糖醛酸測(cè)定方法

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上糖醛酸測(cè)定方法一間羥基聯(lián)苯比色法1.原理：多聚己糖醛酸與含四硼酸鈉的硫酸溶液在高溫作用下水解, 水解產(chǎn)物進(jìn)一步與間羥基聯(lián)苯反應(yīng), 生成粉紅色衍生物, 產(chǎn)生紫外吸收, 且在一定濃度范圍內(nèi), 該衍生物吸收值與糖醛酸含量呈線性關(guān)系, 可通過(guò)比色法對(duì)糖醛酸含量進(jìn)行計(jì)算。2.試劑配制：間羥基聯(lián)苯溶液：稱取0.15g間羥基聯(lián)苯溶于5 mg/mL氫氧化鈉溶液中, 定容至100mL, 其質(zhì)量濃度為1.5mg/mL.四硼酸鈉/硫酸溶液： 0.478g四硼酸鈉溶于100mL濃硫酸中, 備用。葡萄糖溶液：稱取葡萄糖25.00mg,加水溶解并定容至25mL混勻, 成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。(

2、排除中性糖對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響)半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取干燥至恒重的半乳糖醛酸25.00 mg, 加水溶解并定容至25mL, 混勻, 成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。3. 波長(zhǎng)掃描：取半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50mL, 置10 mL容量瓶中, 用水定容至刻度, 搖勻( 質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL）。量取溶液1.00 mL 置于20 mL具塞試管, 置冰水浴中, 加入四硼酸鈉/硫酸溶液6 mL, 待全部加完后, 用旋渦混合器混勻, 于沸水浴中加熱5 min, 冰水浴中冷卻后用微量加樣槍加入1.5 mg/mL間羥基聯(lián)苯溶液100 L, 混勻后振搖5 min, 超聲除去氣泡。以1 mL蒸餾水同上操作制得空白

3、液調(diào)零, 用UV-2450 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在200 nm 800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描, 確定最大吸收波長(zhǎng)。4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取1mg/mL 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL和0.6 mL置于10 mL容量瓶中, 加水定容, 再分別取上述各配制溶液1.0mL至于20mL具塞試管，置冰水浴中, 加入四硼酸鈉/硫酸溶液6 mL, 待全部加完后, 用旋渦混合器混勻, 于沸水浴中加熱5 min, 冰水浴中冷卻后用微量加樣槍加入1.5 mg/mL間羥基聯(lián)苯溶液100 L, 混勻后振搖5 min, 超聲除去氣泡。以1 mL蒸餾水同上操作制得空白

4、液調(diào)零,在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。5. 樣品測(cè)定：取樣品5 mg置100 mL容量瓶, 加水溶解定容至刻度。取溶液1.00 mL按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)方法操作。6. 中性糖影響：在一定濃度半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中, 添加不同質(zhì)量的中性糖（以葡萄糖為例）, 測(cè)得加入不同質(zhì)量濃度的中性糖對(duì)半乳糖醛酸溶液吸光度的影響。2 高效液相色譜法A1.標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備： 精密稱取半乳糖醛酸對(duì)照品205. 4 mg,置50mL容量瓶中,加超純水溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得(每1 mL中含半乳糖醛酸4. 108 mg) 。精密吸取上述對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0mL置于25

5、mL容量瓶中,加超純水稀釋至刻度,搖勻,制得0.、0.、0.、0.、0.18216、0.、1.、1.、1. mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制： 取配制好的半乳糖醛酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別進(jìn)樣20L,按下面色譜條件測(cè)定半乳糖醛酸峰面積,以半乳糖醛酸峰面積為縱坐標(biāo), 對(duì)照品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求得回歸方程。3.色譜條件 色譜柱: Sugar-Pak (300 mm ×6. 5 mm) ,流動(dòng)相: 0. 0001 mol/L EDTA水溶液,流速: 0. 6 mL /min,示差檢測(cè)器,柱溫: 90 ,示差檢測(cè)池溫度: 40 ,進(jìn)樣量: 20L。理論板數(shù):以半

6、乳糖醛酸峰計(jì)算,不得低于3000。高效液相色譜法B 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SAX 4.6×250mm 5-Micron Agilent ； 柱溫：40；流動(dòng)相：0.7mol/l乙酸；流速：1.0ml/min；測(cè)定波長(zhǎng)：示差檢測(cè)；示差檢測(cè)器溫度：40；進(jìn)樣量：20L。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取古洛糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品，用重蒸水溶解，配制成濃度為1.07、2.14、3.21、5.35、10.7mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別進(jìn)樣10L進(jìn)行HPLC測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸。 樣品處理與檢測(cè)：準(zhǔn)確稱取300mg（精確至±0.0001）海藻

7、酸鈉或者海藻，加入72%硫酸溶液3.5mL，于研缽中研磨2h，用100mL 蒸餾水將其轉(zhuǎn)移至250mL三角瓶，100沸水浴加熱2.5h，于自來(lái)水中冷卻至室溫，加入過(guò)量BaCO3粉末，充分反應(yīng)至溶液pH 為7左右，3000r/min離心，沉淀用150mL 蒸餾水洗滌3次，將上清液和洗滌液合并在一起，45真空旋轉(zhuǎn)濃縮后，定容至10mL，進(jìn)樣10L進(jìn)行HPLC測(cè)定。依據(jù)樣品測(cè)定的峰面積和出峰時(shí)間，在相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線查出所測(cè)組分的量，結(jié)合所取樣品的質(zhì)量和定容體積，計(jì)算出各組分的含量。三咔唑硫酸比色法（修改后）1. 原理：在硫酸中與咔唑試劑發(fā)生縮合反應(yīng)，生成紫紅色化合物，其呈色強(qiáng)度與半乳糖醛酸含量成正比，

8、可比色定量。2. 對(duì)照品溶液的配制：精密稱取干燥至恒重的半乳糖醛酸19. 8 mg，用適量的蒸餾水溶解，并定容于100 ml 容量瓶中，配成198 g /ml 的對(duì)照品溶液。使用時(shí)稀釋至99g/ml。 四硼酸鈉-硫酸溶液的配制:精密稱取0.956 g 四硼酸鈉溶解于200 ml 濃硫酸中，超聲溶解，備用。 咔唑溶液的配制：精密稱取咔唑100 mg，溶解于100 ml無(wú)水乙醇中，配制成0.1%的咔唑溶液備用。4. 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：分別精密吸取對(duì)照品0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml溶液置于10 ml 具塞試管中，各管加水至0.5 ml，分別在冰水浴中加入四硼酸鈉 硫酸溶液3ml，用漩渦混合器混勻，于沸水浴中加熱5 min，取出后立即冷卻至室溫，加0.1%咔唑溶液0.1 ml，搖勻，煮沸5min，冷卻至室溫后在530nm處測(cè)定其吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。方法學(xué)考察：精密度試驗(yàn)取同