代謝組除草劑作用模式分類和鑒定研究中的應(yīng)用進(jìn)展紀(jì)明山

1、Vol. 52, No. 12Dec. 2013第52卷第12期2013年12月AGROCHEMICALS,. 代謝組除草劑作用模式分類和鑒定研究中的應(yīng)用進(jìn)展J., 2013, 52(12): 859-864.代謝組除草劑作用模式分類和鑒定研究中的應(yīng)用進(jìn)展(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，沈陽 110161)摘要：將代謝組學(xué)(主要是代謝輪廓(譜)和代謝)應(yīng)用于除草劑作用模式分類和鑒定，有望成為簡化和縮短新型除草劑創(chuàng)制過程的一種有效輔助。重點(diǎn)介紹了代謝組學(xué)的樣品，分析預(yù)處理、分析、可視化和結(jié)果的生物學(xué)解釋等，以及代謝組除草劑作用模式分類和鑒定研究中的應(yīng)用情況，展望了代謝組除草劑作用模式分類和鑒定研究

2、中應(yīng)用的發(fā)展趨勢。：代謝組學(xué)；代謝輪廓(譜)；代謝；除草劑；作用模式文章編號：1006-0413(2013)12-0859-06號：TQ450文獻(xiàn)標(biāo)志碼：AApplication Progress of Metabolomics in the Study of the Classification and Identification of the Modes-of-Action(MoA) of HerbicidesZHU He, JI Ming-shan(Plant Protection College, Shenyang Agricultural University, Shenyang

3、110161, China)Abstract: The application of metabolomics (primarily metabolite profiling and metabolic fingerprints) on the classification and identification of the MoA of herbicides is expected to become an effective aid to simplify and shorten the creation process of novel herbicides. This article

4、introduced the key technologies of metabolomics, such as sample preparation, analysis platform, data pre-processing, analyses, visualization and biological interpretation of results, as well as the application status of metabolomics in the study of the classification and identification of the MoA of

5、 herbicides. The development trend of the application of metabolomics in the study of the classification and identification of the MoA of herbicides was reviewed.Key words: metabolomics; metabolite profiling; metabolic fingerprints; herbicides; modes-of-action(MoA)目前，全世界正日注在不斷的自然環(huán)境中進(jìn)業(yè)大學(xué)科學(xué)大阪府立大學(xué)生命與環(huán)境

6、科行糧食生產(chǎn)來供養(yǎng)呈幾何指數(shù)增長的人口。商品化除草學(xué)、德國克植物生理學(xué)等先)劑在全世界農(nóng)業(yè)機(jī)械化上扮演著重要，并為各國糧食后開展了利用代謝組學(xué)(主要是代謝輪廓(譜)和代謝高產(chǎn)作出了巨大貢獻(xiàn)。隨著對除草劑研究的不斷深入，不但從結(jié)構(gòu)上對除草劑進(jìn)行分類，還進(jìn)一步深化到從作用模式(MoA)(或作用靶標(biāo))方面對除草劑進(jìn)行分類。根據(jù)除進(jìn)行已知MoA的除草劑的分類和代謝生物標(biāo)志物鑒定的實(shí)驗(yàn)研究。目前，沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院課題組正率先在國內(nèi)開展“基于代謝組學(xué)的除草劑作用機(jī)理研草劑抗性行動委員會(HRAC)數(shù)據(jù)，已確定現(xiàn)有除草究”工作。本研究介紹了植物代謝組學(xué)的樣品，分析劑中多達(dá)20多種不同MoA。除草劑M

7、oA不僅已成為指導(dǎo)合理使用除草劑的重要方法，而且，還將對簡化和縮短新預(yù)處理、分析、可視化和結(jié)果的生物學(xué)解釋等關(guān)鍵技術(shù)，以及代謝組除草劑MoA分類和鑒定研究中的型除草劑創(chuàng)制過程產(chǎn)生影響。將代謝組學(xué)應(yīng)用于除應(yīng)用情況，并展望了代謝組究中應(yīng)用的發(fā)展趨勢。除草劑MoA分類和鑒定研草劑MoA分類和鑒定研究中，一方面，通過代謝分析對已知MoA的除草劑進(jìn)行分類，建立起已知MoA的除草1 代謝組學(xué)代謝組學(xué)(Metabolomics/Metabonomics)旨在全面定性或定量分析研究某個生物體或組織甚至單個細(xì)胞的全部劑代謝圖譜文庫，創(chuàng)建一個可快速篩查未知除草劑MoA的方法，為研制新型除草劑及其作用機(jī)理研究奠定

8、基礎(chǔ)；另一方面，利用代謝輪廓(譜)分析技術(shù)進(jìn)行除草劑代謝標(biāo)志物鑒定，發(fā)現(xiàn)那些具有高選擇性的獨(dú)特作用位 點(diǎn)，進(jìn)而評價(jià)除草劑藥效作用和發(fā)現(xiàn)除草劑作用靶標(biāo)及其作用模式，為 毒理學(xué)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估提供依據(jù)。為代謝物(量小于1 000)成分及其動態(tài)變化1-2。其小主要優(yōu)點(diǎn)是同步代謝網(wǎng)絡(luò)，可以將生物和/或非生物病原引起的代謝網(wǎng)絡(luò)中的變化與相應(yīng)生物標(biāo)志物的檢測起來，因此，代謝組學(xué)充當(dāng)了型與表現(xiàn)型之間聯(lián)此，自21世紀(jì)，美國巴斯夫農(nóng)業(yè)、希臘雅典農(nóng)收稿日期：2013-08-06，修返日期：2013-09-19作者簡介通訊作者(1987)，女()，在讀博士，主要從事毒理學(xué)研究。研究。Tel：zhuhev5。：jimin

9、gshan。，男，教授，博士，主要從事毒理學(xué)和生物農(nóng) 藥 AGROCHEMICALS第52卷860系的橋梁。代謝組分析分為4 個層次3 ：1) 代謝物靶標(biāo)分析 (Metabolite target)，對特定代謝反應(yīng)中某一個或某幾個特定代謝物進(jìn)行分析；2)代謝輪廓(譜)分析(Metaboliteprofiling)，對特定代謝途徑中的結(jié)構(gòu)或性質(zhì)相關(guān)的預(yù)設(shè)管NMR靈敏度不如MS，但主要因它的高再現(xiàn)性以及有關(guān)樣品要求最少而被地用于代謝組學(xué)之中。最近，采用更高場磁體(900 MHz)、低溫冷卻探針、小型微探針、LC-NMR和LC-NMR/MS聯(lián)用儀，以及NMR數(shù)據(jù)庫，為NMR在代謝組學(xué)上的應(yīng)用打開了新

10、局面6。此外，1H魔角旋轉(zhuǎn)(MAS)NMR方便分析前處理的完整微小組織，代謝產(chǎn)物系列進(jìn)行定量測定；3)代謝/代謝足跡分析該技術(shù)對代謝組學(xué)而言有著很大潛力，但尚未被很好利(Metabolic fingerprints/Metabolic footprints)，不分離鑒定具體代謝物，而是定性或半定量分析細(xì)胞內(nèi)/外全部代謝物變化，對樣品進(jìn)行快速分類；4)代謝組學(xué)，在限定條件下對某個特定生物細(xì)胞或樣品中的所有代謝物進(jìn)行定性和定量分析，但當(dāng)前乃至今后一段時(shí)間內(nèi)，受儀器分析水平所限，目前還沒有任何一種分析方法能夠?qū)λ写x物進(jìn)行用。NMR在代謝組學(xué)上應(yīng)用的最大是靈敏度低(檢測限15 M)、儀器購置和維修

11、成本高(尤其是能夠觀察1H頻率高于500 MHz的儀器)以及缺乏利用相關(guān)數(shù)據(jù)庫自動鑒定代謝物。MS檢測器與色譜分離聯(lián)用再與現(xiàn)有質(zhì)譜文庫結(jié)合， 使得MS用于代謝組學(xué)具有最明顯的優(yōu)勢。同NMR相比， MS檢測器具有檢測限低、檢測速度快、動態(tài)范圍寬廣等 優(yōu)點(diǎn)，只是再現(xiàn)性不如前者。氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)適 合分析低極性、低沸點(diǎn)代謝物或者衍生化后具有揮發(fā)性 的物質(zhì)。由于其分辨率高、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣，具有 大量標(biāo)準(zhǔn)代謝物譜圖庫，且設(shè)備購置、運(yùn)行及維修成本相 對低廉等特點(diǎn)，是目前植物代謝組學(xué)研究的主要分析平 臺之一。與GC結(jié)合的飛行時(shí)間(TOF)分析器的開發(fā)和采 用，大幅度縮短了復(fù)雜混合物分析所需

12、時(shí)間，并且改進(jìn)了質(zhì)量準(zhǔn)確度7。同GC相比，液相色譜(LC)不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的影響，樣品前處理非常簡單，過濾后檢測，實(shí)現(xiàn)真正意義上的代謝組學(xué)尚需分析方法有突破。目前，在除草劑MoA分類和鑒定研究中，主要使用代謝分析和代謝輪廓(譜)分析開展除草劑MoA分類和鑒別以及作用靶標(biāo)(生物標(biāo)志物)鑒定工作。植物代謝組學(xué)包括樣品，化學(xué)分析平臺獲取數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)預(yù)處理、分析和可視化，以及結(jié)果的生物學(xué)解釋等關(guān)鍵技術(shù)。1.1 樣品取樣、代謝物提取及分析前處理是代謝組學(xué)樣品技術(shù)的3個重要組成部分，是獲得可靠數(shù)據(jù)的前提。為了使取樣和提取過程達(dá)到快速、高效、均一性好及保持化合便可直接，而不需衍生化。因此，LC/MS可

13、有效分析物的穩(wěn)定，通常將植物組織用液氮淬滅(快速冷凍)，在植物中豐富的次生代謝產(chǎn)物，已發(fā)展成為代謝組學(xué)分析 必備的 設(shè)備。最近文獻(xiàn)8-9強(qiáng)調(diào)了高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC/MS)、超高效液相色譜-質(zhì)譜(UHPLC/MS)以及 親水作用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HILIC/MS)用于代謝組學(xué)研究的潛力。除四極桿MS和TOF/MS之外，它們的組合型四液氮低溫下研磨成粉末后，迅速加入樣品提取液。用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析的提取物還需經(jīng)過干燥和衍生化處理。使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)分析的提取物則需要經(jīng)過過濾，去除不溶物，以防止堵塞分離柱。由于樣品技術(shù)過程繁瑣、復(fù)雜，極易引起代謝組極桿飛行時(shí)

14、間質(zhì)譜分析儀(-TOF)與LC或者直接據(jù)出現(xiàn)偏大的誤差，因此，自動化的取樣、提取和分析注射質(zhì)譜(DIMS)結(jié)合，在代謝組學(xué)研究中應(yīng)用具有巨前處理技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生4，使用多功能自動器進(jìn)行樣品大潛力10-11。根據(jù)比分離待分析樣品成分的毛細(xì)管的衍生化和自動，大大減少了手動衍生化的繁瑣電泳-質(zhì)譜(CE/MS)適用于復(fù)雜混合物的分析和結(jié)構(gòu)鑒定，與GC/MS和LC/MS相比，CE/MS分離樣品的速度更快，效率更高，是一種替代GC/MS和LC/MS的分析方法，并對代謝組學(xué)而言也具有巨大應(yīng)用潛力12-13。在代謝組學(xué)研和衍生化時(shí)間差異等引起的誤差。樣品技術(shù)的機(jī)械化和自動化是今后發(fā)展的趨勢，能最大限度地減少實(shí)驗(yàn)誤

15、差，使數(shù)據(jù)更具穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。1.2 分析平臺分析平臺的選擇依賴于樣品的理化性質(zhì)和化學(xué)成分、研究目的以及可使用的儀器設(shè)備等幾個因素。盡管已開發(fā)出許多適用于代謝組學(xué)的分析儀器設(shè)備，但核磁共振究中使用葉變換離子回旋共振/質(zhì)譜(FT-ICR/MS)和軌道阱MS，為植物代謝組學(xué)整體代謝網(wǎng)絡(luò)分析打開了新視野。FT-ICR/MS是一種優(yōu)秀的MS檢測器，具有高精確度(1 ppm)和分辨能力，已被地應(yīng)用于高通量代謝組(NMR)和質(zhì)譜(MS)一直以來都是代謝組學(xué)主要分析儀器。使用的學(xué)研究之中14-15。軌道阱MS也是一種與FT-ICR/MS相媲美的高級MS檢測器，近期才被采用16。最新研究17-18顯示出軌道阱

16、MS在代謝組學(xué)上的巨大潛力。盡管這2個平臺具有強(qiáng)大分辨能力和質(zhì)量精確度，但將檢測出的離子分配NMR可提供有化合物和多元復(fù)雜混合物的結(jié)構(gòu)信息。在后一種情況下，化合物的鑒定會變得極具性，尤其是在一維(1D)1H NMR實(shí)驗(yàn)中分析前期分離的到相應(yīng)化合物中依然富有性。Atherton19、Mocoet20、Biais21、Leon22、McKelvie23、粗提樣品時(shí)，而這是常用的NMR代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)方法5。盡第12期，等：代謝組除草劑作用模式分類和鑒定研究中的應(yīng)用進(jìn)展861Aliferis24等在代謝組學(xué)研究中，還將NMR與MS整合在可視化表達(dá)。其中，負(fù)載圖又可分為散點(diǎn)負(fù)載圖和線性負(fù)載圖。監(jiān)督的模式識

17、別方法是對已知類別的樣本隨機(jī)分為 2部分(訓(xùn)練集和測試集)，利用已知類別的訓(xùn)練集建立模型，通過測試集的正確率來表征建立模型的性能。這種方法主要是找出樣品分類的最大差異，主要包括偏最小二乘一起，或者將不同MS平臺化合物的全面分析。，極大地方便了各種不同1.3 數(shù)據(jù)預(yù)處理、分析和可視化對NMR而言，原始數(shù)據(jù)預(yù)處理主要包括數(shù)據(jù)的化(標(biāo)準(zhǔn)化)、峰譜對數(shù)據(jù)的標(biāo)度換算等。波譜后，法(PLS)、線性判別分析DA)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法(NN)等，其它們的各基線都會自動得到校正，并且會將它們調(diào)整中，以PLS最為常見。在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中，通過PLS方法可最大程度地反映分類組別之間的差異。在PLS的基礎(chǔ)上，還提出了正交偏最小二乘

18、法(O-PLS)25-26。需要說明的是，PLS(對齊)到特定化學(xué)位移。通常，化學(xué)位移的補(bǔ)償可通過丙酸三甲基硅酯(TSP，0.00 ppm)的基準(zhǔn)信號進(jìn)行調(diào)整。壓制全情況下，應(yīng)從進(jìn)一步分析中排除靠近測量浮標(biāo)和O-PLS的方法在模型的能力方面并無明顯差異，的波譜面積。最后，為了趨勢和生物標(biāo)志物的檢測，將波PLS方法主要是通過自身主成分的提取來代償結(jié)構(gòu)噪聲的影響，而O-PLS則通過旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系消除結(jié)構(gòu)噪聲，從而使得對照組和處理組的差別達(dá)到最大。但是O-PLS的使用必須以PLS模型通過模型驗(yàn)證為基礎(chǔ)，它僅用于尋找引起模型發(fā)生差異的代謝物。經(jīng)過PLS(或O-PLS)分析的數(shù)據(jù)最終通過相關(guān)系數(shù)圖可視化表現(xiàn)

19、出來。譜標(biāo)準(zhǔn)化并且合并成一個單一數(shù)據(jù)矩陣，再(MVA)。變量分析對MS而言，盡管在代謝組學(xué)研究中可以應(yīng)用MS檢測器和色譜分離器的各種組合，但MS數(shù)據(jù)預(yù)處理的基本原 則都相同，主要包括奇異點(diǎn)剔除、去噪、基線校準(zhǔn)、峰對準(zhǔn)、峰識別、峰特征提取以及結(jié)果整理等步驟。首先，必須檢 測出與分析生物試材無關(guān)的化合物信號，并且從分析中剔除。這種信號通常是由于儀器和/或樣品污染、溶劑雜質(zhì)，以及/或柱流失和用于樣品衍生(即GC/MS)的試劑引起的。若不能檢出這些信號將會在結(jié)果的生物學(xué)解釋時(shí)產(chǎn)生嚴(yán)重1.4 代謝組學(xué)的網(wǎng)絡(luò)與結(jié)果的生物學(xué)解釋已經(jīng)開發(fā)出大量供代謝組據(jù)預(yù)處理、分析和可視化使用的聯(lián)機(jī)軟件以及聯(lián)機(jī)代謝數(shù)據(jù)庫，為

20、應(yīng)用代謝組學(xué)開辟了新視野。文獻(xiàn)27詳盡地列出了這些。失實(shí)。按與生物試樣相同規(guī)程的空白樣品的分析則代謝組學(xué)分析產(chǎn)生海量數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)的生物學(xué)解釋對檢測這些信號極其有用。其次，根據(jù)保留時(shí)間或者比(m /z )調(diào)整(對齊)質(zhì)譜。再次，檢測并匯總來源于單一化要求高、耗時(shí)長，并且為了理學(xué)過程與生物系統(tǒng)中代謝途徑的相互關(guān)系，需要高通量工具。與用于數(shù)據(jù)預(yù)處理和分析的軟件開發(fā)相反，只有少數(shù)幾個便于代謝組據(jù)并入代謝網(wǎng)絡(luò)的軟件包可供使用。在這些軟件包中，軟件Cytoscape28通過MetaNetter29和Metscape30等插件可實(shí)現(xiàn)幾項(xiàng)高通量代謝組學(xué)應(yīng)用。合物的多重信號。這些信號可能是全衍生(即GC/MS

21、)或者不同的離子化模式(即FT-ICR/MS，軌道阱MS)的結(jié)果。最后，為了趨勢和生物標(biāo)志物的檢測，將總離子色譜圖(TIC)或者M(jìn)S質(zhì)譜圖標(biāo)準(zhǔn)化，并且變量分析(MVA)。多變量分析(MVA)是分析代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)得到的大量數(shù)據(jù)的主要統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，通常包括非監(jiān)督和監(jiān)督2種分類方法。非監(jiān)督的模式識別方法通常包括數(shù)據(jù)點(diǎn)的降維處理2 代謝組中的應(yīng)用進(jìn)展2.1 代謝組植物是除草劑作用模式(MoA)分類和鑒定除草劑MoA分類和鑒定中應(yīng)用的說明大量不同物理化學(xué)性質(zhì)代謝產(chǎn)物所組和聚類分析，前者是指用空間中主要的幾個成分來代表整體數(shù)據(jù)；后者是指尋找有聚類趨勢樣本的共同特征。成的各種生化系統(tǒng)的復(fù)雜生物。大多數(shù)除草劑將植

22、物為其生存和發(fā)育所需的主要功能作為靶標(biāo)。對眾多商業(yè)開發(fā)的除草劑而言，根據(jù)除草劑抗性行動委員會(HRAC)的數(shù)據(jù)，目前已有20多種不同MoA(或靶標(biāo)作用位點(diǎn))得到明確?？紤]到植物代謝的復(fù)雜性和植物代謝組的巨大規(guī)模 (植物界代謝物數(shù)量估計(jì)超過10萬種)，而實(shí)際上只有為數(shù)不多的生化位點(diǎn)成為現(xiàn)有除草劑的靶標(biāo)，這說明對除草劑而言尚有許多生化靶標(biāo)未被利用。大自然是具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和MoA的生物活性化合物的有價(jià)值且取之不竭之源。早期的代謝組采用非監(jiān)督方法來處理數(shù)據(jù)，其優(yōu)勢主要是能在不具備任何樣品分組信息的情況下通過對數(shù)據(jù)降維，實(shí)現(xiàn)樣本代謝表型內(nèi)在關(guān)系的可視化，旨在認(rèn)識分布在空間數(shù)據(jù)點(diǎn)潛在的特點(diǎn)和相互之間的。這種

23、方法可以盡可能地顯示出數(shù)據(jù)集中不同樣本之間內(nèi)在的異同點(diǎn)、分離趨勢或異常數(shù)據(jù)點(diǎn)的存在使模型出現(xiàn)過度擬合的問題。主要有主成分分析(PCA)、層序聚類分析(HCA)等，其中以PCA最常用。PCA方法的主要應(yīng)用在于觀察實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械慕M間分離趨勢以及是否有異常點(diǎn)的出現(xiàn)。經(jīng)過PCA分析的數(shù)據(jù)可通過得分圖和負(fù)載圖已開發(fā)出一些生物活性化合物和/或其化學(xué)類似物用作新型除草劑。在評估作為新型除草劑而開發(fā)出的生物農(nóng) 藥 AGROCHEMICALS第52卷862活性化合物的過程中，與現(xiàn)有除草劑共享相同亞細(xì)胞靶標(biāo)的化合物，或者無選擇性影響存在于靶標(biāo)和非靶標(biāo)生物體中的代謝過程的化合物，都不大可能被選擇用于進(jìn)一步評養(yǎng)物中分離

24、出來的，是不實(shí)野燕麥選擇性植物性毒素。運(yùn)用偏最小二乘判別分析法(PLS-DA)，將不實(shí)野燕麥經(jīng)pyrenophorol處理后的1H NMR代謝變化與估?？紤]到候選除草劑的數(shù)量巨大，以及檢測它們的由抑制八氫番茄紅素脫飽和酶(PDS)、原卟啉原氧化酶MoA耗力、耗時(shí)且開支大的實(shí)際情況，迫切需要開發(fā)出一種簡捷、魯棒且高通量的篩選技術(shù)。代謝組學(xué)十分理想(PPO)、EPSPS、4-羥苯基酸雙加氧酶(4-HPPD)、PSII和I(PSI)電子傳遞等6種最常見植物毒素MoA的地滿足了這些要求。首先，代謝組學(xué)可以檢測到具有除草劑處理所產(chǎn)生的代謝變化相比較。分析結(jié)果表已知MoA的生物活性化合物的生物體的代謝物變

25、化。其次，這些變化與所施用生物活性化合物的MoA有著間接關(guān)系。因此，基于代謝組學(xué)模型的開發(fā)，有利于MoA的快速明，pyrenophorol有著與被測試除草劑不同的MoA，說明pyrenophorol是作物保護(hù)背景為重要先導(dǎo)值得做進(jìn)一步考慮。Aliferis等34還在模式植物浮萍(L. minor L.)分類和鑒定研究將集中于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)一種或幾種上使用1H NMR圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pyrenophorol導(dǎo)致植MoA，以及對研究中的生物活性化合物的MoA進(jìn)行解釋。然而，開發(fā)用于生物活性化合物MoA研究的魯棒代謝組學(xué)模型是一個復(fù)雜的過程。必須考慮到幾個因素，例如用于分析的合適生物體或組織的選擇，以及

26、決定毒性作用嚴(yán)重物代謝組改變，其類似于草甘膦(EPSPS抑制劑)引起的植物代謝組改變，表明對這2種化合物而言有著類似的MoA。在堺市大阪府立大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)，Oikawa等35探討了使用MS分析平臺識別除草劑MoA的潛力。他們用擬南芥(A. thaliana L.)作為模式植物，開發(fā)出了用于除草劑MoA自動化檢測的FT-ICR/MS分析與PCA計(jì)算數(shù)據(jù)工具聯(lián)用的代謝組學(xué)模型，對表現(xiàn)4種不同MoA的除草劑加以鑒別和分類。結(jié)果揭示了各處理間代謝組聚類截然不同，而詳細(xì)對比代謝組，可檢測出除草劑處理之后特異性代謝物積累。然而，僅在用草甘膦處理的植物上檢測到MoA的特定生物標(biāo)志物，其中觀察到了莽草酸磷

27、酸鹽(莽草酸3P)的積累。程度的生物活性化合物使用劑量時(shí)間及環(huán)境條件之間組合。對代謝組學(xué)而言，在實(shí)驗(yàn)條件集下使用亞致死劑量生物活性化合物是更可取的。開發(fā)用于物活性化合物MoA的生物系統(tǒng)所使用的代謝組學(xué)模型，會有助于加快除草劑的研究和開發(fā)。這些方法既可僅限于對接觸生物活性化合物的生物體代謝譜圖進(jìn)行高通量分類和鑒別，又可以延伸到毒性生物標(biāo)志物的檢測。后者對于毒理學(xué)研究和草害綜合防治策略都有著極高價(jià)值。2.2 代謝組除草劑MoA分類和鑒定中的應(yīng)用研究在德國克植物生理學(xué)，在美國新澤西州普林斯頓市巴斯夫農(nóng)業(yè)，Trenkamp等36用擬南芥(A. thaliana L.)作為模式植物，采取GC-TOF/M

28、S進(jìn)行代謝輪廓(譜)分析，得到數(shù)據(jù)進(jìn)行主成Aranibar等31首次開展了代謝組除草劑MoA自動化檢測中的應(yīng)用。在這項(xiàng)研究中，他們用玉米(Zea mays L.)作模式植物，應(yīng)用1H NMR波譜技術(shù)，開發(fā)出根據(jù)除草劑MoA對除草劑進(jìn)行分類的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。用乙酰羥酸合酶(AHAS，還稱為乙酰乳酸合酶-ALS)、乙酰輔酶A羧化酶分分析(PCA)后，再進(jìn)行成份分析(ICA)，使分析結(jié)果最優(yōu)化。除草劑選用分別代表谷氨酰胺酶、4-羥基苯(不明靶標(biāo))、乙(VLCFA)和酸雙加氧酶(4-HPPD)素生物酰乳酸5-烯醇酶(ALS)、超長鏈脂肪酸生物酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制劑的草銨(ACCa

29、se)、5-烯醇酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)以及II(PSII)的抑制劑處理之后，實(shí)現(xiàn)了植物代謝組之間鑒別，植物代謝組變化與4種除草劑MoA之間相關(guān)性結(jié)果 令人滿意。之后，該研究團(tuán)隊(duì)仍然使用玉米作模式生物，膦、磺草酮、AE944、甲酰胺磺隆、呋草磺和草甘膦。這項(xiàng)研究采取GC-TOF/MS得到的與時(shí)間相關(guān)的代謝物輪廓(譜) 分析表明，單靠極性初級代謝產(chǎn)物的變化就可鑒別分別代表谷氨酰胺素生物酶、4-羥基苯酸雙加氧酶(4-HPPD)、分析依舊是1H NMR，又用代表19種不同MoA的除草劑進(jìn)行試驗(yàn)32，完善了之前的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。基于1H NMR波譜中所表達(dá)的代謝組自動圖形識別分析研究了1

30、9種MoA，結(jié)果證實(shí)，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)不但可用于19種MoA分類，并且還可用于新MoA的鑒別。(不明靶標(biāo))、乙酰乳酸酶(ALS)、5-烯醇酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制的除草劑的MoA。但應(yīng)該指出，這種方法具有明顯的局限性，例如，它無法為超長鏈脂肪酸延長酶抑制劑呋草黃以及某些其他類型除草劑，例如那些從激素方面影響植物功能的除草劑的MoA提供有用的線索。，Aliferis等33在希臘雅典農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)開發(fā)出一種與多變量分析聯(lián)用的1H NMR代謝分表1列出了代謝組除草劑MoA分類和鑒定研究析方法，用于鑒別天然植物毒素pyrenophorol的MoA。異構(gòu)體(5S ,8R ,13S ,16R )

31、-(-)-pyrenophorol是從不實(shí)野燕麥(A. sterilis L.)寄主專化性燕麥德氏霉致病型真菌的培中的應(yīng)用情況?？梢钥闯觯簝H就已知20多種MoA的除草劑而言，迄今為止，國外基于代謝組已知MoA的除草劑第12期，等：代謝組除草劑作用模式分類和鑒定研究中的應(yīng)用進(jìn)展863進(jìn)行分類和鑒定的相關(guān)研究也只涉獵了其中的19種已知MoA的除草劑，這些研究還僅僅處于初級階段，仍有幾種已知MoA的代謝組學(xué)分類和鑒別研究尚屬空白，而代謝生物標(biāo)志物鑒定研究工作則剛剛起步。表1 代謝組除草劑作用模式分類和鑒定研究中的應(yīng)用情況HRAC1) WSSA1)參考文獻(xiàn)模式生物2) 分析平臺3)數(shù)據(jù)分析方法4)作用

32、模式 (作用位點(diǎn)或靶標(biāo))化學(xué)結(jié)構(gòu)類型除草劑有效成分分類分類A1乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)抑制 芳氧苯氧丙酸酯類 喹氟草酯A. thaliana FT-ICR/MSA. thaliana FT-ICR/MSZ. mays1H NMRZ. mays1H NMRMVA (PCA) MVA (PCA) NNNN353531-3231-32環(huán)己烯酮類禾草滅、烯草酮烯禾啶咪草酸、滅草煙、咪唑乙煙酸甲氧咪草煙氯磺隆、甲嘧磺隆B2乙酰羥酸乳酸酶(AHAS)或乙酰咪唑啉酮類酶(ALS)抑制A. thaliana FT-ICR/MSZ. mays1H NMRMVA (PCA) NNMVA (PCA) MVA

33、 (PCA), ICA NNNN3531-3235363231-32磺酰脲類氯吡嘧磺隆、吡嘧磺隆 A. thaliana FT-ICR/MS甲酰胺磺隆環(huán)草定敵草隆敵草隆敵草隆溴苯腈百草枯(H)百草枯(H)百草枯(H) 氟鎖草醚草酮草酮達(dá)草滅達(dá)草滅達(dá)草滅磺草酮磺草酮硝磺草酮硝磺草酮芐草唑、吡唑特殺草強(qiáng)A. thaliana GC-TOF/MS1H NMR1H NMR1H NMR1H NMR1H NMR1H NMR1H NMR1H NMR1H NMR1H NMR1H NMR1H NMR1H NMR1H NMR1H NMRC57II (PSII)處光合作用抑制II (PSII)處光合作用抑制尿嘧啶類

34、脲類Z. maysZ. maysA. sterilisL. minor L.Z. maysZ. maysA. sterilisL. minor L.Z. maysA. sterilisL. minor L.Z. maysA. sterilisL. minor L.Z. mays1C2MVA (PCA, PLS-DA, SIMCA) 33MVA (PCA, PLS-DA, HCA) NNNN343232C622II (PSII)處光合作用抑制 I (PSI)電子轉(zhuǎn)移抑制腈類聯(lián)吡啶類3DMVA (PCA, PLS-DA, SIMCA) 33 MVA (PCA, PLS-DA, HCA) 34原卟啉

35、原氧化酶(PPO)抑制二苯醚類二唑類E14NN32MVA (PCA, PLS-DA, SIMCA) 33 MVA (PCA, PLS-DA, HCA) 34F112褪色：在八氫番茄紅素去飽和酶噠嗪類NN32(PDS)處類胡蘿卜素生物抑制的MVA (PCA, PLS-DA, SIMCA) 33MVA (PCA, PLS-DA, HCA) NNMVA (PCA), ICA343236F27褪色：4-羥基苯基酶(4-HPPD)抑制酸雙氧化三酮類2A. thaliana GC-TOF/MSA. sterilis1H NMR MVA (PCA, PLS-DA, SIMCA) 33L. minor L.

36、1H NMR MVA (PCA, PLS-DA, HCA)343532吡唑類三唑類A. thaliana FT-ICR/MSZ. mays1H NMRMVA (PCA) NNF11褪色：類胡蘿卜素生物(不明靶標(biāo))抑制3G95-烯醇式酰莽草酸-3-磷氨基乙酸類草甘膦草甘膦草甘膦草甘膦草甘膦Pyrenophorol 雙丙氨膦草銨膦磺草靈氨磺樂靈苯胺靈乙草胺呋草磺二氯喹啉酸AE944地樂酚萘草胺Z. mays1H NMRA. sterilis1H NMRL. minor L. 1H NMRA. thaliana FT-ICR/MSNN31-32酸合酶(EPSPS)抑制MVA (PCA, PLS-DA

37、, SIMCA) 33MVA (PCA, PLS-DA, HCA) MVA (PCA)MVA (PCA), ICA343536A. thaliana GC-TOF/MSA. sterilis1H NMR MVA (PCA, PLS-DA, SIMCA) 33不明(EPSPS?)谷氨酰胺大環(huán)內(nèi)酯類次膦酸類Z. mays1H NMRA. thaliana GC-TOF/MSH10酶(GS)抑制NNMVA (PCA), ICA NNNN NN NNMVA (PCA), ICA NNMVA (PCA), ICA NNNN32363232323236323632321H NMR1H NMR1H NMR1

38、H NMRI K1 K2 K31832315二氫蝶酸(DHP) 微管組裝抑制抑制氨基甲酸酯類Z. maysZ. maysZ. maysZ. mays二胺類有絲/微管組織抑制氨基甲酸酯類氯乙酰胺類苯并呋喃烷基磺酸酯類喹啉羧酸類超長鏈脂肪酸(VLCFAs)抑制細(xì)胞抑制)A. thaliana GC-TOF/MSL26細(xì)胞壁(素)抑制Z. mays1H NMRA. thaliana GC-TOF/MSZ. mays1H NMRZ. mays1H NMRM P2419氧化磷酸化解偶聯(lián)(膜破壞) 植物生長素輸送抑制二酚類鄰苯二甲酸酯類注：1) HRAC：除草劑抗性行動委員會；WSSA：美國雜草科學(xué)學(xué)會。

39、2) A. sterilis ：不實(shí)野燕麥；A. thaliana ：擬南芥；L. minor L ：浮萍；Z. mays：玉米。3) FT-ICR/MS葉變換-離子回旋共振/質(zhì)譜儀；GC-TOF/MS氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀；1H NMR：質(zhì)子核磁共振波譜儀。4) HCA：層序聚類分析法；ICA成分分析法；MVA：多變量分析法；NN：神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法；PCA：主成分分析法；PLS-DA：偏最小二乘分類分析法；SIMCA：簇類軟模式法。劑MoA的魯棒代謝組學(xué)(代謝分析)模型，對除草劑3 展望雖然代謝組學(xué)不是一種通用解決方案，但作為系統(tǒng)生物學(xué)的一種新工具，開發(fā)利用合適模式生物自動鑒別除草MoA進(jìn)行

40、大量候選的高通量篩選，在研究初期就將生物活性篩選鑒定出來，必將成為開發(fā)新型除草劑864農(nóng) 藥 AGROCHEMICALS第52卷的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，可極大地縮短新型除草劑研究和開發(fā)進(jìn)Chromatography B, 2009, 877: 1352-1358.MONTON M R N, SOGA T. Metabolome Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass SpectrometryJ. Journal of Chromatography A, 2007, 1168: 237-246.12程。用已經(jīng)完成組的生物用作模式生物，會很大物活性化合物MoA

41、的代謝組程度上促進(jìn)開發(fā)用于學(xué)模型。極有價(jià)值的還是利用代謝組學(xué)(代謝輪廓(譜)分析)檢測作為某個給定MoA的生物標(biāo)志物的代謝物。雖然13KRALYA J R, HOLCOMBA R E, GUANA Q,. Review:Microfluidic Applications in Metabolomics and MetabolicProfilingJ. Analytica Chimica Acta, 2009, 653: 23-35.應(yīng)用代謝組學(xué)(代謝輪廓(譜)分析)鑒別不同MoA的生物標(biāo)14TAKAHASHI H, KAI K, SHINBO Y,. Metabolomics志物的研究還處于剛

42、剛起步階段，希望能在代謝組使Approach for Determining Growth-specific Metabolites Based on Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass SpectrometryJ. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2008,391: 2769-2782.用具有卓越分析能力的先進(jìn)分析儀器來促進(jìn)各種MoA的生物標(biāo)志物的鑒別和檢測。應(yīng)用代謝組學(xué)還可以研究代表除草劑MoA重要成分的化合物MoA的明確結(jié)論生物活性。關(guān)于生物活性代謝組學(xué)與其他組據(jù)15TAYLOR N

43、 S, WEBER R J M, SOUTHAM A D,. A NewApproach to Toxicity Testing in Daphnia Magna: Application of High Throughput ft-icr Mass Spectrometry MetabolomicsJ.Metabolomics, 2009, 5: 44-58.一起聯(lián)用。值得指出，現(xiàn)有植物代謝途徑知識的備以及缺乏用于代謝組學(xué)的統(tǒng)一分析方法是代謝組學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化需要迫切解決的問題。此外，將用于分析多元復(fù)雜樣品的16HU Qi-zhi, NOLL R J, LI Hong-yan,. The Orbit

44、rap: A NewMass SpectrometerJ. Journal of Mass Spectrometry and IonPhysics, 2005, 40: 430-443.不同分析儀器集成一體，以及在生物據(jù)分析法的17OKADA T, NAKAMURA Y, KANAYA S,. Metabolome背景下將代謝組學(xué)與其他組學(xué)方法集成起來，有望提出代謝網(wǎng)絡(luò)功能和調(diào)節(jié)的新見解。參考文獻(xiàn)：Analysis of Ephedra Plants with Different Contents of EphedrineAlkaloids by Using UPLC-Q-TOF-MSJ. P

45、lanta Medica, 2009, 75: 1356-1362.18LV Yong-hai, LIU Xin-ru, YAN Shi-kai,. Metabolomic1OLIVER S G, WINSON M K, KELL D B,. SystematicStudy of Myocardial Ischemia and Intervention Effects of Compound Danshen Tablets in Rats Using Ultra-performance Liquid Chromatography/Quadrupole Time-of-flight Mass S

46、pectrometryJ. Journal of Pharmaceutical and BiomedicalAnalysis, 2010, 52: 129-135.Functional Analysis of the Yeast GenomeJ. Trends Biotechnol, 1998, 16(9): 373-378.FIEHN O. Metabolomics-the Link between Genotypes andPhenotypesJ. Plant Mol Biol, 2002, 48(1/2): 155-171.23TAYLOR J, KING R D, ALTMANN T,

47、. Application of19ATHERTON H J , BAILEY N J , ZHANG W,. AMetabolomics to Plant Genotype Discrimination Using Statistics and Machine LearningJ. Bioinformatics, 2002, 18: S241- S248. NIKOLAU B J, WURTELE E S. Concepts in Plant MetabolomicsM. Dordrecht, the Netherlands Springer, 2007: 11- 15.KRISHNAN P

48、, KRUGER N J, RATCLIFFE R G. MetaboliteFingerprinting and Profiling in Plants Using NMRJ. Journal of Experimental Botany, 2005, 56: 255-265.LINDON J C, NICHOLSON J K. Analytical Technologies for Metabonomics and Metabolomics, and Multi-Omic Information RecoveryJ. Trends in Analytical Chemistry, 2008

49、, 27: 194-204. DUNN W B. Current Trends and Future Requirements for the Mass Spectrometric Investigation of Microbial, Mammalian and Plant MetabolomesJ. Physical Biology, 2008, 5: 1-24.ALLWOOD J W, GOODACRE R. HPLC Instrumentation Applied in Plant Metabolomic AnalysesJ. Phytochemical Analysis, 2010,

50、21: 33-47.Combined 1H NMR Spectroscopy-and Mass Spectrometry-based Metabolomic Study of the PPAR- null Mutant Mouse Defines Profound Systemic Changes in Metabolism Linked to the Metabolic SyndromeJ. Physiological Genomics, 2006, 27: 178-186.420MOCO S, FORSHED J, DE VOS R C H,. Intra and5Intermetabol

51、ite Correlation Spectroscopy of Tomato Metabolomics Data Obtained by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry and Nuclear Magnetic ResonanceJ. Metabolomics, 2008, 4: 202-215. BIAIS B, ALLWOOD J W, DEBORDE C, . 1H NMR, GC-EI-TOFMS, and Data Set Correlation for Fruit Metabolomics: Application to Spatia

52、l Metabolite Analysis in MelonJ. AnalyticalChemistry, 2009, 81: 2884-2894.621722LEON C, RODRIGUEZ-MEIZOSO I, LUCIO M,.Metabolomics of Transgenic Maize Combining Fourier Transform- ion Cyclotron Resonance-Mass Spectrometry, Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry and Pressurized Liquid Extraction

53、J. Journal of Chromatography A, 2009, 1216: 7314-7323.89GUILLARME D, SCHAPPLER J, RUDAZ S,. CouplingUltra-high-pressure Liquid Chromatography with Mass SpectrometryJ. Trends in Analytical Chemistry, 2010, 29: 15-27.10 FARDET A, LLORACH R, MARTIN J F. Liquid Chromatography- quadrupole Time-of-flight (Lc-Qtof)-based Metabolomic Approach Reveals New Metabolic Effects of Catechin in Rats Fed High-fatDietsJ. Journal of Proteome Research, 2008, 7: 2388-2398.23MCKELVIE J R, YUK J, XU Yun-ping,. 1H NMR and GC/MS Metabolomics of Earthworm Responses