電泳實(shí)際操作指導(dǎo)

1、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像實(shí)驗(yàn)步驟和凝膠成像實(shí)驗(yàn)步驟凝膠電泳是分離和純化DNA片段最常用的技術(shù)。根據(jù)制備凝膠的材料: 瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳凝膠電泳 聚丙烯酰胺電泳一、瓊脂糖凝膠電泳一、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖的孔徑大，可以分離長(zhǎng)度為瓊脂糖的孔徑大，可以分離長(zhǎng)度為100bp至至60kb的核酸片斷；的核酸片斷；聚丙烯酰胺凝膠的孔徑小，可分離小片斷（聚丙烯酰胺凝膠的孔徑小，可分離小片斷（5-50bp）的核酸。）的核酸。DNADNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，把DNA樣品加入到一塊包含電解質(zhì)的多孔支持介質(zhì)（瓊脂糖凝膠）的樣品孔中，并置于靜電場(chǎng)上。由于DNA分子的雙螺旋

2、骨架兩側(cè)帶有含負(fù)電荷的磷酸根殘基，因此在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。1 1、實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。因而就可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。該過(guò)程可以通過(guò)把分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測(cè)。凝膠電泳不僅可分離不同分子質(zhì)量的DNA， 也可以分離相

3、對(duì)分子質(zhì)量相同，而構(gòu)型不同的DNA分子。 溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計(jì)樣品DNA濃度。 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：EBEB是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作要保持安靜，注意樣品不能混樣。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作要保持安靜，注意樣品不能混樣。2 2、實(shí)驗(yàn)步驟、實(shí)驗(yàn)步驟 1g 瓊脂糖加入100ml 1TAE電泳緩沖液中，搖勻，在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。 將內(nèi)槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。將冷卻到65左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心

4、地倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個(gè)玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固。 充分凝固后小心垂直向上拔出梳子。將凝膠置入電泳槽中，加1TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm。 用移液器吸取總DNA或質(zhì)粒樣品xl于一次性手套上，再加入一定量的6X/10X loading buffer，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔。每加完一個(gè)樣品，應(yīng)更換一個(gè)加樣頭，以防污染，加樣時(shí)勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序）。 打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)，電泳約30min-60min：當(dāng)指示劑跑過(guò)膠板的2/3，可終止電泳。 將凝膠放入E

5、B染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。 將染色后的凝膠置于紫外透射檢測(cè)儀上，蓋上防護(hù)觀察罩，打開紫外燈，可見到發(fā)出熒光的DNA條帶。植物總（核）DNA樣品應(yīng)呈現(xiàn)一條遷移率很小的整齊條帶。質(zhì)粒DNA的存在形式有3種： 共價(jià)閉環(huán)DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在； 開環(huán)DNA（ocDNA），此種質(zhì)粒DNA的兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂，因此可以自由旋轉(zhuǎn)從而消除張力，形成松弛的環(huán)狀分子； 線狀DNA，因質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂而造成。因此質(zhì)粒DNA電泳的結(jié)果中有可能出現(xiàn)三條泳帶，它們的泳動(dòng)速度為：cccDNA 線狀DNA ocDNA。原質(zhì)粒酶切后質(zhì)粒ocDNA線狀DNAccc

6、DNA（1）瓊脂糖含液體量大，可達(dá)98-99%，近似自由電泳，但是樣品的擴(kuò)散度比自由電泳小。（2）電泳速度快。（3）透明而不吸收紫外線，可以直接用紫外檢測(cè)儀作定量測(cè)定。（4）樣品易回收，常用于制備。3、瓊脂糖電泳的優(yōu)點(diǎn)v 配制多大濃度的瓊脂糖凝膠，要根據(jù)被檢的DNA分子大小來(lái)確定。一般瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳適用于大小在0.1kb60kb范圍內(nèi)的DNA片段 瓊脂糖凝膠濃度與線性瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA分辨范圍分辨范圍 常用的電泳緩沖液常用的電泳緩沖液4 保存?zhèn)溆?常用的常用的6X6X載樣載樣緩沖液緩沖液 0.25%溴酚藍(lán) ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液 0.25%溴酚藍(lán) ，0.

7、25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液二、凝膠成像二、凝膠成像 1 打開凝膠成像儀電源（機(jī)器后部），開電腦； 2 將染色后凝膠用水沖洗后，將凝膠放在透射板正中， 并關(guān)嚴(yán)暗倉(cāng)門，打開紫外燈； 3 打開Quantity one軟件，點(diǎn)擊basic，F(xiàn)ile中選擇 Get Doc EQ，調(diào)節(jié)使圖象到達(dá)合適亮度、大小及清晰度； 4 待圖象最優(yōu)化時(shí)，成像freeze在屏幕上，關(guān)閉紫外燈， 點(diǎn)擊“Save”保存； 5 關(guān)閉軟件； 6 打開暗倉(cāng)門，拉出透射臺(tái)，凝膠丟棄至專門垃圾桶， 插掉透射板上水跡； 7 關(guān)上暗倉(cāng)門。1、具體步驟、具體步驟2、Quantity One 軟件軟件 是The Discovery Series 軟件家族的成員，它是一 個(gè)功能強(qiáng)大的靈活軟件包，可成像和分析一維電泳凝膠、斑點(diǎn)印跡、狹線 印跡和菌落計(jì)數(shù)。 Quantity One 軟件能定量和分析多種數(shù)據(jù)，包括從光密 度儀、儲(chǔ)能磷屏成像儀、熒光成像儀和凝膠成像凝膠成像系統(tǒng)采集的放射性、化學(xué) 發(fā)光、熒光和染色等樣品。Quantity One提供自動(dòng)分析功能以快速獲取高 質(zhì)量結(jié)果