2細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

1、l 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院l 瑞金臨床醫(yī)學(xué)院瑞金臨床醫(yī)學(xué)院l 洪秀華教授洪秀華教授 l 從生物體內(nèi)取出組織或細(xì)胞，在體從生物體內(nèi)取出組織或細(xì)胞，在體外外(in vitro)(in vitro)模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，對(duì)這菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，對(duì)這些組織或細(xì)胞進(jìn)行孵育培養(yǎng)，使之保持些組織或細(xì)胞進(jìn)行孵育培養(yǎng)，使之保持一定的結(jié)構(gòu)和功能，以便于我們觀察研一定的結(jié)構(gòu)和功能，以便于我們觀察研究，這種方法就是細(xì)胞培養(yǎng)（究，這種方法就是細(xì)胞培養(yǎng)（cell cell cultureculture）。有時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)也稱為組織培）。有時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)也

2、稱為組織培養(yǎng)（養(yǎng)（tissue culturetissue culture），二者可作為同），二者可作為同義語使用。義語使用。l細(xì)胞培養(yǎng)的工作始于細(xì)胞培養(yǎng)的工作始于2020世紀(jì)初目前廣泛世紀(jì)初目前廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，并且應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，并且是各種細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)。哈里森是各種細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)。哈里森（ HarrisonHarrison，19071907），因此被稱為），因此被稱為“組織培養(yǎng)之父組織培養(yǎng)之父”l（一）培養(yǎng)細(xì)胞的類型及其特點(diǎn)（一）培養(yǎng)細(xì)胞的類型及其特點(diǎn)l體外培養(yǎng)細(xì)胞大多培養(yǎng)在瓶皿等容器中，體外培養(yǎng)細(xì)胞大多培養(yǎng)在瓶皿等容器中，根據(jù)它們是否能貼附在支持物

3、上生長(zhǎng)的根據(jù)它們是否能貼附在支持物上生長(zhǎng)的特性，可分為貼附型和懸浮型兩大類。特性，可分為貼附型和懸浮型兩大類。l 大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞均為貼附型，它大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞均為貼附型，它們必須貼附在支持物表面生長(zhǎng)，這類們必須貼附在支持物表面生長(zhǎng)，這類細(xì)胞在體內(nèi)時(shí)各自具有其特殊的形態(tài)，細(xì)胞在體內(nèi)時(shí)各自具有其特殊的形態(tài)，但在體外培養(yǎng)時(shí)貼附于支持物后形態(tài)但在體外培養(yǎng)時(shí)貼附于支持物后形態(tài)上表現(xiàn)單一化而失去體內(nèi)原有的某些上表現(xiàn)單一化而失去體內(nèi)原有的某些特征，多呈上皮樣或成纖維細(xì)胞樣。特征，多呈上皮樣或成纖維細(xì)胞樣。l貼附細(xì)胞型貼附細(xì)胞型MRC-5成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞 貼附型細(xì)胞正常猴腎單層上皮細(xì)胞貼附型細(xì)胞正常猴腎單層

4、上皮細(xì)胞l接觸抑制：接觸抑制：正常貼附型細(xì)胞具有接觸抑正常貼附型細(xì)胞具有接觸抑制的特性，細(xì)胞相互接觸后可抑制細(xì)胞制的特性，細(xì)胞相互接觸后可抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，因此細(xì)胞不會(huì)相互重疊于其上的運(yùn)動(dòng)，因此細(xì)胞不會(huì)相互重疊于其上面生長(zhǎng)。面生長(zhǎng)。l密度抑制：密度抑制：細(xì)胞生長(zhǎng)、匯合成片后，雖細(xì)胞生長(zhǎng)、匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，但只要營(yíng)養(yǎng)充分，仍可發(fā)生接觸抑制，但只要營(yíng)養(yǎng)充分，仍可增殖分裂，但當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到一定密度增殖分裂，但當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到一定密度后，由于營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，后，由于營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，細(xì)胞分裂停止，稱為密度抑制。細(xì)胞分裂停止，稱為密度抑制。l腫瘤細(xì)胞的接觸抑制及密度抑腫瘤細(xì)胞的接

5、觸抑制及密度抑制往往減弱或消失，因此細(xì)胞制往往減弱或消失，因此細(xì)胞可向三維空間發(fā)展，導(dǎo)致細(xì)胞可向三維空間發(fā)展，導(dǎo)致細(xì)胞堆積，并可生長(zhǎng)至較高的終末堆積，并可生長(zhǎng)至較高的終末細(xì)胞密度。細(xì)胞密度。l少數(shù)細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)不貼附于支持物上，少數(shù)細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)不貼附于支持物上，而以懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，包括一些取自血、而以懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，包括一些取自血、脾或骨髓的培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是血液白細(xì)脾或骨髓的培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是血液白細(xì)胞，以及一些腫瘤細(xì)胞。胞，以及一些腫瘤細(xì)胞。l 細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)時(shí)可以呈單個(gè)細(xì)胞或細(xì)小細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)時(shí)可以呈單個(gè)細(xì)胞或細(xì)小的細(xì)胞團(tuán)，胞體為圓形。的細(xì)胞團(tuán)，胞體為圓形。l其優(yōu)點(diǎn)是在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，生存空間大，其優(yōu)點(diǎn)

6、是在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，生存空間大，允許長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)，便于大量繁殖。允許長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)，便于大量繁殖。l培養(yǎng)細(xì)胞的生命期培養(yǎng)細(xì)胞的生命期l 培養(yǎng)細(xì)胞的生命期（培養(yǎng)細(xì)胞的生命期（life span）指的）指的是細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間，是細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間，一般可分為原代培養(yǎng)期、傳代期和衰退一般可分為原代培養(yǎng)期、傳代期和衰退期。從體內(nèi)取出細(xì)胞接種培養(yǎng)到第一次期。從體內(nèi)取出細(xì)胞接種培養(yǎng)到第一次傳代叫原代培養(yǎng)，一般持續(xù)傳代叫原代培養(yǎng)，一般持續(xù)1-4周。周。l 原代細(xì)胞一經(jīng)傳代后便稱為細(xì)胞系原代細(xì)胞一經(jīng)傳代后便稱為細(xì)胞系（cell line），進(jìn)入傳代期，此期在全），進(jìn)入傳代期，此期在全生命

7、期中持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，細(xì)胞增殖旺盛，生命期中持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體的核型。一般情況下可并能維持二倍體的核型。一般情況下可傳代傳代10-50次，隨后細(xì)胞增殖緩慢以至次，隨后細(xì)胞增殖緩慢以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入衰退期，最后死亡。完全停止，細(xì)胞進(jìn)入衰退期，最后死亡。l 腫瘤細(xì)胞系可無限增殖而無衰腫瘤細(xì)胞系可無限增殖而無衰退期，正常細(xì)胞系也可在傳代期退期，正常細(xì)胞系也可在傳代期末期或衰退期發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化，細(xì)末期或衰退期發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化，細(xì)胞獲得永生性即永久增殖的能力，胞獲得永生性即永久增殖的能力，稱為無限細(xì)胞系或連續(xù)細(xì)胞系。稱為無限細(xì)胞系或連續(xù)細(xì)胞系。l 培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或培養(yǎng)細(xì)

8、胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間相對(duì)孤立，營(yíng)養(yǎng)是有其它容器，生存空間相對(duì)孤立，營(yíng)養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖至一定密度后，則需分限的。當(dāng)細(xì)胞增殖至一定密度后，則需分離出一部分細(xì)胞接種到其他容器，并及時(shí)離出一部分細(xì)胞接種到其他容器，并及時(shí)更新培養(yǎng)液，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，更新培養(yǎng)液，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過程叫這一過程叫傳代傳代（passage 或或subculture）。）。l 從細(xì)胞接種到下一次傳代再培養(yǎng)的從細(xì)胞接種到下一次傳代再培養(yǎng)的一段時(shí)間叫一代。需要注意的是一段時(shí)間叫一代。需要注意的是細(xì)胞培細(xì)胞培養(yǎng)一代養(yǎng)一代與與細(xì)胞倍增細(xì)胞倍增（doubling）的概念）的概念是不同

9、的，細(xì)胞倍增指的是細(xì)胞數(shù)增加是不同的，細(xì)胞倍增指的是細(xì)胞數(shù)增加一倍。一般地，細(xì)胞培養(yǎng)一代的過程中，一倍。一般地，細(xì)胞培養(yǎng)一代的過程中，細(xì)胞可倍增細(xì)胞可倍增2-6次。次。l細(xì)胞傳一代以后，細(xì)胞群體一般要經(jīng)過細(xì)胞傳一代以后，細(xì)胞群體一般要經(jīng)過潛伏期潛伏期、指數(shù)增長(zhǎng)期指數(shù)增長(zhǎng)期與與平臺(tái)期平臺(tái)期三個(gè)階段。三個(gè)階段。l以貼附型細(xì)胞為例說明如下：細(xì)胞接種以貼附型細(xì)胞為例說明如下：細(xì)胞接種后呈懸浮狀態(tài)，在后呈懸浮狀態(tài)，在05-4 h內(nèi)貼附于支持內(nèi)貼附于支持物，進(jìn)入物，進(jìn)入潛伏期潛伏期，此期細(xì)胞無增殖發(fā)生，此期細(xì)胞無增殖發(fā)生，原代細(xì)胞持續(xù)約原代細(xì)胞持續(xù)約24-96 h，而腫瘤細(xì)胞或，而腫瘤細(xì)胞或無限傳代細(xì)胞僅

10、需無限傳代細(xì)胞僅需6-24 h。l隨著分裂相細(xì)胞的出現(xiàn)并逐漸增多，細(xì)隨著分裂相細(xì)胞的出現(xiàn)并逐漸增多，細(xì)胞群體進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，此期又稱胞群體進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，此期又稱對(duì)數(shù)對(duì)數(shù)期期，細(xì)胞增殖旺盛，成倍增長(zhǎng)，活力最，細(xì)胞增殖旺盛，成倍增長(zhǎng)，活力最佳，佳，適于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究適于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；此期時(shí)間長(zhǎng)短；此期時(shí)間長(zhǎng)短因細(xì)胞本身特性及接種密度、因細(xì)胞本身特性及接種密度、血清濃度血清濃度而不完全相同，一般可持續(xù)而不完全相同，一般可持續(xù)3-5天。天。l隨著細(xì)胞數(shù)量的逐漸增多，細(xì)胞相互接隨著細(xì)胞數(shù)量的逐漸增多，細(xì)胞相互接觸匯合成片，因接觸抑制及密度抑制細(xì)觸匯合成片，因接觸抑制及密度抑制細(xì)胞停止分裂繁殖，進(jìn)入胞停止

11、分裂繁殖，進(jìn)入平臺(tái)期平臺(tái)期，細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞數(shù)目不再增加，但仍維持一定時(shí)間的活力，目不再增加，但仍維持一定時(shí)間的活力，此時(shí)應(yīng)此時(shí)應(yīng)及時(shí)及時(shí)分離傳代，否則細(xì)胞將因中分離傳代，否則細(xì)胞將因中毒而發(fā)生改變甚至死亡。懸浮型細(xì)胞一毒而發(fā)生改變甚至死亡。懸浮型細(xì)胞一般沒有潛伏期，接種并添加新鮮培養(yǎng)液般沒有潛伏期，接種并添加新鮮培養(yǎng)液后即可迅速進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期。后即可迅速進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期。l 培養(yǎng)細(xì)胞需要特定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)細(xì)胞需要特定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)設(shè)備。培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)設(shè)備。培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)，浸浴于生長(zhǎng)，浸浴于培養(yǎng)液培養(yǎng)液，并需要特有，并需要特有的的環(huán)境環(huán)境，包括一定的，包括一定的溫度、濕度和溫度、

12、濕度和氣體成分。氣體成分。培養(yǎng)細(xì)胞的生存條件培養(yǎng)細(xì)胞的生存條件培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)瓶 溫度、濕溫度、濕度和氣體度和氣體由由CO2恒溫孵恒溫孵育箱提供育箱提供 生長(zhǎng)生長(zhǎng)培養(yǎng)液培養(yǎng)液1020的血清的血清 維持維持培養(yǎng)液培養(yǎng)液25的血清的血清 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)糖、糖、氨基酸、維生氨基酸、維生素、無機(jī)離子、素、無機(jī)離子、微量元素等微量元素等 l培養(yǎng)細(xì)胞所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與體內(nèi)細(xì)胞相同，培養(yǎng)細(xì)胞所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與體內(nèi)細(xì)胞相同，包括糖、氨基酸、維生素、無機(jī)離子、微包括糖、氨基酸、維生素、無機(jī)離子、微量元素等。細(xì)胞在體外生存于含各種營(yíng)養(yǎng)量元素等。細(xì)胞在體外生存于含各種營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中。成分的培養(yǎng)基中。l來自于

13、動(dòng)物體液和分離組織提取的天然培來自于動(dòng)物體液和分離組織提取的天然培養(yǎng)基有血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液養(yǎng)基有血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等，但制作過程復(fù)雜，批間差異大，已逐等，但制作過程復(fù)雜，批間差異大，已逐漸被漸被合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基取代。取代。l按其物質(zhì)狀態(tài)，分半固體培養(yǎng)基（如軟按其物質(zhì)狀態(tài)，分半固體培養(yǎng)基（如軟瓊脂培養(yǎng)基）和液體培養(yǎng)基兩類，其中瓊脂培養(yǎng)基）和液體培養(yǎng)基兩類，其中液體培養(yǎng)基（即培養(yǎng)液）使用最為廣泛。液體培養(yǎng)基（即培養(yǎng)液）使用最為廣泛。目前市場(chǎng)上有多種配制好的細(xì)胞培養(yǎng)液目前市場(chǎng)上有多種配制好的細(xì)胞培養(yǎng)液出售，但價(jià)格較昂貴。實(shí)際工作中多用出售，但價(jià)格較昂貴。實(shí)際工作中多用市售

14、培養(yǎng)基干粉來配制培養(yǎng)液。市售培養(yǎng)基干粉來配制培養(yǎng)液。l配制培養(yǎng)液時(shí)，尚需配制培養(yǎng)液時(shí)，尚需加一定量的動(dòng)物血清加一定量的動(dòng)物血清（胎（胎?；蛐∨Ｑ澹?。配制時(shí)根據(jù)添加血清量的多牛或小牛血清）。配制時(shí)根據(jù)添加血清量的多少，構(gòu)成作用不同的培養(yǎng)液，用于不同細(xì)胞和少，構(gòu)成作用不同的培養(yǎng)液，用于不同細(xì)胞和不同研究目的。一般情況下需添加不同研究目的。一般情況下需添加10 20的血清，以維持細(xì)胞較快的生長(zhǎng)增殖速度，的血清，以維持細(xì)胞較快的生長(zhǎng)增殖速度，稱為稱為生長(zhǎng)培養(yǎng)液生長(zhǎng)培養(yǎng)液；為維持細(xì)胞緩慢生長(zhǎng)或不死，；為維持細(xì)胞緩慢生長(zhǎng)或不死，加加2 5血清含量即可，稱為血清含量即可，稱為維持培養(yǎng)液維持培養(yǎng)液。l此外為

15、防止污染，培養(yǎng)液中尚需此外為防止污染，培養(yǎng)液中尚需加一定量的抗加一定量的抗生素生素（多用青霉素（多用青霉素100單位單位/ml和鏈霉素和鏈霉素100g/ml）。）。1、MEM(minimum essential media)l含有含有12種必需氨基酸、谷氨酰胺，種必需氨基酸、谷氨酰胺，8種維生素及必要的無機(jī)鹽，成種維生素及必要的無機(jī)鹽，成分簡(jiǎn)單，易于分簡(jiǎn)單，易于添加某種特殊成分添加某種特殊成分適應(yīng)某些特殊細(xì)胞的培養(yǎng)。適應(yīng)某些特殊細(xì)胞的培養(yǎng)。2、DMEM（ Dulbeccos modified Eagle medium)l是由是由Dulbecco等人在等人在MEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制而

16、成。相比上研制而成。相比MEM增加了各成分的增加了各成分的用量。分用量。分高糖型和低糖型高糖型和低糖型，各自葡萄糖，各自葡萄糖含量為含量為4500g/L、1000g/L。高糖型有利于。高糖型有利于細(xì)胞停泊于一個(gè)位置生長(zhǎng)，適合于生長(zhǎng)細(xì)胞停泊于一個(gè)位置生長(zhǎng)，適合于生長(zhǎng)較快、附著較困難的腫瘤細(xì)胞。較快、附著較困難的腫瘤細(xì)胞。3、IMDM（Iscoves modified Dulbeccos medium）l含有含有42種成分，較種成分，較DMEM增加了許增加了許多非必須氨基酸及一些維生素，增多非必須氨基酸及一些維生素，增加了加了HEPES，葡萄糖含量為高糖型。，葡萄糖含量為高糖型。適合于細(xì)胞密度較低

17、、細(xì)胞生長(zhǎng)較適合于細(xì)胞密度較低、細(xì)胞生長(zhǎng)較困難的情況，如白細(xì)胞融合之后雜困難的情況，如白細(xì)胞融合之后雜交細(xì)胞的篩選培養(yǎng)，交細(xì)胞的篩選培養(yǎng)，DNA轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選培養(yǎng)?；?xì)胞的篩選培養(yǎng)。4、RPMI1640l其成分較為簡(jiǎn)單，適合于許多種類其成分較為簡(jiǎn)單，適合于許多種類細(xì)胞的生長(zhǎng)，如腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)細(xì)胞的生長(zhǎng)，如腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞、原代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。胞、原代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。RPMI1640是目前應(yīng)用最為廣泛的培是目前應(yīng)用最為廣泛的培養(yǎng)基之一養(yǎng)基之一。5、HamF10、HamG12l特點(diǎn)是在配方中加入了一些微量元特點(diǎn)是在配方中加入了一些微量元素和無機(jī)離子，可以在加入很少血素

18、和無機(jī)離子，可以在加入很少血清的情況下使用，特別適合于進(jìn)行清的情況下使用，特別適合于進(jìn)行單細(xì)胞分離培養(yǎng)。單細(xì)胞分離培養(yǎng)。 HamG12培養(yǎng)基培養(yǎng)基也是無血清培養(yǎng)基中常用的基礎(chǔ)培也是無血清培養(yǎng)基中常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基養(yǎng)基7、McCoys 5AlMcCoys 5A培養(yǎng)基是培養(yǎng)基是McCoy T.A等等人在人在1959年研制成功的，是一種專年研制成功的，是一種專門為肉瘤細(xì)胞設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，后來門為肉瘤細(xì)胞設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，后來發(fā)現(xiàn)它特別適合于原代細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)它特別適合于原代細(xì)胞培養(yǎng)，適合于較難培養(yǎng)的細(xì)胞的生長(zhǎng)。適合于較難培養(yǎng)的細(xì)胞的生長(zhǎng)。l沒有固定標(biāo)準(zhǔn)，以下為參考：沒有固定標(biāo)準(zhǔn)，以下為參考：1、建立某種細(xì)胞

19、株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培、建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基。著可以參考文養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基。著可以參考文獻(xiàn)，或在購(gòu)買細(xì)胞株時(shí)咨詢。獻(xiàn)，或在購(gòu)買細(xì)胞株時(shí)咨詢。2、本實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基不妨試一試，許、本實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基不妨試一試，許多培養(yǎng)基可以適合于多種細(xì)胞。多培養(yǎng)基可以適合于多種細(xì)胞。3、根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來選擇、根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來選擇培養(yǎng)基。如小鼠細(xì)胞株多選擇培養(yǎng)基。如小鼠細(xì)胞株多選擇RPMI1640；進(jìn)行細(xì)胞雜交、基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，可選擇進(jìn)行細(xì)胞雜交、基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，可選擇IMDM。4、用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生、用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，

20、觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，可用生長(zhǎng)曲線、集落形成率等長(zhǎng)狀態(tài)，可用生長(zhǎng)曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣?；?，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。l無血清培養(yǎng)基即不需要添加血清就可維無血清培養(yǎng)基即不需要添加血清就可維持細(xì)胞在體外生長(zhǎng)較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的持細(xì)胞在體外生長(zhǎng)較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的合成培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基。l用于觀察一種生長(zhǎng)因子對(duì)某種細(xì)胞的作用于觀察一種生長(zhǎng)因子對(duì)某種細(xì)胞的作用（這時(shí)需要排除其他生長(zhǎng)因子的干擾，用（這時(shí)需要排除其他生長(zhǎng)因子的干擾，而血清中可能含有各種生長(zhǎng)因子）；或而血清中可能含有各種生長(zhǎng)因子）；或需要測(cè)定某種細(xì)胞

21、在培養(yǎng)過程中分泌某需要測(cè)定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)的能力；或大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)種物質(zhì)的能力；或大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物的時(shí)候。胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物的時(shí)候。l無血清培養(yǎng)基分為無血清培養(yǎng)基分為基礎(chǔ)培養(yǎng)液基礎(chǔ)培養(yǎng)液和和添加組分添加組分兩大部?jī)纱蟛糠?。基礎(chǔ)培養(yǎng)液以分。基礎(chǔ)培養(yǎng)液以HamF12和和DMEM最為常用，最為常用，一般兩者以一般兩者以1:1混合。混合。l添加組分包括：添加組分包括： 1、促貼壁物質(zhì)促貼壁物質(zhì)： 一般是細(xì)胞外基質(zhì)，如纖連蛋白（一般是細(xì)胞外基質(zhì)，如纖連蛋白（FN）、層粘）、層粘連蛋白（連蛋白（LN）等。它們還是重要的分裂素以及）等。它們還是重要的分裂素

22、以及維持正常細(xì)胞功能的分化因子，對(duì)許多細(xì)胞的繁維持正常細(xì)胞功能的分化因子，對(duì)許多細(xì)胞的繁殖和分化，起著重要的作用。殖和分化，起著重要的作用。2、促生長(zhǎng)因子及激素促生長(zhǎng)因子及激素l如表皮生長(zhǎng)因子（如表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（）、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ECGF）等。）等。3、酶抑制劑酶抑制劑l終止胰酶的消化作用，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。終止胰酶的消化作用，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。最常用的是大豆胰酶抑制劑。最常用的是大豆胰酶抑制劑。4、轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白5、微量元素微量元素 硒最為常見。硒最為常見。l1、NaHCO3溶液溶液l2、

23、HEPES液液l 是一種弱酸是一種弱酸羥乙基哌嗪乙硫磺酸。羥乙基哌嗪乙硫磺酸。HEPES對(duì)細(xì)胞無毒性，可防止對(duì)細(xì)胞無毒性，可防止pH值迅速值迅速變動(dòng)變動(dòng)l常用的是青鏈霉素，俗稱常用的是青鏈霉素，俗稱“雙抗溶雙抗溶液液”l青霉素使用的終濃度為青霉素使用的終濃度為0.1g/L。一。一般配成般配成100倍濃縮液，可用倍濃縮液，可用PBS或或培養(yǎng)基配制。培養(yǎng)基配制。l 谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺容易降解，所以都是由于谷氨酰胺容易降解，所以都是使用前添加。谷氨酰胺使用終濃度使用前添加。谷氨酰胺使用終濃度

24、為為0.002mol/L。一般配制為。一般配制為100倍濃倍濃縮液?？s液。1、培養(yǎng)器皿、培養(yǎng)器皿2、培養(yǎng)環(huán)境：、培養(yǎng)環(huán)境：CO2恒溫孵育箱恒溫孵育箱lCO2恒溫孵育箱是目前普遍應(yīng)用的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)恒溫孵育箱是目前普遍應(yīng)用的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備，備，l箱內(nèi)應(yīng)置水槽以維持箱內(nèi)溫度、濕度和避免培箱內(nèi)應(yīng)置水槽以維持箱內(nèi)溫度、濕度和避免培養(yǎng)液蒸發(fā)，養(yǎng)液蒸發(fā)，l蒸餾水需無菌水并應(yīng)加無腐蝕性和無揮發(fā)性的蒸餾水需無菌水并應(yīng)加無腐蝕性和無揮發(fā)性的防腐劑以防生霉。應(yīng)定期對(duì)箱內(nèi)進(jìn)行消毒。防腐劑以防生霉。應(yīng)定期對(duì)箱內(nèi)進(jìn)行消毒。l另外，細(xì)胞培養(yǎng)過程中進(jìn)行換液、傳代等工作另外，細(xì)胞培養(yǎng)過程中進(jìn)行換液、傳代等工作時(shí)需在無菌工作臺(tái)上進(jìn)行

25、。時(shí)需在無菌工作臺(tái)上進(jìn)行。l二氧化碳培養(yǎng)箱二氧化碳培養(yǎng)箱（培養(yǎng)箱）提供箱（培養(yǎng)箱）提供箱內(nèi)一定濃度內(nèi)一定濃度二氧化二氧化碳?xì)怏w和相對(duì)濕度碳?xì)怏w和相對(duì)濕度，創(chuàng)造了細(xì)胞與微生創(chuàng)造了細(xì)胞與微生物正常生命活動(dòng)的物正常生命活動(dòng)的環(huán)境條件，使之在環(huán)境條件，使之在脫離復(fù)雜機(jī)體內(nèi)環(huán)脫離復(fù)雜機(jī)體內(nèi)環(huán)境的直接影響，在境的直接影響，在體外能生長(zhǎng)體外能生長(zhǎng)瀪瀪殖。殖。 l培養(yǎng)箱的結(jié)構(gòu)培養(yǎng)箱的結(jié)構(gòu)l以水套式以水套式CO2CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱為例，培養(yǎng)箱基本有為例，培養(yǎng)箱基本有三壁結(jié)構(gòu)三壁結(jié)構(gòu)箱體、控制箱體、控制中心（包括鍵盤、顯中心（包括鍵盤、顯示器、指示器等）、示器、指示器等）、CO2/O2CO2/O2傳感器、增濕傳感

26、器、增濕盤等。盤等。l可分為單可分為單 雙內(nèi)艙水套培養(yǎng)箱兩種。雙內(nèi)艙水套培養(yǎng)箱兩種。l箱內(nèi)傳感器箱內(nèi)傳感器有熱傳導(dǎo)有熱傳導(dǎo)(T/C(T/C）和紅外（）和紅外（IRIR）傳）傳感器兩種。感器兩種。l水套注入口水套注入口( (用于注滿水用于注滿水) )。 水套排水口水套排水口（在（在水套注滿過程中或熱脹冷縮時(shí)讓空氣逸出，水套注滿過程中或熱脹冷縮時(shí)讓空氣逸出，不能覆蓋）。不能覆蓋）。l水套排氣口水套排氣口（用于迅速排空水套）。（用于迅速排空水套）。l加熱式內(nèi)門（為了保持箱內(nèi)干燥）。加熱式內(nèi)門（為了保持箱內(nèi)干燥）。l箱內(nèi)氣體取樣口箱內(nèi)氣體取樣口（可使用（可使用FyriteFyrite或類似工具或類似工

27、具提取箱內(nèi)樣本的含量）。提取箱內(nèi)樣本的含量）。l1細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)l 原代培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng)，指從供原代培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng)，指從供體取得組織，分離得到所需細(xì)胞體取得組織，分離得到所需細(xì)胞后接種于培養(yǎng)瓶，進(jìn)行首次培養(yǎng)。后接種于培養(yǎng)瓶，進(jìn)行首次培養(yǎng)。細(xì)胞分離細(xì)胞分離原代（初代）培養(yǎng)原代（初代）培養(yǎng)消化法傳代消化法傳代 組織塊剪切組織塊剪切,消化消化法使組織進(jìn)一步法使組織進(jìn)一步分散分散 制備獲得細(xì)胞懸獲得細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)后，加入液計(jì)數(shù)后，加入營(yíng)養(yǎng)液稀釋成一營(yíng)養(yǎng)液稀釋成一定濃度細(xì)胞懸液定濃度細(xì)胞懸液孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)孵箱中進(jìn)行培養(yǎng) 細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)后，計(jì)數(shù)后，加入營(yíng)養(yǎng)加入營(yíng)養(yǎng)液稀釋成液稀釋

28、成一定濃度一定濃度細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液孵箱中進(jìn)孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)行培養(yǎng)將原代細(xì)胞培將原代細(xì)胞培養(yǎng)物用胰酶和養(yǎng)物用胰酶和EDTA消化處理消化處理后，收集后，收集洗滌，洗滌，再分裝至再分裝至 含有含有新鮮營(yíng)養(yǎng)液的新鮮營(yíng)養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng) l 培養(yǎng)材料為血液、羊水、胸水和腹培養(yǎng)材料為血液、羊水、胸水和腹水等細(xì)胞懸液時(shí)，可采用離心法分離。水等細(xì)胞懸液時(shí)，可采用離心法分離。一般用一般用5001000rpm的低轉(zhuǎn)速，時(shí)間約的低轉(zhuǎn)速，時(shí)間約510min。如果一次離心樣品量很多，。如果一次離心樣品量很多，時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)，但離心速度過大、時(shí)時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)，但離心速度過大、時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)擠壓細(xì)胞造成損傷

29、甚至死亡。間過長(zhǎng)，會(huì)擠壓細(xì)胞造成損傷甚至死亡。l 培養(yǎng)材料為組織塊時(shí)，首先要把組培養(yǎng)材料為組織塊時(shí)，首先要把組織塊剪切至盡量小，然后用消化法使組織塊剪切至盡量小，然后用消化法使組織進(jìn)一步分散，以獲得細(xì)胞懸液。對(duì)細(xì)織進(jìn)一步分散，以獲得細(xì)胞懸液。對(duì)細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎、上皮、胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎、上皮、肝、腎等可用胰蛋白酶消化；對(duì)于纖維肝、腎等可用胰蛋白酶消化；對(duì)于纖維性組織和較硬的上皮組織、癌組織等可性組織和較硬的上皮組織、癌組織等可使用膠原酶消化。使用膠原酶消化。l胰酶（胰酶（Trypsin）：）：0.1%0.25%，用，用D-HanKS液配制，最佳液配制，最佳pH89lEDTA

30、 ：0.02%，作用于細(xì)胞間連接尤其對(duì)，作用于細(xì)胞間連接尤其對(duì)貼壁的細(xì)胞適用貼壁的細(xì)胞適用l膠原酶（膠原酶（Collagenase）：）：0.10.3mg/L(20萬萬u/L)， pH6.5，Ca2+，Mg2+不抑制其活性，不抑制其活性，作用于膠原組織，適用于上皮類原代細(xì)胞。作用于膠原組織，適用于上皮類原代細(xì)胞。l細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)分離稀釋后傳到新的細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過程稱之為傳代；進(jìn)行一次分培養(yǎng)瓶的過程稱之為傳代；進(jìn)行一次分離培養(yǎng)稱之為傳一代。離培養(yǎng)稱之為傳一代。 培養(yǎng)細(xì)胞傳代根培養(yǎng)細(xì)胞傳代根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法。據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法。l貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞多用消化法

31、傳代，傳代貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞多用消化法傳代，傳代中常用到二乙烯四乙酸二鈉（中常用到二乙烯四乙酸二鈉（EDTA）。）。EDTA能從組織生存環(huán)境中吸取能從組織生存環(huán)境中吸取Ca2+、Mg2+，這些離子是維持組織完整的重要，這些離子是維持組織完整的重要因素。但因素。但EDTA單獨(dú)使用不能使細(xì)胞完單獨(dú)使用不能使細(xì)胞完全分散，因而常與胰蛋白酶按不同比例全分散，因而常與胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果較好?；旌鲜褂?，效果較好。l吸除或倒掉瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液，向瓶?jī)?nèi)加入少量約吸除或倒掉瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液，向瓶?jī)?nèi)加入少量約12ml消化液（一般含胰蛋白酶、消化液（一般含胰蛋白酶、EDTA），），輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有

32、細(xì)胞表面；輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面；l然后在然后在37環(huán)境下孵育環(huán)境下孵育1-3min，把培養(yǎng)瓶放置，把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即倒掉消化液，加入增大后，應(yīng)立即倒掉消化液，加入Hanks液沖液沖洗一次以終止消化；洗一次以終止消化；l然后加入少許培養(yǎng)液，用彎頭吸管吸取瓶?jī)?nèi)培然后加入少許培養(yǎng)液，用彎頭吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之脫落形成細(xì)胞養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之脫落形成細(xì)胞懸液，以懸液，以1：2或或1：3的比例接種在新的培養(yǎng)瓶的比例接種在新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。內(nèi)。l懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞可直接添加新鮮

33、懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞可直接添加新鮮培養(yǎng)液，或離心收集，接種到新培養(yǎng)液，或離心收集，接種到新培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)瓶。l通常在通常在45天需傳代，一般以天需傳代，一般以1:4稀釋傳代。稀釋傳代。l培養(yǎng)細(xì)胞在傳代中性質(zhì)易發(fā)生改變培養(yǎng)細(xì)胞在傳代中性質(zhì)易發(fā)生改變, 有支有支原體污染的危險(xiǎn)。研究工作也要求細(xì)胞原體污染的危險(xiǎn)。研究工作也要求細(xì)胞株的代數(shù)應(yīng)維持在一定期限內(nèi)。解決這株的代數(shù)應(yīng)維持在一定期限內(nèi)。解決這些困難的方法就是將細(xì)胞凍存，需要的些困難的方法就是將細(xì)胞凍存，需要的時(shí)候再行復(fù)蘇。細(xì)胞凍存在液氮中，從時(shí)候再行復(fù)蘇。細(xì)胞凍存在液氮中，從理論上講貯存時(shí)間是無限的理論上講貯存時(shí)間是無限的。l在不加保護(hù)條件下直接凍存細(xì)

34、胞時(shí)，細(xì)在不加保護(hù)條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水會(huì)形成胞內(nèi)和外環(huán)境中的水會(huì)形成結(jié)晶結(jié)晶，能導(dǎo)，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列變化而引起細(xì)胞死致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列變化而引起細(xì)胞死亡。亡。l如向培養(yǎng)基中加入如向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑保護(hù)劑甘油或二甲基甘油或二甲基亞砜（亞砜（DMSO），可使冰點(diǎn)降低，在緩），可使冰點(diǎn)降低，在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外。結(jié)前透出細(xì)胞外。l溶解細(xì)胞時(shí)，速度要快，使之迅速通溶解細(xì)胞時(shí)，速度要快，使之迅速通過細(xì)胞最易受損的過細(xì)胞最易受損的50后，細(xì)后，細(xì)胞仍能生長(zhǎng)，活力不受任何損害。胞仍能生長(zhǎng)，活力不受任何損害。l細(xì)胞

35、凍存與復(fù)蘇的原則是細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的原則是“慢凍快慢凍快融融”。凍存時(shí)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，凍存時(shí)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用常規(guī)方法收集細(xì)胞。在液氮中可長(zhǎng)用常規(guī)方法收集細(xì)胞。在液氮中可長(zhǎng)期保存期保存。l凍存細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，將凍存于液氮中凍存細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，將凍存于液氮中的凍存管取出，迅速放入的凍存管取出，迅速放入3740水浴中使其在水浴中使其在1min內(nèi)融化。在無菌內(nèi)融化。在無菌條件下打開凍存管，取出細(xì)胞懸液條件下打開凍存管，取出細(xì)胞懸液至離心管中，補(bǔ)加至離心管中，補(bǔ)加10ml培養(yǎng)液，培養(yǎng)液，5001000rpm低速離心低速離心5min，去上，去上清，加入新鮮培養(yǎng)液適量，轉(zhuǎn)入培清，加入新鮮培養(yǎng)液適量，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)

36、瓶中置養(yǎng)瓶中置37培養(yǎng)。培養(yǎng)。l細(xì)胞培養(yǎng)過程中操作不當(dāng)時(shí)，易引發(fā)微細(xì)胞培養(yǎng)過程中操作不當(dāng)時(shí)，易引發(fā)微生物污染。微生物污染一旦明確，多數(shù)生物污染。微生物污染一旦明確，多數(shù)將無法救治。為了防止污染的蔓延，還將無法救治。為了防止污染的蔓延，還應(yīng)及時(shí)丟棄污染細(xì)胞。應(yīng)及時(shí)丟棄污染細(xì)胞。l（1）霉菌和細(xì)菌污染）霉菌和細(xì)菌污染 霉菌和細(xì)菌繁殖霉菌和細(xì)菌繁殖迅速，能在很短的時(shí)間內(nèi)壓制細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，能在很短的時(shí)間內(nèi)壓制細(xì)胞生長(zhǎng)或排出有毒物質(zhì)殺滅細(xì)胞，因此霉菌和或排出有毒物質(zhì)殺滅細(xì)胞，因此霉菌和細(xì)菌污染較易發(fā)現(xiàn)。細(xì)菌污染較易發(fā)現(xiàn)。l霉菌污染后多在培養(yǎng)液中形成白色或淺霉菌污染后多在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色飄浮物，一

37、般肉眼可見，較易被發(fā)黃色飄浮物，一般肉眼可見，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不混濁，倒置顯微現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不混濁，倒置顯微鏡下可見于細(xì)胞之間有縱橫交錯(cuò)穿行的鏡下可見于細(xì)胞之間有縱橫交錯(cuò)穿行的絲狀、管狀及樹枝狀菌絲，并懸浮飄蕩絲狀、管狀及樹枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中；很多菌絲在高倍鏡下可見在培養(yǎng)液中；很多菌絲在高倍鏡下可見到有鏈狀排列的菌珠；念珠菌或酵母菌到有鏈狀排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間形態(tài)呈卵形，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長(zhǎng)。生長(zhǎng)。l細(xì)菌污染后培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，細(xì)菌污染后培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，出現(xiàn)明表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，出現(xiàn)明

38、顯混濁現(xiàn)象；有時(shí)靜置的培養(yǎng)瓶液顯混濁現(xiàn)象；有時(shí)靜置的培養(yǎng)瓶液體初看不混，但稍加震蕩，就有很體初看不混，但稍加震蕩，就有很多混濁物漂起；倒置顯微鏡下觀察，多混濁物漂起；倒置顯微鏡下觀察，可見培養(yǎng)液中有大量細(xì)小的圓球狀可見培養(yǎng)液中有大量細(xì)小的圓球狀顆粒飄浮，有時(shí)在細(xì)胞表面和周圍顆粒飄浮，有時(shí)在細(xì)胞表面和周圍有大量細(xì)菌存在，細(xì)胞生長(zhǎng)停止并有大量細(xì)菌存在，細(xì)胞生長(zhǎng)停止并有中毒表現(xiàn)有中毒表現(xiàn)。l支原體污染是一個(gè)常見而又棘手的問題。支原支原體污染是一個(gè)常見而又棘手的問題。支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間（最小直徑體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間（最小直徑0.2m）并獨(dú)立生活的微生物，因此可通過濾菌）并獨(dú)立

39、生活的微生物，因此可通過濾菌器，支原體對(duì)熱敏感但對(duì)一般抗生素不敏感。器，支原體對(duì)熱敏感但對(duì)一般抗生素不敏感。支原體污染細(xì)胞后，培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁，多支原體污染細(xì)胞后，培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁，多數(shù)情況下細(xì)胞病理變化輕微或不顯著，細(xì)微變數(shù)情況下細(xì)胞病理變化輕微或不顯著，細(xì)微變化也可由于傳代、換液而緩解，因此易被忽視?；部捎捎趥鞔?、換液而緩解，因此易被忽視。實(shí)際上細(xì)胞已受到各方面潛在的影響，如細(xì)胞實(shí)際上細(xì)胞已受到各方面潛在的影響，如細(xì)胞變性、變性、DNA合成受影響等。個(gè)別嚴(yán)重者，可致合成受影響等。個(gè)別嚴(yán)重者，可致細(xì)胞增殖緩慢，甚至從培養(yǎng)器皿脫落。細(xì)胞增殖緩慢，甚至從培養(yǎng)器皿脫落。l相差顯微鏡檢測(cè)相差顯

40、微鏡檢測(cè) 將細(xì)胞接種于事先放置于將細(xì)胞接種于事先放置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的蓋玻片上，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的蓋玻片上，24h后取出，用相差油后取出，用相差油鏡觀察，支原體呈暗色微小顆粒位于細(xì)胞表面鏡觀察，支原體呈暗色微小顆粒位于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間，類似布朗運(yùn)動(dòng)。和細(xì)胞之間，類似布朗運(yùn)動(dòng)。l熒光染色法熒光染色法 熒光染色用能與熒光染色用能與DNA特異性結(jié)特異性結(jié)合的熒光染料合的熒光染料Hoechst 33258，可使支原體內(nèi)含，可使支原體內(nèi)含有的有的DNA著色，據(jù)此可檢測(cè)支原體。固定細(xì)胞著色，據(jù)此可檢測(cè)支原體。固定細(xì)胞以以Hoechst 33258染色，然后置熒光顯微鏡下觀染色，然后置熒光顯微鏡下觀察。鏡下支原體為散在

41、于細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞察。鏡下支原體為散在于細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點(diǎn)。膜表面的亮綠色小點(diǎn)。l電鏡檢測(cè)電鏡檢測(cè) 用掃描電鏡方法簡(jiǎn)便快用掃描電鏡方法簡(jiǎn)便快速，也可以利用透射電鏡。速，也可以利用透射電鏡。lDNA分子雜交檢查或支原體培養(yǎng)分子雜交檢查或支原體培養(yǎng)等方法等方法 檢出率高，但方法較復(fù)雜檢出率高，但方法較復(fù)雜。l 傳代細(xì)胞帶有潛伏病毒。傳代細(xì)胞帶有潛伏病毒。Hela-HPV18,HSV,逆轉(zhuǎn)錄病毒等以前病毒形逆轉(zhuǎn)錄病毒等以前病毒形式整合細(xì)胞式整合細(xì)胞DNA?？赏ㄟ^細(xì)胞直接觀?？赏ㄟ^細(xì)胞直接觀察（察（血細(xì)胞吸附、包涵體等血細(xì)胞吸附、包涵體等）、動(dòng)物）、動(dòng)物接種、異種組織培養(yǎng)物生長(zhǎng)、電

42、鏡觀接種、異種組織培養(yǎng)物生長(zhǎng)、電鏡觀察、免疫學(xué)方法及察、免疫學(xué)方法及PCR方法檢查方法檢查l防止污染，預(yù)防是關(guān)鍵防止污染，預(yù)防是關(guān)鍵1、器皿準(zhǔn)備中的預(yù)防、器皿準(zhǔn)備中的預(yù)防2、操作前的預(yù)防：超凈工作臺(tái)，培養(yǎng)皿，、操作前的預(yù)防：超凈工作臺(tái)，培養(yǎng)皿，培養(yǎng)液，操作者培養(yǎng)液，操作者3、操作過程中的預(yù)防：瓶口不能于工作臺(tái)、操作過程中的預(yù)防：瓶口不能于工作臺(tái)風(fēng)向逆向；火焰燒灼滅菌，專管專用，風(fēng)向逆向；火焰燒灼滅菌，專管專用，試管斜位，不要交談，完畢后整理、清試管斜位，不要交談，完畢后整理、清掃掃1、抗生素排除：聯(lián)合用藥，預(yù)防性應(yīng)用比、抗生素排除：聯(lián)合用藥，預(yù)防性應(yīng)用比污染后使用更好污染后使用更好2、加溫除菌

43、：、加溫除菌：41oC，510h3、動(dòng)物接種、動(dòng)物接種4、與、與共培養(yǎng)共培養(yǎng)l上皮組織上皮組織l內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴內(nèi)皮血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞l單層柱狀上皮細(xì)胞單層柱狀上皮細(xì)胞胃粘膜上皮細(xì)胞，胃粘膜上皮細(xì)胞，腸粘膜上皮細(xì)胞，假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上腸粘膜上皮細(xì)胞，假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮細(xì)胞皮細(xì)胞l復(fù)層上皮細(xì)胞復(fù)層上皮細(xì)胞表皮細(xì)胞，食管粘膜表皮細(xì)胞，食管粘膜上皮細(xì)胞上皮細(xì)胞l成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞l 細(xì)胞：腹腔，肺泡，肥大細(xì)胞，細(xì)胞：腹腔，肺泡，肥大細(xì)胞，血細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，血細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，骨細(xì)胞骨細(xì)胞l脂肪細(xì)胞脂肪細(xì)胞l心肌細(xì)胞心肌細(xì)胞l平滑肌細(xì)胞平滑肌細(xì)胞l骨骼肌

44、細(xì)胞骨骼肌細(xì)胞l神經(jīng)組織，神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)神經(jīng)組織，神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞，胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞，Schwann細(xì)胞細(xì)胞l脂肪細(xì)胞脂肪細(xì)胞l除此之外，尚有器官培養(yǎng)（胚除此之外，尚有器官培養(yǎng)（胚胎干、神經(jīng)干、造血干、間光胎干、神經(jīng)干、造血干、間光質(zhì)干、表皮組織干、胰島干細(xì)質(zhì)干、表皮組織干、胰島干細(xì)胞培養(yǎng)）等技術(shù)胞培養(yǎng)）等技術(shù)人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞（凋亡）人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞（凋亡）人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞l生物體是一個(gè)高度統(tǒng)一的整體，而細(xì)胞生物學(xué)的生物體是一個(gè)高度統(tǒng)一的整體，而細(xì)胞生物學(xué)的主要對(duì)象是生物體內(nèi)的各種細(xì)胞，很顯然，在整主要對(duì)象是生物體內(nèi)的各種細(xì)胞，很顯然，在整體條件下研究單個(gè)

45、細(xì)胞或某一細(xì)胞群在體內(nèi)（體條件下研究單個(gè)細(xì)胞或某一細(xì)胞群在體內(nèi)（in vivo）的功能活動(dòng)是非常困難的。）的功能活動(dòng)是非常困難的。細(xì)胞培養(yǎng)的意細(xì)胞培養(yǎng)的意義義主要在于兩點(diǎn)，其一是人工培養(yǎng)條件易于改變主要在于兩點(diǎn)，其一是人工培養(yǎng)條件易于改變并能嚴(yán)格控制，便于研究各種因素對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、并能嚴(yán)格控制，便于研究各種因素對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能和各種生命活動(dòng)規(guī)律的影響；其二是細(xì)胞在功能和各種生命活動(dòng)規(guī)律的影響；其二是細(xì)胞在體外培養(yǎng)環(huán)境中可以長(zhǎng)期存活和傳代，可以比較體外培養(yǎng)環(huán)境中可以長(zhǎng)期存活和傳代，可以比較經(jīng)濟(jì)地、大量地提供在同一時(shí)期、條件相同、性經(jīng)濟(jì)地、大量地提供在同一時(shí)期、條件相同、性狀相似的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)樣

46、本。因此，大量生物醫(yī)狀相似的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)樣本。因此，大量生物醫(yī)學(xué)研究工作依賴于細(xì)胞培養(yǎng)，許多重要的發(fā)現(xiàn)都學(xué)研究工作依賴于細(xì)胞培養(yǎng)，許多重要的發(fā)現(xiàn)都基于培養(yǎng)細(xì)胞的工作。基于培養(yǎng)細(xì)胞的工作。l細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也存在著一定局限性，主細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也存在著一定局限性，主要是細(xì)胞離體以后失去與體內(nèi)環(huán)境的密要是細(xì)胞離體以后失去與體內(nèi)環(huán)境的密切聯(lián)系，失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和不同切聯(lián)系，失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和不同細(xì)胞間的相互作用，特定分化基因的表細(xì)胞間的相互作用，特定分化基因的表達(dá)減弱或停止，而進(jìn)化中保守的細(xì)胞生達(dá)減弱或停止，而進(jìn)化中保守的細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖活動(dòng)卻可維持，遂使體內(nèi)外細(xì)長(zhǎng)和增殖活動(dòng)卻可維持，遂使體內(nèi)外細(xì)胞出

47、現(xiàn)了差異，這是應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)胞出現(xiàn)了差異，這是應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)該注意的問題。應(yīng)該注意的問題。l細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)除經(jīng)典地用于細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、功細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)除經(jīng)典地用于細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能和細(xì)胞活動(dòng)研究以外，還成為近年發(fā)展起來能和細(xì)胞活動(dòng)研究以外，還成為近年發(fā)展起來的細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)，也就是說細(xì)胞培養(yǎng)技的細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)，也就是說細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)重要應(yīng)用就是各種細(xì)胞工程技術(shù)。因此在此術(shù)重要應(yīng)用就是各種細(xì)胞工程技術(shù)。因此在此對(duì)這些相關(guān)技術(shù)作一簡(jiǎn)介。對(duì)這些相關(guān)技術(shù)作一簡(jiǎn)介。l一般地，一般地，細(xì)胞工程細(xì)胞工程指應(yīng)用各種手段對(duì)細(xì)胞不同指應(yīng)用各種手段對(duì)細(xì)胞不同結(jié)構(gòu)層次結(jié)構(gòu)層次(整體、細(xì)胞器、核、基因等整體、細(xì)胞

48、器、核、基因等)進(jìn)行改進(jìn)行改造，如進(jìn)行細(xì)胞融合、核移植、基因轉(zhuǎn)移等，造，如進(jìn)行細(xì)胞融合、核移植、基因轉(zhuǎn)移等，以獲得具有特定生物學(xué)特性的細(xì)胞。以獲得具有特定生物學(xué)特性的細(xì)胞。l在細(xì)胞自然生長(zhǎng)情況下，或在其他人為添加因在細(xì)胞自然生長(zhǎng)情況下，或在其他人為添加因素存在下，使同種細(xì)胞之間或不同種類細(xì)胞之素存在下，使同種細(xì)胞之間或不同種類細(xì)胞之間相互融合的過程，即為細(xì)胞融合（間相互融合的過程，即為細(xì)胞融合（cell fusion）。通過細(xì)胞融合，可將來源于不同細(xì)）。通過細(xì)胞融合，可將來源于不同細(xì)胞核的染色體結(jié)合到同一個(gè)核內(nèi)，結(jié)果形成一胞核的染色體結(jié)合到同一個(gè)核內(nèi)，結(jié)果形成一個(gè)合核體的雜種細(xì)胞。在實(shí)際工作中

49、常采用各個(gè)合核體的雜種細(xì)胞。在實(shí)際工作中常采用各種促融合手段，包括病毒類融合劑如仙臺(tái)病毒、種促融合手段，包括病毒類融合劑如仙臺(tái)病毒、化學(xué)融合劑如聚乙二醇（化學(xué)融合劑如聚乙二醇（PEG）及電激融合法）及電激融合法等。等。l在進(jìn)行細(xì)胞融合反應(yīng)和適當(dāng)時(shí)間的培養(yǎng)在進(jìn)行細(xì)胞融合反應(yīng)和適當(dāng)時(shí)間的培養(yǎng)后，需要通過一定方法對(duì)兩種親本細(xì)胞后，需要通過一定方法對(duì)兩種親本細(xì)胞融合產(chǎn)生的具有增殖能力的雜種細(xì)胞進(jìn)融合產(chǎn)生的具有增殖能力的雜種細(xì)胞進(jìn)行篩選。篩選方法主要包括藥物抗性篩行篩選。篩選方法主要包括藥物抗性篩選、營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選和溫度敏感性篩選等。選、營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選和溫度敏感性篩選等。l細(xì)胞融合最典型的應(yīng)用是單克隆抗體技

50、術(shù)。細(xì)胞融合最典型的應(yīng)用是單克隆抗體技術(shù)。1975年年Koehler和和Milstein將用綿羊紅細(xì)胞免疫將用綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞和體外培養(yǎng)能長(zhǎng)期繁殖的小鼠骨的小鼠脾細(xì)胞和體外培養(yǎng)能長(zhǎng)期繁殖的小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，獲得了具有兩種親本細(xì)胞特性髓瘤細(xì)胞融合，獲得了具有兩種親本細(xì)胞特性的雜交細(xì)胞，即既能在培養(yǎng)條件下長(zhǎng)期生長(zhǎng)增的雜交細(xì)胞，即既能在培養(yǎng)條件下長(zhǎng)期生長(zhǎng)增殖，又能分泌特異的抗綿羊紅細(xì)胞的抗體的殖，又能分泌特異的抗綿羊紅細(xì)胞的抗體的B淋巴細(xì)胞雜交瘤。細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展和骨髓淋巴細(xì)胞雜交瘤。細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展和骨髓瘤細(xì)胞株的建成促成了瘤細(xì)胞株的建成促成了B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的建細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的建

51、立和單克隆抗體技術(shù)的成功。立和單克隆抗體技術(shù)的成功。l細(xì)胞核移植細(xì)胞核移植（nuclear transfer）是指將）是指將一個(gè)雙倍體的細(xì)胞核（可來自胚胎細(xì)胞一個(gè)雙倍體的細(xì)胞核（可來自胚胎細(xì)胞或體細(xì)胞）移植到去核的成熟卵母細(xì)胞或體細(xì)胞）移植到去核的成熟卵母細(xì)胞或受精卵中。重組的卵細(xì)胞可以植入母或受精卵中。重組的卵細(xì)胞可以植入母體，并能發(fā)育為與供核細(xì)胞基因型相同體，并能發(fā)育為與供核細(xì)胞基因型相同的后代，因此又稱為動(dòng)物克隆技術(shù)。的后代，因此又稱為動(dòng)物克隆技術(shù)。1997年誕生的克隆羊年誕生的克隆羊“多利多利”就是體細(xì)就是體細(xì)胞核移植技術(shù)的產(chǎn)物。胞核移植技術(shù)的產(chǎn)物。l核移植技術(shù)首先是選取合適的受體去核

52、卵細(xì)胞核移植技術(shù)首先是選取合適的受體去核卵細(xì)胞和供體核。目前均以發(fā)育至減數(shù)分裂中期和供體核。目前均以發(fā)育至減數(shù)分裂中期II的的成熟卵母細(xì)胞為受體，供體核則可以采用胚胎成熟卵母細(xì)胞為受體，供體核則可以采用胚胎細(xì)胞、未分化的原始生殖細(xì)胞、胎兒細(xì)胞乃至細(xì)胞、未分化的原始生殖細(xì)胞、胎兒細(xì)胞乃至高度分化的成年動(dòng)物細(xì)胞。核質(zhì)融合一般是將高度分化的成年動(dòng)物細(xì)胞。核質(zhì)融合一般是將獲得的核轉(zhuǎn)移到已經(jīng)人工去核的成熟卵母細(xì)胞獲得的核轉(zhuǎn)移到已經(jīng)人工去核的成熟卵母細(xì)胞卵周隙后，施加微電流脈沖，使核質(zhì)融合，形卵周隙后，施加微電流脈沖，使核質(zhì)融合，形成一個(gè)重組卵。重組卵需經(jīng)一定時(shí)間的體外培成一個(gè)重組卵。重組卵需經(jīng)一定時(shí)間的體外培養(yǎng)，或放入中間受體動(dòng)物輸卵管內(nèi)孵育，經(jīng)過養(yǎng)，或放入中間受體動(dòng)物輸卵管內(nèi)孵育，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)，有的動(dòng)物需形成桑椹胚或囊一段時(shí)間的培養(yǎng)，有的動(dòng)物需形成桑椹胚或囊胚，再植入受體子宮里。胚，再植入受體子宮里。l基因轉(zhuǎn)移指向受體細(xì)胞中導(dǎo)入外源基因，基因轉(zhuǎn)移指向受體細(xì)胞中導(dǎo)入外源基因，是改造細(xì)胞遺傳性狀的常用手段。一般是改造細(xì)胞遺傳性狀的常用手段。一般情況下，能穩(wěn)定接納外