(200606-1199-04木犀草素對(duì)卵巢癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)移能力的影響*肖大凱1,3, 覃燕梅1, 莫麗兒2, 梁念慈1,2(1廣東醫(yī)學(xué)院生化教研室,2廣東天然藥物研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江524023;3上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院,上海血液學(xué)研究所,上海200025摘 要 目的:研究木犀草素對(duì)卵巢癌細(xì)胞株HO-8910PM 的體外侵襲能力的影響,并探討其可

2、能的作用機(jī)制。方法:HO-8910PM 細(xì)胞經(jīng)木犀草素處理后用Boyden 小室法檢測(cè)其體外、侵襲和運(yùn)動(dòng)能力。并采用明膠酶譜法檢測(cè)HO-8910P M 細(xì)胞分泌的明膠酶活性。RT-PCR 檢測(cè)TIMP-1、NM 23基因mRNA 的表達(dá)情況,蛋白印跡法檢測(cè)ERK2的蛋白表達(dá)變化。結(jié)果:HO-8910PM 細(xì)胞經(jīng)木犀草素處理后,體外侵襲、運(yùn)動(dòng)能力呈劑量依賴性下降。HO-8910PM 細(xì)胞MMP-9的分泌下降。ERK2蛋白表達(dá)明顯降低,但TIMP-1、NM23基因mRNA 的水平無(wú)明顯變化。結(jié)論:木犀草素在體外劑量依賴性地抑制卵巢癌細(xì)胞HO-8910PM 的轉(zhuǎn)移能力,這可能與木犀草素抑制MMP-9

3、的分泌及下調(diào)ERK2表達(dá)有關(guān)。關(guān)鍵詞 木犀草素;卵巢腫瘤;基質(zhì)金屬蛋白酶;腫瘤轉(zhuǎn)移 中圖分類號(hào) R363 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 AEffect of luteolin on metastasis of ovarian carcinoma cell lineXIAO Da-kai 1,3,QIN Yan-mei 1,MO Li-er 2,LIANG Nian-ci1,2(1Department o f Biochemistry ,Guangdon g Medical Colle ge,2Guan gdong Key Laboratory f or Resea rch and Development o f

4、 NaturalDrugs ,Zhanjiang 524023,China ;3Shanghai Institute of H e matology ,Shan ghai Second Me dical School a ff ilia ted Ruijin H ospital ,Shan ghai 200025,ChinaABSTRAC T AIM:To explore the effect of luteolin on the metastasis of ovarian carcinoma HO-8910PM cells in vitro ,and to elucidate its mec

5、hanisms.METHODS:The in vitro invasion and mobili ty of HO -8910PM were measured by Boyden chamber assay after exposure to luteolin for 6h.Gelati nase activi ty was tested by gelatin zymography assay.The expression of tissue inhibitor of metalloproteinase-1(T IMP-1,nm23mRNA and that of ERK2protein we

6、re tested by RT-PCR and Western blot -ting,respectively.RESULTS:Lu teolin significantly inhibi ted in vitro invasiveness and mobility in HO -8910PM cells in a dose dependent manner as measured by Boyden chamber assay.Luteolin inhibi ted the MMP-9secretion from HO-8910PM cells.Lute -olin did not affe

7、ct the mRNA expression of TIMP-1and n m23.Luteolin also decreased ERK2expression.CONCLUSION:Lute -olin dose-dependently inhibited the metastasis of HO-8910PM cells in vitro .Inhibition of MMP-9secreti on and ERK2expres -sion may be involved in the anti-metastasic process of luteolin.KEY WORDS Luteol

8、in;Ovarian neoplasms;Matrix metalloproteinases;Neoplasms metastasis卵巢癌是目前病死率最高的婦科惡性腫瘤之一,腫瘤轉(zhuǎn)移是卵巢癌患者惡化及術(shù)后復(fù)發(fā)和致死的主要原因之一,尋找特異性抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的靶向藥物成為近幾年抗腫瘤藥物開發(fā)的熱點(diǎn)。木犀草素(luteolin是一種廣泛分布于植物界的黃酮類化合物,在日常飲食中的含量也極為豐富,藥理作用多樣,如抗癌、抗炎癥和抗過敏、抗氧化等。體外研究發(fā)現(xiàn)木犀草素能夠抑制乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤及白血病等多種腫瘤細(xì)胞株的生長(zhǎng),并能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的凋亡1。本實(shí)驗(yàn)以在體內(nèi)已經(jīng)證實(shí)有高轉(zhuǎn)移能力的人卵巢

9、癌細(xì)胞株HO-8910PM 作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,觀察木犀草素對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移體外模型的影響,為開發(fā)臨床抗腫瘤藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材 料 和 方 法1 主要試劑逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega 公司;總RNA 提取#1199#中國(guó)病理生理雜志 Chinese Journal of Pathophysiology 2006,22(6:1199-1202試劑盒Trizol Rea gent 購(gòu)自Gibco 公司。木犀草素購(gòu)自Sigma,Matrigel 購(gòu)自BD 公司,纖維連接蛋白(f-i bronectin,FN購(gòu)自北京醫(yī)科大學(xué)生物系。ECL 試劑購(gòu)自Santa Cruz 公司。聚碳酸酯膜購(gòu)自Millipore

10、。2 細(xì)胞株人高轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞系HO-8910PM 由浙江省腫瘤研究所許沈華等2建立,常規(guī)培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3 木犀草素細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HO-8910PM 細(xì)胞,經(jīng)過不同濃度藥物和D MSO(011%處理6h 后,臺(tái)盼藍(lán)拒染法在鏡下記活細(xì)胞數(shù),計(jì)算不同濃度的藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。4 重組基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)3 聚碳酸酯膜的外表面涂FN 5L g,膜內(nèi)表面涂matrigel 20L g,形成人工重組基底膜;將涂好的膜貼在Boyden 上室,在下室加入011%BSA -RP MI -1640;將含有不同藥物濃度的總數(shù)為2105的細(xì)胞懸液200L L 加到Boyden 上室中

11、,細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育6h 。取出聚碳酸酯濾膜,擦盡膜上Matrigel 及未穿過的細(xì)胞。甲醇固定1min,HE 染色。200倍顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)。每膜計(jì)數(shù)上下左右中5個(gè)隨機(jī)不同視野,每組平行設(shè)3個(gè)樣本。5 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的測(cè)定3運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)與重組基底膜侵襲方法相似,只是聚碳酸酯膜內(nèi)表面上不需鋪matrigel 。6 明膠酶譜分析3木犀草素作用于細(xì)胞24h 后,收集上清,將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞消化,臺(tái)盼藍(lán)拒染法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。按活細(xì)胞數(shù)換算成無(wú)血清培養(yǎng)上清的體積。 底物酶譜分析參照文獻(xiàn)3,SDS-PAGE 分離膠中含有011%的明膠,調(diào)整各無(wú)血清培養(yǎng)上清樣品的體積,使其所對(duì)應(yīng)的活細(xì)胞數(shù)相同,4

12、e 恒流15mA 電泳,完畢后凝膠移至100mL 215%Triton X-100溶液中,洗脫SDS 。加入明膠酶緩沖液,37e 恒溫?fù)u床中溫浴40h,染色3h,脫色液中脫色至對(duì)照出現(xiàn)清晰的負(fù)染帶。7 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PC R總RNA 的提取按照Trizol 試劑盒方法操作。c D -NA 第一鏈合成按照試劑盒操作手冊(cè)操作。GADP H (擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度450bp,作為內(nèi)參照正向引物:5.-ACC ACA GTC C AT GCC ATC AC-3.;反向引物:5.-TCC ACC ACC C TG TTG C TG TA-3.。TIMP-1(擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度303bp正向引物:5.-C TT

13、CC A CAG GTCCCA CAA CC-3.;反向引物:5.-CAG CCC TGG C TC CCG AGG C-3.。nm23H1(擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度185bp正向引物:5.-AGG GCA GAC CAC ATT GC T TTT C-3.;反向引物:5.-GC T GGG AGG AAG C AT TTT AAT C-3.。反應(yīng)參數(shù):熱啟動(dòng)94e ,2min;94e 1min,58e 1min;72e 1min,共35循環(huán)。72e 延伸10min 。瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察結(jié)果、拍照。8 蛋白印跡木犀草素作用細(xì)胞24h 后提取總蛋白?？捡R斯亮藍(lán)法行蛋白定量。等量蛋白按照順序上樣,1

14、20V 恒壓電泳115h (MINI -PROOTEAN Ò型電泳儀。4e 恒流90mA 條件下12-16h 電轉(zhuǎn)至PVDF 膜。轉(zhuǎn)移好的膜經(jīng)過011%麗春紅染色確定轉(zhuǎn)移效率及蛋白質(zhì)marker 位置。PVDF 膜經(jīng)新鮮配制的封閉液(1TB S,5%脫脂奶粉,0105%Tween-20封閉后,分別與Ñ抗溶液(兔抗E RK2用封閉液1B 1000稀釋、Ò抗溶液反應(yīng),清洗,最后進(jìn)行ECL 試劑發(fā)光,X 光片曝光顯影。9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料用 x ?s 表示,SPSS 1010統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。結(jié) 果1 木犀草素對(duì)卵巢癌細(xì)胞HO-8910PM 轉(zhuǎn)移能力的

15、影響HO-8910P M 細(xì)胞經(jīng)10-40L mol/L 的木犀草素作用6h 后,細(xì)胞侵襲人工重組基底膜的能力和體外運(yùn)動(dòng)能力明顯降低,這種抑制作用隨著木犀草素的濃度的增加而增強(qiáng)。木犀草素濃度為40L mol/L 時(shí),對(duì)細(xì)胞體外侵襲人工重組基底膜和運(yùn)動(dòng)能力的抑制率分別為(6519?716%和(6813?410%,與對(duì)照相比,差異顯著(P <0101(圖1。為了排除木犀草素細(xì)胞毒性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)木犀草素作用6h 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,結(jié)果表明10-40L mol/L 的木犀草素作用6h 對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)影響(圖1。2 木犀草素對(duì)細(xì)胞分泌的明膠酶活性的影響 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H

16、O-8910PM 細(xì)胞改用無(wú)血清培養(yǎng)基,同時(shí)加入木犀草素,作用24h 后,用明膠酶譜法分析條件培養(yǎng)基中明膠酶的活性。結(jié)果表明,HO-8910PM 能夠分泌分子量為92kD 左右MMP -9。木犀草素作用24h 可以明顯抑制MMP-9的分泌。見圖2。#1200#3 木犀草素對(duì)TIMP-1、nm23H1mRNA 表達(dá)的影響不同濃度的木犀草素作用于HO-8910PM 24h 后,用RT-PCR 的方法檢測(cè)TI MP-1、nm23H1mRNA 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:與內(nèi)參照GADPH 比較,木犀草素作用后對(duì)TI MP-1、nm23H1mRNA 表達(dá)無(wú)明顯影響。見圖3、4 。Fig 1 Effect o

17、f luteolin on the growth,invasion and mobili ty of HO-8910PM after 6h treatment.*P <0105,vP <0101vsDMSO.圖1 不同濃度木犀草素對(duì)HO-8910PM 細(xì)胞生長(zhǎng)、體外侵 襲和運(yùn)動(dòng)能力的抑制作用Fig 2 Effect of luteolin on the activity of MMP-9secreted by HO-8910PM.1:control;2:DMSO (011%;3:10L mol/L;4:20L mol/L;5:40L mol/L.圖2 木犀草素對(duì)HO-8910PM

18、細(xì)胞的MMP-9 分泌影響Fig 3 Effect of luteolin on the expression of TIMP-1for 24h treat -ment.1:DNA maker;2:control;3:D MSO (011%;4:10L mol/L;5:20L mol/L;6:40L mol/L.圖3 木犀草素對(duì)HO-8910PM 細(xì)胞TIMP-1m RNA 表達(dá) 的影響4 木犀草素對(duì)ERK2蛋白表達(dá)的影響不同濃度的木犀草素作用于HO-8910PM 24h 后,蛋白印跡結(jié)果表明,木犀草素顯著下調(diào)E RK2的表達(dá)。見圖5。Fig 4 Effect of luteolin on t

19、he expression of NM23H1for 24htreatment.1:DNA marker;2:control;3:D MSO(011%;4:10L mol/L;5:20L mol/L;6:40L mol/L.圖4 木犀草素對(duì)HO-8910PM 細(xì)胞NM23H1m RNA 表達(dá)的影響Fig 5 Effect of luteolin on the expression of ERK2after 24h treat -ment.1:control;2:DMSO (011%;3:10L mol/L;4:20L mol/L;5:40L mol/L.圖5 不同濃度木犀草素對(duì)HO-8910P

20、M 細(xì)胞ERK2蛋白表達(dá)的影響討 論侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的本質(zhì)特性,轉(zhuǎn)移瘤的快速增殖、多灶性分布、異質(zhì)性生長(zhǎng)是目前手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療等手段常遭受失敗并最終導(dǎo)致癌癥病人死亡的主要原因,抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是降低腫瘤死亡率的重要途徑。目前認(rèn)為,腫瘤細(xì)胞需要經(jīng)過粘附、分泌蛋白水解酶、運(yùn)動(dòng)等3個(gè)主要步驟完成向深層侵襲的過程。對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的深入了解,為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的防治提供了新的思路,尋找抑制腫瘤轉(zhuǎn)移各步驟的抑制劑,抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移,是抗癌藥物研究的新方向?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs是一類降解細(xì)胞外基質(zhì)Zn 2+依賴的內(nèi)源性蛋白水解酶。金屬蛋白酶組

21、織型抑制劑(tissue inhibitor of met -alloproteinases,TI MPs是MMPs 的天然抑制劑,MMPs/TI MPs 的比例對(duì)于維持基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的代謝平衡4和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移具有重要影響5。已經(jīng)證實(shí)木犀草素是拓?fù)洚悩?gòu)酶的抑制劑,能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。而我們發(fā)現(xiàn),木犀草素在#1201#并不影響細(xì)胞活性的情況下,能夠抑制卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中的侵襲、運(yùn)動(dòng)環(huán)節(jié),說明木犀草素具有抑制卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,木犀草素可以顯著抑制HO-8910PM 分泌MMP -9,但對(duì)MMP-9內(nèi)源性抑制劑TI MP-1的表達(dá)無(wú)明顯影響,提示抑制MMP-9的

22、分泌可能是木犀草素抑制卵巢癌細(xì)胞體外侵襲能力的機(jī)制之一。 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中的多種激酶在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用。PKC 、MAPK 、PI3K 等激酶作為中樞分子通過作用于下游效應(yīng)分子對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移行為進(jìn)行調(diào)控。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶包括ERK1和ERK2,是MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相當(dāng)重要的一個(gè)環(huán)節(jié),ERK1、ERK2一旦被激活,可以磷酸化一系列的胞漿蛋白,也可以移位至細(xì)胞核,活化多種轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)而影響各種基因的表達(dá)。ERK2激活能增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的運(yùn)動(dòng)能力6和侵襲細(xì)胞外基質(zhì)的能力7,特異性地抑制ERK 的激活能夠降低頭頸腺癌的體內(nèi)侵襲能力8,并且能夠抑制MMP-9的表達(dá)9,

23、說明ERK 在腫瘤侵襲、運(yùn)動(dòng)過程發(fā)揮重要作用。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明木犀草素能夠明顯地抑制ERK2的表達(dá),由此我們推斷,抑制ERK 的表達(dá)可能參與了木犀草素抑制卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程:木犀草素可能通過抑制ERK,下調(diào)MMP-9的分泌,進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲,或抑制卵巢癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng),從而抑制整個(gè)轉(zhuǎn)移過程。但其深入的機(jī)制及體內(nèi)的作用效果尚需進(jìn)一步研究。參 考 文 獻(xiàn)1 Kang TB,Liang NC.Effect of luteolin on activities of proteinkinase C and tyrosine protein kinase from HL -60cellsJ.Act

24、a Pharmacologica Sinica,1997,18(4:374-376.2 許沈華,牟瀚舟,錢麗娟,等.高轉(zhuǎn)移人卵巢癌裸鼠移植瘤模型(NMSO的建立及其生物學(xué)特性J.中華病理學(xué)雜志,1996,25(1:33-35.3 韓 銳.抗癌藥物研究與實(shí)驗(yàn)技術(shù)M.北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1997.353-362.4 劉金來,關(guān)良勁,謝旭晶,等.急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者血漿基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子的變化J.中國(guó)病理生理雜志,2004,20(10:1921-1922.5 肖大凱,梁念慈.Ô型膠原酶的研究進(jìn)展J.國(guó)外醫(yī)學(xué):臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè),2001,22(5:225-227.6 Nguyen DH,Hussaini IM,Gonias SL.Binding of urokinase-type plasminogen activator