大腸桿菌培養(yǎng)基的優(yōu)化及發(fā)酵罐操作

1、大腸桿菌高密度發(fā)酵大腸桿菌高密度發(fā)酵第二組小組長：李青小組成員：韓嬌月、李洋、馮春紅、胡建 貝、倪娜娜、常亞培、許志揚、李瑞兵、郭榮欣目錄目錄大腸桿菌大腸桿菌高密度發(fā)酵高密度發(fā)酵培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基配置培養(yǎng)基配置培養(yǎng)方式培養(yǎng)方式培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件操作流程操作流程具體步驟具體步驟參數控制參數控制注意事項注意事項大腸桿菌 大腸桿菌是基因工程中常用大腸桿菌是基因工程中常用的宿主菌的宿主菌,許多有價值的多肽和許多有價值的多肽和蛋白在大腸桿菌中已成功地進蛋白在大腸桿菌中已成功地進行了表達行了表達,表達水平有些高達細表達水平有些高達細胞總蛋白的胞總蛋白的30%以上以上. 大腸桿大腸桿菌作為外源基因表達

2、的宿主菌作為外源基因表達的宿主,由由于具有遺傳背景清楚于具有遺傳背景清楚,目的基因目的基因表達水平高表達水平高,技術操作、培養(yǎng)條技術操作、培養(yǎng)條件簡單件簡單,抗污染能力強抗污染能力強,大規(guī)模大規(guī)模發(fā)酵經濟等優(yōu)點發(fā)酵經濟等優(yōu)點,倍受遺傳工程倍受遺傳工程專家重視專家重視,是目前應用最廣泛是目前應用最廣泛,最成功的表達體系最成功的表達體系.高密度培養(yǎng)技術高密度培養(yǎng)技術 高密度培養(yǎng)技術：是應用一定的培養(yǎng)高密度培養(yǎng)技術：是應用一定的培養(yǎng)技術和設備來提高菌體生物量和目標產物技術和設備來提高菌體生物量和目標產物時空產率的發(fā)酵技術。時空產率的發(fā)酵技術。 利用一般的發(fā)酵工藝生產大腸桿菌或以其組利用一般的發(fā)酵工藝

3、生產大腸桿菌或以其組建的基因工程菌的表達產物建的基因工程菌的表達產物,大腸桿菌的生物量大腸桿菌的生物量,表達產物在菌體內和發(fā)酵液中的濃度比較低表達產物在菌體內和發(fā)酵液中的濃度比較低,難以難以獲得理想的生產效率和經濟效益。應用高密度發(fā)獲得理想的生產效率和經濟效益。應用高密度發(fā)酵不但可獲得較高的生物量酵不但可獲得較高的生物量,而且可顯著提高目的而且可顯著提高目的基因表達產物的濃度。高密度發(fā)酵對發(fā)酵設備有基因表達產物的濃度。高密度發(fā)酵對發(fā)酵設備有較高的要求較高的要求,而且對發(fā)酵條件也有非常高的要求。而且對發(fā)酵條件也有非常高的要求。影響高密度發(fā)酵的因素非常多影響高密度發(fā)酵的因素非常多,如細菌生長所需的

4、如細菌生長所需的營養(yǎng)物質、發(fā)酵過程中生長抑制物的積累、溶氧營養(yǎng)物質、發(fā)酵過程中生長抑制物的積累、溶氧濃度、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵液的濃度、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵液的pH 值、補料方式及值、補料方式及發(fā)酵液流變學特性等。發(fā)酵液流變學特性等。 大腸桿菌高密度培養(yǎng)最關鍵的問題是代謝副產物大腸桿菌高密度培養(yǎng)最關鍵的問題是代謝副產物乙酸積累所引起的抑制和毒害作用。乙酸積累所引起的抑制和毒害作用。 預防措施：預防措施： 1、通過控制比生長速率來減少乙酸的產生：比生長、通過控制比生長速率來減少乙酸的產生：比生長速率越高，乙酸產生越多，當比生長速率超過某個值速率越高，乙酸產生越多，當比生長速率超過某個值時，乙酸開始產生?？梢?/p>

5、通過降低溫度，調節(jié)酸堿度，時，乙酸開始產生。可以通過降低溫度，調節(jié)酸堿度，控制補料等方法來降低比生長速率。控制補料等方法來降低比生長速率。 2、透析培養(yǎng)：在大腸桿菌的培養(yǎng)過程中可以用透析、透析培養(yǎng)：在大腸桿菌的培養(yǎng)過程中可以用透析技術除去發(fā)酵液中的有害物質，降低乙酸含量從而實技術除去發(fā)酵液中的有害物質，降低乙酸含量從而實現重組菌的高密度發(fā)酵和產物的表達。現重組菌的高密度發(fā)酵和產物的表達。 3、控制葡萄糖的濃度：葡萄糖是大腸桿菌發(fā)酵過程、控制葡萄糖的濃度：葡萄糖是大腸桿菌發(fā)酵過程中重要的碳源之一，用其作碳源是要將其控制在一個中重要的碳源之一，用其作碳源是要將其控制在一個較低的水平上，以減少乙酸的

6、產生。較低的水平上，以減少乙酸的產生。培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基選擇 LBLB培養(yǎng)基培養(yǎng)基( (種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基) :) :胰蛋白胨胰蛋白胨5g,5g,酵母粉酵母粉2.5g,NaCl5g,2.5g,NaCl5g,溶于溶于500mlH2O,NaOH500mlH2O,NaOH調調節(jié)節(jié)pH7.0, 2LpH7.0, 2L三角瓶裝三角瓶裝, ,滅菌鍋濕熱高壓滅滅菌鍋濕熱高壓滅菌菌121, 20min,121, 20min,室溫保存室溫保存. . TB TB培養(yǎng)基培養(yǎng)基( (發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基) : ) : 胰蛋白胨胰蛋白胨240g, 240g, 酵母粉酵母粉480g, 480g, 甘油甘油80g, 80g

7、, 消泡劑消泡劑1ml, 1ml, 溶于溶于H2O, H2O, 定容至定容至19L,B. Braun19L,B. Braun發(fā)酵罐在位發(fā)酵罐在位滅菌滅菌121, 15min.121, 15min.培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基配制配制種子固體培養(yǎng)基配制種子固體培養(yǎng)基100mL 100mL ， 分裝試管，分裝試管， 0.1MPa 0.1MPa 滅菌滅菌20min20min，然后擺成斜面。，然后擺成斜面。配制種子培養(yǎng)液配制種子培養(yǎng)液600mL600mL，分裝，分裝50mL50mL于一個于一個250mL250mL三角瓶中（作一級種子瓶），余下三角瓶中（作一級種子瓶），余下550mL550mL平均分裝于三個平均分裝

8、于三個500mL500mL三角瓶中（作三角瓶中（作二級種子用），同上滅菌。二級種子用），同上滅菌。培養(yǎng)方式培養(yǎng)方式 微生物的培養(yǎng)方式主要有分批、連續(xù)和補料分批微生物的培養(yǎng)方式主要有分批、連續(xù)和補料分批3 3種。種。大腸桿菌發(fā)酵大多采用補料分批培養(yǎng)，這是在現代發(fā)酵工大腸桿菌發(fā)酵大多采用補料分批培養(yǎng)，這是在現代發(fā)酵工藝得到優(yōu)化的一種方式，能有效的優(yōu)化微生物培養(yǎng)過程中藝得到優(yōu)化的一種方式，能有效的優(yōu)化微生物培養(yǎng)過程中的化學環(huán)境。使微生物處于最佳的生長環(huán)境。這種方式一的化學環(huán)境。使微生物處于最佳的生長環(huán)境。這種方式一方面可以避免某些營養(yǎng)成分初始濃度過高出現底物抑制現方面可以避免某些營養(yǎng)成分初始濃度過高

9、出現底物抑制現象，另一方面能夠防止限制性營養(yǎng)成分被耗盡而影響細胞象，另一方面能夠防止限制性營養(yǎng)成分被耗盡而影響細胞的生長和產物的形成。補料分批培養(yǎng)已廣泛應用于各種各的生長和產物的形成。補料分批培養(yǎng)已廣泛應用于各種各樣的初級、次級生物產品和蛋白等的發(fā)酵生產中。樣的初級、次級生物產品和蛋白等的發(fā)酵生產中。 培養(yǎng)基營養(yǎng)成分過高會抑制細胞的生長，采用流加補培養(yǎng)基營養(yǎng)成分過高會抑制細胞的生長，采用流加補料是提高細胞濃度和外源蛋白產量的有效方式，高密度培料是提高細胞濃度和外源蛋白產量的有效方式，高密度培養(yǎng)通過調節(jié)限制性底物的流加速率來調控細胞生長。養(yǎng)通過調節(jié)限制性底物的流加速率來調控細胞生長。培養(yǎng)條件培養(yǎng)

10、條件1、溫度：、溫度：3638 2、pH： 73、攪拌速率：、攪拌速率：100200r/min4、溶氧、溶氧: 2050%5、通風：、通風：23L/min6、接種量：、接種量：12%操作步驟操作步驟1 1、菌種準備、菌種準備2 2、上罐前的準備及實罐滅菌、上罐前的準備及實罐滅菌3 3、發(fā)酵操作、發(fā)酵操作4 4、發(fā)酵管理、發(fā)酵管理5 5、發(fā)酵過程中各生化指標的測定發(fā)酵過程中各生化指標的測定 6 6、補料、補料7 7、放罐、放罐8 8、清洗、清洗菌種準備菌種準備1、上罐前兩天，從冰箱中取出菌種轉接斜、上罐前兩天，從冰箱中取出菌種轉接斜面，面，37培養(yǎng)培養(yǎng)24h。2、上罐前一天，由斜面菌種轉接一級種

11、子、上罐前一天，由斜面菌種轉接一級種子瓶，瓶， 37振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)12h，然后轉接二級，然后轉接二級種子瓶，種子瓶， 37振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)10h。上罐前的準備及實罐滅菌上罐前的準備及實罐滅菌1、洗凈發(fā)酵罐及各聯接膠管、洗凈發(fā)酵罐及各聯接膠管2、 配制發(fā)酵培養(yǎng)基配制發(fā)酵培養(yǎng)基5.0L，置發(fā)酵罐內，加入幾滴，置發(fā)酵罐內，加入幾滴泡敵。泡敵。3、校正、校正pH電極和溶氧（電極和溶氧（DO）電極。）電極。4、把電極插口、取樣管、補料口、消泡劑料瓶等、把電極插口、取樣管、補料口、消泡劑料瓶等固定、密封好后，開夾套出、進水閥固定、密封好后，開夾套出、進水閥V2、W1，使夾套充滿水，用保護罩蓋住罐蓋及發(fā)酵

12、罐，用使夾套充滿水，用保護罩蓋住罐蓋及發(fā)酵罐，用傾倒螺釘鎖緊法蘭，開保護罩頂部排氣閥傾倒螺釘鎖緊法蘭，開保護罩頂部排氣閥V4，啟，啟動蒸氣發(fā)生器，啟動攪拌馬達，調轉速動蒸氣發(fā)生器，啟動攪拌馬達，調轉速300r/min，開啟冷凝水出水閥開啟冷凝水出水閥V1，開啟蒸氣閥門，開啟蒸氣閥門S1，進行在，進行在位滅菌。位滅菌。發(fā)酵罐發(fā)酵罐上罐前的準備及實罐滅菌上罐前的準備及實罐滅菌5、當保護罩頂部閥門、當保護罩頂部閥門V4有蒸氣排出時，有蒸氣排出時，2min后關閉閥門，當罐溫接近滅菌溫度時，后關閉閥門，當罐溫接近滅菌溫度時，微開閥微開閥V4適當排氣，并調整蒸氣閥適當排氣，并調整蒸氣閥S1維持維持罐溫。保

13、溫結束后，關蒸氣閥罐溫。保溫結束后，關蒸氣閥S1，全開冷，全開冷凝水出水閥凝水出水閥V1，開進水閥，開進水閥W3，將溫度設定，將溫度設定在在37，切入自動。，切入自動。6、當溫度降到、當溫度降到100以下，緩緩開排氣閥以下，緩緩開排氣閥V4，使保護罩頂壓力表指示為零，移去保護罩。使保護罩頂壓力表指示為零，移去保護罩。上罐前的準備及實罐滅菌上罐前的準備及實罐滅菌7、連接通氣管路，將進氣過濾器、連接通氣管路，將進氣過濾器K7口與控口與控制臺左側空氣出口連通，開彈簧夾，接通制臺左側空氣出口連通，開彈簧夾，接通空氣壓縮機電源，空氣壓縮機電源， 對發(fā)酵罐進行通氣，對發(fā)酵罐進行通氣， 調調整空氣流量整空氣

14、流量3 5L/min。8、當溫度達到、當溫度達到37時，將預先滅菌的時，將預先滅菌的pH電電極、極、DO電極（電極（75%酒精消毒、酒精消毒、UV消毒）接消毒）接入發(fā)酵罐，連接各電極導線。入發(fā)酵罐，連接各電極導線。上罐前的準備及實罐滅菌上罐前的準備及實罐滅菌9、將流加堿的管線與泵和罐體連接，通過面、將流加堿的管線與泵和罐體連接，通過面板操作開關選擇堿泵，打開手動開關，使板操作開關選擇堿泵，打開手動開關，使膠管內充滿液體，將輸出上限設在膠管內充滿液體，將輸出上限設在15%，下限設為下限設為“0”，待一切準備就緒，將，待一切準備就緒，將“手手動動”開關調節(jié)到開關調節(jié)到“自動自動”狀態(tài)。狀態(tài)。10、

15、設定攪拌轉速為、設定攪拌轉速為300r/min、空氣流量、空氣流量 23L/min、pH7.0、DO100%，系統進入，系統進入發(fā)酵狀態(tài)。發(fā)酵狀態(tài)。發(fā)酵操作發(fā)酵操作 當發(fā)酵罐內溫度達到并維持在所需溫度后，當發(fā)酵罐內溫度達到并維持在所需溫度后，進行如下操作：進行如下操作：1 1、取樣：松開彈簧夾、取樣：松開彈簧夾J2J2，用無菌空氣將取樣管殘，用無菌空氣將取樣管殘液壓入發(fā)酵罐內，再夾緊液壓入發(fā)酵罐內，再夾緊J2J2，將出料管放入接料，將出料管放入接料瓶，松開取樣管彈簧夾瓶，松開取樣管彈簧夾J3J3，發(fā)酵液被壓入接料瓶，發(fā)酵液被壓入接料瓶，開開J2J2、J3J3排出取樣管內殘料，夾緊排出取樣管內殘

16、料，夾緊J2J2、J3J3 2 2、接種：將酒精棉置于接種口槽中，旋松接種口，、接種：將酒精棉置于接種口槽中，旋松接種口，點燃酒精棉，在火焰保護下，打開接種口，倒入點燃酒精棉，在火焰保護下，打開接種口，倒入二級種子，然后旋緊接種蓋，移去火焰圈。接種二級種子，然后旋緊接種蓋，移去火焰圈。接種后立即進行第一次取樣，用于測定細菌后立即進行第一次取樣，用于測定細菌ODOD值。值。發(fā)酵管理發(fā)酵管理 控制發(fā)酵過程的各項參數（溫度、控制發(fā)酵過程的各項參數（溫度、PHPH、溶解氧、攪拌速度、溶解氧、攪拌速度、空氣流量、泡沫水平等），如參數出現異?，F象，則應及空氣流量、泡沫水平等），如參數出現異?，F象，則應及時

17、排除。時排除。 每小時取一次樣，每次取樣每小時取一次樣，每次取樣50ml50ml。取樣時先將空氣流量計。取樣時先將空氣流量計旋鈕調至旋鈕調至01L/min01L/min，松開彈簧夾，松開彈簧夾J2J2，用無菌空氣將取樣管，用無菌空氣將取樣管殘液壓入發(fā)酵罐內，再夾緊殘液壓入發(fā)酵罐內，再夾緊J2J2，將出料管放入接料瓶，松，將出料管放入接料瓶，松開取樣管彈簧夾開取樣管彈簧夾J3J3，發(fā)酵液被壓入量筒，當達到，發(fā)酵液被壓入量筒，當達到40mL40mL，開，開J2J2排出取樣管內殘料，夾緊排出取樣管內殘料，夾緊J3J3、J2J2。將樣液入標記有取樣。將樣液入標記有取樣時間的三角瓶，用保鮮膜封口，立即入

18、冰箱冷藏，取完樣時間的三角瓶，用保鮮膜封口，立即入冰箱冷藏，取完樣要及時清洗量筒。要及時清洗量筒。 每次取樣前（每隔每次取樣前（每隔1 1小時）記錄發(fā)酵過程溫度、小時）記錄發(fā)酵過程溫度、PHPH值、值、DODO、通風、轉速的測定數值，并記錄操作情況。通風、轉速的測定數值，并記錄操作情況。發(fā)酵過程中各生化指標的測定發(fā)酵過程中各生化指標的測定 發(fā)酵過程中，雖然能自動控制溫度和發(fā)酵過程中，雖然能自動控制溫度和pHpH兩個兩個重要條件，但仍需專人負責照看。完成下列工作：重要條件，但仍需專人負責照看。完成下列工作：（1 1）經常注意發(fā)酵罐運轉是否正常，檢查各控）經常注意發(fā)酵罐運轉是否正常，檢查各控制參數

19、是否在合適的范圍內，遇有故障及時排除。制參數是否在合適的范圍內，遇有故障及時排除。（2 2）每小時取樣測定細菌光密度值，進行革蘭）每小時取樣測定細菌光密度值，進行革蘭氏染色及鏡檢，以了解菌生長情況及檢查是否有氏染色及鏡檢，以了解菌生長情況及檢查是否有雜菌污染。雜菌污染。（3 3）隨著培養(yǎng)時間的延長，適當地調節(jié)進氣量）隨著培養(yǎng)時間的延長，適當地調節(jié)進氣量和攪拌轉速，以維持一定的和攪拌轉速，以維持一定的DODO值。值。 發(fā)酵過程中各生化指標的測定發(fā)酵過程中各生化指標的測定（4 4）定時取樣用裴林快速定糖法測定培養(yǎng)液中還原糖的含）定時取樣用裴林快速定糖法測定培養(yǎng)液中還原糖的含量。測定步驟如下：量。測

20、定步驟如下： 發(fā)酵液中糖含量小于發(fā)酵液中糖含量小于 4 4時，直接取發(fā)酵液時，直接取發(fā)酵液 0.5 ml0.5 ml于錐于錐形瓶中，若糖含量大于形瓶中，若糖含量大于 4 4時，先稀釋時，先稀釋1010倍后，取稀釋液倍后，取稀釋液 0.5ml0.5ml于錐形瓶中。于錐形瓶中。 向錐形瓶加入裴林試劑甲液和乙液各向錐形瓶加入裴林試劑甲液和乙液各 5ml5ml，混勻，加熱，混勻，加熱至沸騰。至沸騰。 用用0.10.1標準葡萄糖液滴定至藍色消失，記錄消耗葡萄糖標準葡萄糖液滴定至藍色消失，記錄消耗葡萄糖液的體積數（液的體積數（V V）。）。 取取0.5 ml0.5 ml蒸餾水于錐形瓶中，同法進行滴定，記錄

21、消耗蒸餾水于錐形瓶中，同法進行滴定，記錄消耗葡萄糖的體積數（葡萄糖的體積數（V0V0）。）。 按下公式進行計算：按下公式進行計算：(V0-V)x0.1/0.5x(V0-V)x0.1/0.5x稀釋倍數稀釋倍數V0 V0 為葡萄糖滴定空白時消耗的毫升數。為葡萄糖滴定空白時消耗的毫升數。V V為葡萄糖滴定為葡萄糖滴定樣品時消耗的毫升數。樣品時消耗的毫升數。 發(fā)酵過程中各生化指標的測定發(fā)酵過程中各生化指標的測定（5 5）定時取樣測定發(fā)酵液中氨基氮的含量，測定步驟如下：）定時取樣測定發(fā)酵液中氨基氮的含量，測定步驟如下：取發(fā)酵液經取發(fā)酵液經3500 r3500 rminmin離心離心 10min10min

22、。 分別吸取上清液分別吸取上清液 2.0 ml2.0 ml于兩個磨口具塞錐形瓶中，各于兩個磨口具塞錐形瓶中，各加蒸餾水加蒸餾水 5ml5ml。向另一磨口具塞錐形瓶中加入。向另一磨口具塞錐形瓶中加入 7 ml7 ml蒸餾蒸餾水，作空白對照。水，作空白對照。向上述向上述 3 3個瓶各加中性申醛溶液個瓶各加中性申醛溶液 5.0 ml5.0 ml，混勻，加，混勻，加 0.5 0.5 溴麝香草酚蘭液溴麝香草酚蘭液 2 2滴和滴和 0.50.5酚酞液酚酞液4 4滴。滴。 用標準用標準 0.100mol0.100molL NaOHL NaOH溶液滴定至紫色，分別記錄溶液滴定至紫色，分別記錄消耗的消耗的NaO

23、HNaOH液毫升數。液毫升數。 按下式計算按下式計算: (V0-V)x1.4008: (V0-V)x1.4008 V V為滴定發(fā)酵液時消耗為滴定發(fā)酵液時消耗NaOHNaOH溶液的毫升數。溶液的毫升數。V0 V0 為滴定空白為滴定空白時消耗時消耗NaOHNaOH溶液的毫升數。溶液的毫升數。1.40081.4008為為 1ml 0.1mol1ml 0.1molLNaOHLNaOH溶液相當的氮毫克數，氨基氮的含量是每毫升中的含量。溶液相當的氮毫克數，氨基氮的含量是每毫升中的含量。發(fā)酵過程中各生化指標的測定發(fā)酵過程中各生化指標的測定（6）測定）測定OD值值 大腸桿菌標準曲線的繪制：取大腸桿菌標準曲線的

24、繪制：取10mL離心管，與離心管，與105烘烘2h至恒重，用鑷子夾取入干燥器，待冷卻后于分析天平上至恒重，用鑷子夾取入干燥器，待冷卻后于分析天平上稱重（稱重（W0），精確到小數后），精確到小數后4位，然后準確取位，然后準確取10mL發(fā)酵發(fā)酵液，于液，于3000rpm離心離心10min，棄去上清液，用蒸餾水洗滌，棄去上清液，用蒸餾水洗滌沉淀，同上離心，棄上清液，與沉淀，同上離心，棄上清液，與100烘至恒重，用鑷子烘至恒重，用鑷子夾取如干燥器中冷卻，于分析天平上稱重（夾取如干燥器中冷卻，于分析天平上稱重（W1），精確），精確至小數后至小數后4位，得細胞干重為位，得細胞干重為W1-W0。取同一發(fā)酵液

25、，稀。取同一發(fā)酵液，稀釋釋2、5、10、20、50倍，于倍，于600nm下測下測OD值。以值。以0D值值為縱坐標，菌液濃度（為縱坐標，菌液濃度（g/L）為橫坐標，繪制標準曲線。）為橫坐標，繪制標準曲線。 均勻取樣品均勻取樣品5mL于編號試管中，用空白發(fā)酵液稀釋至一于編號試管中，用空白發(fā)酵液稀釋至一定濃度，在定濃度，在721分光光度計上測定分光光度計上測定A600，根據菌體濃度與，根據菌體濃度與吸光度之間關系地標準曲線換算出菌體濃度。吸光度之間關系地標準曲線換算出菌體濃度。 其余發(fā)酵液于其余發(fā)酵液于3，2000r/min條件下離心分離條件下離心分離8min,上上清液裝入編號三角瓶，用于測糖。清液

26、裝入編號三角瓶，用于測糖。發(fā)酵過程中各生化指標的測定發(fā)酵過程中各生化指標的測定（7 7）當發(fā)酵到一定時候，光密度值達到）當發(fā)酵到一定時候，光密度值達到1 11.51.5，發(fā)酵液中還原糖和氨基氮含量較低時，發(fā)酵液中還原糖和氨基氮含量較低時，開始補料，并在發(fā)酵結束前一小時終止。開始補料，并在發(fā)酵結束前一小時終止。 （8 8）每小時記錄發(fā)酵過程溫度、）每小時記錄發(fā)酵過程溫度、pHpH和和DODO的測的測定數值，并記錄操作情況。定數值，并記錄操作情況。大腸桿菌流加發(fā)酵策略大腸桿菌流加發(fā)酵策略 大腸桿菌是迄今為止遺傳背景最清楚的菌株，大腸桿菌是迄今為止遺傳背景最清楚的菌株，廣泛用于基因工程的研究中。大腸

27、桿菌高密度培廣泛用于基因工程的研究中。大腸桿菌高密度培養(yǎng)時最關鍵的問題是如何盡量減少乙酸的產生，養(yǎng)時最關鍵的問題是如何盡量減少乙酸的產生，因為高濃度葡萄糖或高比生長速率帶來的高濃度因為高濃度葡萄糖或高比生長速率帶來的高濃度乙酸會嚴重抑制細胞生長和重組蛋白的生產。研乙酸會嚴重抑制細胞生長和重組蛋白的生產。研究發(fā)現，即使葡萄糖濃度只有究發(fā)現，即使葡萄糖濃度只有0.250.250.5 g/L0.5 g/L，大，大腸桿菌仍會產生乙酸。因此，高細胞密度發(fā)酵所腸桿菌仍會產生乙酸。因此，高細胞密度發(fā)酵所采用的流加策略必須按照一定的算法制定，以保采用的流加策略必須按照一定的算法制定，以保持反應器中底物濃度處于

28、較低的水平。營養(yǎng)物最持反應器中底物濃度處于較低的水平。營養(yǎng)物最好以它們的消耗速率加入反應器中，這樣不僅可好以它們的消耗速率加入反應器中，這樣不僅可以防止底物積累到毒性水平，也不會使細胞處于以防止底物積累到毒性水平，也不會使細胞處于饑餓狀態(tài)。饑餓狀態(tài)。補料方式補料方式 采用簡單反饋控制補料，又稱單一循采用簡單反饋控制補料，又稱單一循環(huán)法，此法控制與營養(yǎng)物利用相偶聯的環(huán)法，此法控制與營養(yǎng)物利用相偶聯的pHpH或溶解氧濃度等參數或溶解氧濃度等參數, ,使之保持恒定。使之保持恒定。例如例如,預先設定預先設定pH恒定值恒定值,發(fā)酵中菌體代謝產生酸發(fā)酵中菌體代謝產生酸性物質或銨性物質或銨,使使pH值發(fā)生改

29、變值發(fā)生改變,從而啟動控從而啟動控制開關制開關,開始補料開始補料,pH恢復至恒定值以溶解恢復至恒定值以溶解氧濃度作為補料開關則是根據培養(yǎng)基中某氧濃度作為補料開關則是根據培養(yǎng)基中某種關鍵營養(yǎng)物種關鍵營養(yǎng)物(主要是碳源主要是碳源)消耗消耗,會導致溶會導致溶解氧濃度迅速改變。解氧濃度迅速改變。溶氧控制的分批補料培養(yǎng)溶氧控制的分批補料培養(yǎng)控制的幾個關鍵參數如下：控制的幾個關鍵參數如下：1、溫度：培養(yǎng)溫度為、溫度：培養(yǎng)溫度為37 。2、pH：自動流加：自動流加30%的氨水，使的氨水，使PH保持保持 在在7.0左右。左右。 3、葡萄糖的流加：根據發(fā)酵的實際經驗，流、葡萄糖的流加：根據發(fā)酵的實際經驗，流加補

30、料分三個階段進行，發(fā)酵過程中加補料分三個階段進行，發(fā)酵過程中04h不加補料，不加補料，410h補加含補加含50g葡萄糖的補料，葡萄糖的補料，1020h加入含加入含190g葡萄糖的補料，誘導前葡萄糖的補料，誘導前0.5h追加追加100ml補料。補料。放罐放罐發(fā)酵發(fā)酵8 8小時后，測小時后，測ODOD值及還原糖量，當發(fā)酵值及還原糖量，當發(fā)酵液的液的PHPH不斷上升且為堿性、不斷上升且為堿性、ODOD值增長緩慢，值增長緩慢，且還原糖量很低時，可判斷發(fā)酵結束，準且還原糖量很低時，可判斷發(fā)酵結束，準備放罐。備放罐。放罐操作同取樣。將全部發(fā)酵液取出后，放罐操作同取樣。將全部發(fā)酵液取出后，100100煮沸煮沸1010分鐘滅菌，滅完菌的發(fā)酵液可分鐘滅菌，滅完菌的發(fā)酵液可排放入下水道。排放入下水道。清洗清洗放罐完畢后，打開自來水進水口，往發(fā)酵放罐完畢后，打開自來水進水口，往發(fā)酵罐中注滿水，同時開動攪拌軸攪動清洗五罐中注滿水，同時開動攪拌軸攪動清洗五分鐘，排水。分鐘，排水。再次注入自來水清洗，操作如再次注入自來水清洗，操作如1 1。清洗結束，關閉電源。清洗結束，關閉電源。注意事項注