生化實(shí)驗(yàn)講義201010個(gè)

1、生 物 化 學(xué) 實(shí) 驗(yàn) 講 義趙國(guó)芬2010年9月實(shí)驗(yàn)之前說(shuō)明1. 各班學(xué)習(xí)委員將成員分成10個(gè)大組,每個(gè)大組中2人一小組,大組采用循環(huán)實(shí)驗(yàn)的方法,同時(shí)開(kāi)出不同的10個(gè)實(shí)驗(yàn).2. 共開(kāi)出10個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一 溫度、pH及酶的激活劑、抑制劑對(duì)酶活性的影響實(shí)驗(yàn)二 牛奶中蛋白質(zhì)的提取與鑒定實(shí)驗(yàn)三 血液葡萄糖的測(cè)定-福林（Folin）-吳憲氏法實(shí)驗(yàn)四 雙縮脲測(cè)定蛋白質(zhì)的含量實(shí)驗(yàn)五 血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗(yàn)六 植物組織中還原糖和總糖的含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)七 應(yīng)用紙層析法鑒定動(dòng)物組織中轉(zhuǎn)氨基作用實(shí)驗(yàn)八 植物組織中維生素C的定量測(cè)定實(shí)驗(yàn)九 琥珀酸脫氫酶的作用及其競(jìng)爭(zhēng)性抑制的觀察實(shí)驗(yàn)十 植物組織中DNA的提取

2、和鑒定3. 穿著要利索,做好實(shí)驗(yàn)記錄4. 注意實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生和安全.一. 實(shí)驗(yàn)室規(guī)則:按照實(shí)驗(yàn)室的規(guī)則給學(xué)生講解.二. 生物化學(xué)所用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)1. 樣品: 動(dòng)物樣品:血液、血漿、血清、組織 植物樣品：果實(shí)、花蕾、莖等無(wú)論用什么做材料，為了提取物質(zhì)，需勻漿2移液管的使用：移液 管吸管移液管奧氏吸管讀數(shù)時(shí)視線與凹面相平，取液時(shí)要用吸管嘴吸，放出液體時(shí)注意嘴部液體的殘留問(wèn)題。3離心機(jī)的使用：平衡（管平衡、機(jī)器平衡）緩起和慢停4分光光度計(jì)機(jī)器原理和測(cè)定原理（比爾定律）5水浴鍋的使用三、實(shí)驗(yàn)報(bào)告的書(shū)寫(xiě)（用教務(wù)處統(tǒng)一印刷的報(bào)告紙寫(xiě)）目的、原理、儀器、藥品、步驟、結(jié)果及結(jié)論、討論實(shí)驗(yàn)一、溫度、pH及酶的激活劑、

3、抑制劑對(duì)酶活性的影響一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)了解酶催化的特異性以及pH、溫度、抑制劑和激活劑對(duì)酶活力的影響，對(duì)于進(jìn)一步掌握代謝反應(yīng)及其調(diào)控機(jī)理具有十分重要的意義。二、實(shí)驗(yàn)原理 酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)。凡是能夠引起蛋白質(zhì)變性的因素，都可以使酶喪失活性。此外，溫度、pH和抑制劑、激活劑對(duì)酶的活性都有顯著的影響。酶的活性通常是用測(cè)定酶作用底物在酶作用前后的變化來(lái)進(jìn)行觀察的。 本實(shí)驗(yàn)用唾液淀粉酶作用的底物淀粉，被唾液淀粉酶分解成各種糊精、麥芽糖等水解產(chǎn)物的變化來(lái)觀察該酶在各種環(huán)境條件下的活性。 淀粉被酶水解的變化，可以用遇碘呈不同顏色來(lái)觀察。淀粉遇碘呈藍(lán)色;糊精按分子從大到小的順序，遇碘可呈藍(lán)色、紫色、暗

4、褐色和紅色;最小的糊精和麥芽糖遇碘不呈現(xiàn)顏色反應(yīng)。 三、試劑%淀粉溶液 2.碘化鉀碘溶液 3.1%尿素溶液。4.1%CuSO4溶液 5.磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液pH5.0-8.0:%NaCl溶液。7.唾液淀粉酶制備 每人用自來(lái)水漱口3次，然后取20m1蒸餾水含于口中，半分鐘后吐入燒杯中，紗布過(guò)濾，取濾液lOml，稀釋至2Oml為稀釋唾液，供實(shí)驗(yàn)用。四、操作步驟一、溫度對(duì)酶活性的影響（一） 淀粉酶的觀察1、 取3支大試管，編號(hào)后按表操作試管號(hào)0.5%淀粉溶液稀釋酶液溫度1235ml5ml5ml1ml1ml1ml0水浴37水浴沸水浴2、在白色比色板上，置碘液2滴于各孔中，每隔1分鐘，從第二管中取出反

5、應(yīng)液1滴與碘混合，觀察顏色變化。3、待第二管中反應(yīng)液遇碘不發(fā)生顏色變化（即只呈碘的顏色）時(shí)，向各管中加入碘液1滴，搖勻，觀察并記錄各管顏色，說(shuō)明溫度對(duì)酶活性的影響。結(jié)果與分析：結(jié)果：各管顏色分析：為什么比如：結(jié)果與分析：1號(hào)中為蘭色，2號(hào)為無(wú)色，3號(hào)為蘭色說(shuō)明37為淀粉酶的活性最高的溫度，淀粉水解的速度最快，其它2個(gè)溫度淀粉酶的活性低，淀粉幾乎沒(méi)有水解。二、pH對(duì)酶活性的影響 1、取試管1支，加入pH6.8的磷酸緩沖溶液3m1、0.5%淀粉溶液2ml，混勻。放置于37水浴中保溫3分鐘。再加入稀釋唾液2ml，混勻，繼續(xù)保溫，每隔l分鐘取出1滴于白瓷板上，加碘液1滴，觀察淀粉水解的程度，直至碘不變

6、色，記下保溫時(shí)間。 2、另取試管5支，編號(hào)，按編號(hào)順序分別加入pH5.0、 6.2、6.8、7.4、8.0的磷酸鹽檸檬酸緩沖溶液3m1，每管加入0.2%淀粉溶液2m1。置37水浴中保溫3分鐘后，以1分鐘的間隔，依次向1-5號(hào)試管中加入稀釋唾液2m1，搖勻，37水浴中保溫。參照上述第一步實(shí)驗(yàn)的保溫時(shí)間，到時(shí)迅速取出，并立即加入碘液2滴，充分搖勻，觀察各管呈現(xiàn)的顏色，判斷在不同pH條件下淀粉的水解的程度?？梢钥闯鰌H對(duì)唾液淀粉酶活性的影響，并確定最適pH。結(jié)果與分析：結(jié)果：各管顏色分析：為什么三、酶的激活劑、抑制劑對(duì)酶活性的影響1. 取小試管3支，按表操作 試管號(hào)0.5%淀粉溶液1%CuSO4溶液

7、0.5%NaCl溶液蒸餾水稀釋唾液結(jié)果1232ml2ml2ml1 ml0001ml0001ml1 ml1 ml1 ml分析2. 將3支試管放入37水浴中，并在白色比色板上用碘液檢查第二管，待碘液不變色時(shí)，向各管中加碘液1滴，觀察水解情況，記錄并解釋結(jié)果。結(jié)果與分析：結(jié)果：各管顏色分析：為什么四酶的高效性試管號(hào)H2O2生馬鈴薯熟馬鈴薯鐵粉結(jié)果12343ml3ml3ml3ml少許000少許000少許分析實(shí)驗(yàn)二 牛奶中蛋白質(zhì)的提取與鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)從牛奶中制備酪蛋白的方法并進(jìn)行鑒定試驗(yàn)二、實(shí)驗(yàn)原理 牛乳和羊乳中含豐富的蛋白質(zhì)，其中主要是酪蛋白。酪蛋白在其等電點(diǎn)pH溶液中溶解度降低。所以，將牛乳

8、的pH調(diào)整至4.8，即酪蛋白的等電點(diǎn)時(shí)，酪蛋白即沉淀出來(lái)。用乙醇除去酪蛋白沉淀中不溶于水的脂肪，得到純的酪蛋白。所得酪蛋白供定性鑒定。 除去酪蛋白的濾液中，尚含有球蛋白、清蛋白等多種蛋白質(zhì)。三、試劑1.醋酸鈉緩沖液 (0.2mol/LpH4.6)2.米倫(Millon)試劑 3.95%乙醇。4.乙醚。5.1O%NaCl%Na2C03。7.0.lmol/LNaOH。%HCl9. 飽和氫氧化鈣 (Ca(OH)2)。10. 5%醋酸鉛。四、實(shí)驗(yàn)操作 (一)酪蛋白的制備 取新鮮牛乳2Oml，放人100ml燒杯中加熱至40。加入2Oml加熱至同樣溫度的醋酸緩沖液，一邊加一邊搖動(dòng)，并用pH計(jì)檢測(cè)，調(diào)整混合

9、液的pH為4.8（實(shí)際中準(zhǔn)確加入牛奶與醋酸緩沖液體積相同時(shí)，可以不用調(diào)節(jié)pH）。冷卻至室溫，繼續(xù)放置5分鐘，然后將溶液轉(zhuǎn)入離心管中離心3000r/min，時(shí)間5分鐘 （注意離心時(shí)要對(duì)角配平），離心后清液保留做鑒定實(shí)驗(yàn)。所得沉淀物懸浮在約30ml等量的醇醚混合液中，攪勻，離心3000r/min，時(shí)間5分鐘，棄清液，所得沉淀攤在表面皿上，使醇醚混合液揮發(fā)。（二）酪蛋白的性質(zhì)鑒定 1.溶解度 取試管6支，分別加入水、10%氯化鈉、0.5%碳酸鈉、0.1mol/L氫氧化鈉、0.2%鹽酸及飽和氫氧化鈣溶液各2m1。于每管中加入少量酪蛋白。不斷搖蕩，觀察記錄各管中的酪蛋白溶解度。 2.米倫反應(yīng) 取酪蛋白少

10、許，放置于試管中。加入lml蒸餾水，再加入米倫試劑10滴，振搖，并徐徐加熱。觀察其顏色變化。3.含硫 (胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸)測(cè)定:取少量酪蛋白溶于lmlO.1 mol/L氫氧化鈉溶液中，再加入1-3滴5%醋酸鉛，加熱煮沸，溶液變?yōu)楹谏?三)乳清中可凝固性蛋白質(zhì)的鑒定 將制備酪蛋白時(shí)所得的清液移入燒杯中，徐徐加熱。即出現(xiàn)蛋白質(zhì)沉淀。此為乳清中的球蛋白和清蛋白。實(shí)驗(yàn)三、 血液葡萄糖的測(cè)定-福林（Folin）-吳憲氏法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)并掌握福林-吳憲氏法測(cè)定血液中葡萄糖的方法二、實(shí)驗(yàn)原理 葡萄糖(C6H1206)是一種多羥基的醛類化合物。其醛基具有還原性，與堿性銅試劑混合加熱，葡萄糖分子中

11、的醛基被氧化成羧基，而銅試劑中的二價(jià)銅(Cu2+)被還原成磚紅色的氧化亞銅（Cu2O）而沉淀。氧化亞銅可使磷(砷)鉬酸還原生成鉬藍(lán)，使溶液呈藍(lán)色。其生成藍(lán)色的深度與血濾液中葡萄糖濃度成正比。選用顏色深淺較接近于測(cè)定管一同在420nm比色，即可求出測(cè)定管中葡萄糖的含量。 三、試劑 1.1/24mol/L硫酸溶液 2.10%鎢酸鈉溶液 3.堿性硫酸銅試劑 4.磷鉬酸試劑 %苯甲酸溶液 6.葡萄糖貯存標(biāo)準(zhǔn)液 (lOmg/ml) 7.葡萄糖應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液(0.lmg/ml) 8. 1：4磷鉬酸稀釋液 四、實(shí)驗(yàn)步驟： 1. 用鎢酸法制備1：10全血無(wú)蛋白濾液(相當(dāng)于將原血稀釋了10倍)。24支血糖管按表操作

12、血糖管試劑空白管低濃度標(biāo)準(zhǔn)管高濃度標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管無(wú)蛋白血濾液（ml）蒸餾水（ml）標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖應(yīng)用液（ml）堿性銅試劑（ml）2.02.01.01.02.02.02.0 1.0 1.0 2.0混勻，置沸水浴中煮8分鐘，取出，用流動(dòng)的自來(lái)水冷卻3分鐘（切勿搖動(dòng)血糖管）磷鉬酸試劑（ml） 2.0 2.0 2.0 2.01：4磷鉬酸溶液加至25252525用1：4磷鉬酸溶液加至25刻度處后，用橡皮塞塞緊管口顛倒搖勻，用空白管調(diào)零，在420nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色，讀取各管的密度值（光吸收值）。3. 計(jì)算高標(biāo)準(zhǔn)管：測(cè)定觀光密度 100 0.2 =葡萄糖mg/100ml標(biāo)準(zhǔn)觀光密度 0.1低標(biāo)準(zhǔn)管：測(cè)定觀光密度

13、100 0.1 =葡萄糖mg/100ml標(biāo)準(zhǔn)觀光密度 0.1實(shí)驗(yàn)四 雙縮脲測(cè)定蛋白質(zhì)的含量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握雙縮脲測(cè)定蛋白質(zhì)的方法和原理二、實(shí)驗(yàn)原理 雙縮脲在堿性溶液中與Cu2+產(chǎn)生紫色的絡(luò)合物,這一反應(yīng)稱“雙縮脲反應(yīng)”。蛋白質(zhì)分子中肽鍵，也能與Cu2+ 發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，溶液紫色的深淺與蛋白質(zhì)含量在一定范圍內(nèi)成正比，而與蛋白質(zhì)的氨基酸組成及分子量無(wú)關(guān)。該紫色的絡(luò)合物在580nm處有最大吸收值，通過(guò)測(cè)定580nm處的吸光值用于谷物蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。 三、器材分光光度計(jì) 分析天平 移液管 具塞三角瓶 漏斗 三角瓶四、試劑10%KOH溶液 、無(wú)水乙醇、碳酸銅、酪蛋白、豆粉五、實(shí)驗(yàn)步驟：(一)標(biāo)準(zhǔn)曲線

14、的繪制按下表加入各試劑，振蕩10min，靜置片刻，將上清過(guò)濾后580nm測(cè)定吸光值。以吸光值為橫坐標(biāo),酪蛋白含量為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 編號(hào)12345678910酪蛋白（g）00.050.060.070.080.090.100.110.120.13碳酸銅（g）1.1.001.001.001.001.001.001.001.001.00無(wú)水乙醇（ml）2020.0020.0020.0020.0020.0020.0020.0020.0020.0010%KOH（ml）2020.0020.0020.0020.0020.0020.0020.0020.0020.00OD580(二)樣品的測(cè)定編號(hào)123豆

15、粉（g）00.10000.1000碳酸銅（g）1.001.001.00無(wú)水乙醇（ml）2020.0020.0010%KOH（ml）2020.0020.00振蕩10min，靜置片刻，將上清過(guò)濾后580nm測(cè)定吸光值OD580 在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的含量.六、結(jié)果計(jì)算 標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得蛋白質(zhì)含量（g） 樣品蛋白質(zhì)含量（%）= 100 豆粉（g） 實(shí)驗(yàn)五 血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)醋酸纖維薄膜電泳的操作技術(shù)，了解電泳技術(shù)的基本原理，測(cè)定人血清中各種蛋白質(zhì)的相對(duì)含量。二、實(shí)驗(yàn)原理醋酸纖維薄膜電泳(CAME)是以醋酸纖維薄膜(CAM)作支持物的一種區(qū)帶電泳技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)以醋酸纖維素薄

16、膜為電泳支持物，分離人血清蛋白。血清蛋白中含有清蛋白、 球蛋白、球蛋白、球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組分、立體構(gòu)象、分子量、等電點(diǎn)及行狀不同（見(jiàn)下表），在電場(chǎng)中的遷移速度不同。分子量小、等電點(diǎn)低的，在相同堿性PH緩沖體系中，帶負(fù)電荷多的蛋白質(zhì)顆粒在電場(chǎng)中遷移速度快。例如人血清蛋白在PH8.6的緩沖體系中電泳，染色后可顯示5條區(qū)帶。清蛋白泳動(dòng)最快，其余依次是球蛋白（如圖）。三、材料、儀器與試劑（一）、材料：人血清（二）、儀器醋酸纖維薄膜(82mm)；點(diǎn)樣器；染色皿，漂洗器，鑷子；玻璃板；常壓電泳儀；直流電源整流器；水平電泳槽；粗濾紙；直尺和鉛筆（三）、藥品巴比妥緩沖液(pH8.6)

17、；氨基黑10B染色液；漂洗液，洗脫液 四、實(shí)驗(yàn)步驟：1.浸泡:用鑷子取醋酸纖維薄膜放在緩沖液中浸泡20分鐘。 2、點(diǎn)樣:把膜條從緩沖液中取出，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的液體，然后鋪在玻璃板上(無(wú)光澤面朝上)，將點(diǎn)樣器在血清中沾一下（量薄薄一層為好），再在膜條一端2-3厘米處輕輕水平地落下并隨時(shí)提起，這樣即在膜條上點(diǎn)上了細(xì)條狀的血清樣品。3、電泳：在電泳槽內(nèi)加入緩沖液，使兩個(gè)電極槽內(nèi)的液面等高，將膜條平懸于電泳槽支架的濾紙橋上。膜條點(diǎn)樣的一端放在負(fù)極上。通電，電流強(qiáng)度每條膜22.5mA(注意強(qiáng)度),電泳時(shí)間約為90分鐘。4、染色:電泳完畢后將膜條取下并放在染色液中浸泡5分鐘。5、漂洗:將膜條從染

18、色液中取出后移置到漂洗液中漂洗數(shù)次至無(wú)蛋白區(qū)底色脫凈為止，可得到色帶清晰的電泳圖譜。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)六 植物組織中還原糖和總糖的含量測(cè)定 （3，5二硝基水楊酸法）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握還原糖總糖測(cè)定的基本原理，學(xué)習(xí)比色定糖的基本操作。二、實(shí)驗(yàn)原理 各種單糖和麥芽糖都是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。還原糖可用水溶液提取?？偺前ㄟ€原糖和非還原糖，其中淀粉不溶于水，可用酸水解后為還原糖，蔗糖也可水解為還原性單糖。在堿性條件下，還原糖與3，5二硝基水楊酸法共熱，后者被還原為3氨基5硝基水楊酸（棕紅色物質(zhì)）。還原糖則被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物。在一點(diǎn)范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色深淺程度成一點(diǎn)比例，在500nm

19、下測(cè)定棕紅色物質(zhì)的消光值。查對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算。便可分別求出樣品中還原糖和總糖的含量。多糖水解時(shí)，在單糖殘基上接了一分子水，因此在計(jì)算時(shí)須扣除已加入的水量，測(cè)定所得的總糖量乘以0.9即可為實(shí)際的總糖。三、材料、儀器與試劑：1血糖管和刻度試管2容量瓶（50毫升）3燒杯4漏斗 5移液管（10毫升）6量筒7離心管和離心機(jī)8恒溫水浴9沸水浴10天平11分光光度計(jì)12試劑：3，5二硝基水楊酸、碘碘化鉀溶液、酚酞指示劑、6 N鹽酸、6N氫氧化鈉四、實(shí)驗(yàn)步驟：還原糖的測(cè)定1.5g面粉+少量H2O混勻+ 50mlH2O50，20min，4000rpm,10min 取上清，20ml洗渣，合并上清，定容到100ml

20、，混勻，過(guò)濾，待測(cè)?？偺堑臏y(cè)定0.5g面粉+6NHCl+15mlH2O煮20min，取2d加碘碘化鉀溶液檢測(cè)是否完全水解（水解不顯藍(lán)）加1d酚酞，用6NaOH調(diào)至微紅，定容到100ml，混勻，過(guò)濾，取10ml定容到100ml，待測(cè)。取5支試管：還原糖還原糖總糖總糖空白(水)測(cè)定液（ml）221103，5二硝基水楊酸（ml）1.51.51.51.51. 5H2O00112煮5min，去除立即放入冷水這，冷卻后定容到20ml，混勻，測(cè)定OD540nm,對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線查還原糖的量。OD540nm標(biāo)準(zhǔn)曲線得到還原糖的量提取體積還原糖測(cè)定體積100樣品毫克數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到還原糖的量提取體積總糖測(cè)定體積稀釋倍數(shù)

21、0.9100樣品毫克數(shù)實(shí)驗(yàn)七 應(yīng)用紙層析法鑒定酶促轉(zhuǎn)氨基作用一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)紙層析的原理和操作方法，進(jìn)行混合氨基酸的分離分析。二、實(shí)驗(yàn)原理氨基酸分子上的氨基轉(zhuǎn)移到-酮酸分子上的反應(yīng)稱為轉(zhuǎn)氨基作用. 轉(zhuǎn)氨基作用是氨基酸的重要反應(yīng)之一,由轉(zhuǎn)氨酶催化經(jīng)轉(zhuǎn)氨基后,原來(lái)的氨基酸變成了酮酸,原來(lái)的酮酸變成相應(yīng)的氨基酸。例如谷丙轉(zhuǎn)氨酶可催化下列反應(yīng):COOHH2NCH CH2 CH2CH3COOHC=OCH2 CH2CH3COOHH2N CHCH3 COOHC=OCH3 + GPT +丙氨酸 -酮戊二酸 丙酮酸 谷氨酸新生成的谷氨酸可以與標(biāo)準(zhǔn)谷氨酸同時(shí)在濾紙上進(jìn)行層析而被檢出。紙層析是以濾紙作支持物，用一定

22、的溶劑系統(tǒng)展開(kāi)，使混合樣品達(dá)到分離分析的層析方法。其一般操作是將樣品溶解在適當(dāng)溶劑中，點(diǎn)樣在濾紙的一端；再選用適當(dāng)?shù)娜軇┫到y(tǒng)，從點(diǎn)樣的一端通過(guò)毛細(xì)現(xiàn)象向另一端展開(kāi)，展開(kāi)完畢，取出濾紙晾干或烘干，再以適當(dāng)?shù)娘@色劑或紫外燈、熒光燈下觀察其圖譜。樣品經(jīng)展開(kāi)后其一物質(zhì)在紙層析譜上的位置常用比移值Rf來(lái)表示。 Rf =紙層析可看作是溶質(zhì)（樣品）在固定相與流動(dòng)相之間的連續(xù)抽提，由于溶質(zhì)在兩相之間的分配系數(shù)不同而達(dá)到分離。一定的物質(zhì)在兩相間有固定的分配系數(shù)，因而在恒定條件（液劑、PH、溫度）下，各物質(zhì)有固定的Rf值，據(jù)此可達(dá)到分析鑒定的目的。三、試劑1、0. 01M pH7.4 磷酸緩沖液： 2、0.1M

23、L-丙氨酸3、0.1M L-谷氨酸 4、0.1M L-酮戊二酸5、層析溶劑 ：用水飽和的苯酚6、0.1%（W/V）茚三酮四、實(shí)驗(yàn)步驟1.肉糜制備：稱取新鮮豬肝5克在低溫下剪碎，用研缽研磨成糊狀備用。2酶促反應(yīng) 按表次序在2支試管中加入試劑。管號(hào)試劑對(duì)照管測(cè)定管0.1mol/L丙氨酸(ml)0.1mol/L-酮戊二酸(ml)0.01mol/LpH7.4磷酸緩沖液(ml)肉糜（g）1.01.01.01.01.01.01.01.0 對(duì)照管當(dāng)肉糜加入后立即煮沸l(wèi)Omin，而后放人37水浴中與測(cè)定管同時(shí)保溫，測(cè)定管加入肌肉糜后放人37水浴中保溫lh，然后于沸水浴中加熱10min終止反應(yīng)。冷卻后將二管分別

24、靜置以備層析用。 3.層析 取直徑10-llcm圓形層析濾紙（已打孔）一張，通過(guò)圓心作一直徑為2cm的圓，在圓周上分別取4等距點(diǎn)分別作測(cè)定管和對(duì)照管溶液及標(biāo)準(zhǔn)丙氨酸、谷氨酸的點(diǎn)樣位置，點(diǎn)樣時(shí)，將蘸水筆（使用前應(yīng)放在酒精燈上燒紅，冷卻，對(duì)應(yīng)溶液只能用對(duì)應(yīng)的筆點(diǎn)樣）輕輕靠到濾紙上(不能損傷濾紙)，使斑點(diǎn)直徑為2-3 mm (不能超過(guò)5mm)。為了有足夠量的樣品點(diǎn)在濾紙上，每種樣品應(yīng)重復(fù)點(diǎn)6-7次，每次點(diǎn)樣后待自然風(fēng)干，再點(diǎn)下一次。另取一濾紙小條將其下端剪成刷狀，卷成燈芯插人中心小孔處，使燈芯不突出紙面(少許突出紙面亦可)。然后將該層析圓濾紙平放在盛有水飽和酚的康維皿上，紙芯下端須狀部分浸人溶液中，

25、再在層析濾紙上罩一個(gè)大小合適的表面皿，溶劑沿紙芯上升到濾紙，再向四周擴(kuò)散，待溶劑前沿到達(dá)距康維皿邊緣0.5-lcm處時(shí) (約lh左右)，取出層析濾紙，去掉紙芯，記下溶劑前沿，在電爐子上烘干以除去酚溶劑。 將已烘干的濾紙平放于表面皿上，用噴霧器向?yàn)V紙均勻噴灑0.1%茚三酮溶液，放在電爐子上烘干即可看到好幾個(gè)紫紅色斑點(diǎn)，比較各色斑點(diǎn)的位置及色 澤深淺，并計(jì)算Rf值，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果與討論:測(cè)定管:出現(xiàn)了幾個(gè)點(diǎn): Rf1？; Rf2？說(shuō)明是否發(fā)生了轉(zhuǎn)氨基作用對(duì)照管中只出現(xiàn)了幾個(gè)點(diǎn),為什么？標(biāo)樣：丙氨酸: Rf2？谷氨酸Rf2？實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,要發(fā)生轉(zhuǎn)氨基作用,必須具備幾個(gè)條件實(shí)驗(yàn)八 植物組織中維生素

26、C的定量測(cè)定（2，6-二氯酚靛酚滴定法）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康木S生素C是人體必需的營(yíng)養(yǎng)元素，它廣泛存在于各種蔬菜和水果中，但在不同的材料中Vc的含量是不同的，因此Vc含量的測(cè)定對(duì)于營(yíng)養(yǎng)膳食是非常重要的。二、實(shí)驗(yàn)原理 還原型抗壞血酸能還原染料2,6-二氯酚靛酚鈉鹽，本身則氧化成脫氫抗壞血酸，在酸性溶液中，2,6-二氯酚靛酚呈紅色，被還原后變?yōu)闊o(wú)色。因此，可用2,6-二氯酚靛酚滴定樣品中還原抗壞血酸。當(dāng)抗壞血酸全部被氧化后，稍候多加一些染料，使滴定液呈淡紅色，即為終點(diǎn)。如無(wú)其它雜質(zhì)干擾，樣品提取液所還原的標(biāo)準(zhǔn)染料與樣品中所含的還原型抗壞血酸成正比。三、材料、儀器與試劑：1微量滴定管 （5.0毫升）2容量瓶（

27、50毫升）3三角瓶（100毫升）4研缽5移液管（10毫升）6量筒72%草酸溶液 8標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液90.1%2,6-二氯酚靛酚溶液10新鮮蔬菜或松針 四、實(shí)驗(yàn)步驟：1.提取:稱取2.0克新鮮樣品，置研缽中加少量 2%草酸研成勻漿。通過(guò)漏斗將勻漿轉(zhuǎn)移到50毫升 的容量瓶中，用2%草酸洗滌研缽及漏斗（注意體積），洗滌液一并轉(zhuǎn)入容量瓶中，最后用2%草酸定容至刻度。（也可選擇離心）2.滴定：（1）標(biāo)準(zhǔn)液滴定：準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液10毫升（含1.0毫克抗壞血酸）置100毫升錐形瓶中，用滴定管以0.1%2，6二氯酚靛酚滴至淡紅色出現(xiàn)，保持15秒鐘不退色即為滴定終點(diǎn);由所用染料的體積計(jì)算出1毫升染料相當(dāng)

28、于多少毫克抗壞血酸。(2)樣液滴定:準(zhǔn)確吸取濾液兩份，每份10毫升分別放人100毫升錐形瓶?jī)?nèi)，滴定方法同前。（3） 空白滴定：準(zhǔn)確吸取10毫升2%草酸溶液，放入100毫升錐形瓶中，用上述方法滴定至終點(diǎn)，記錄所用染料體積。注意：滴定過(guò)程宜迅速，一般不超過(guò)2分鐘。3計(jì)算1000克樣品所含維生素C的毫克數(shù)。 （V1V2）KV X = 100 WV3式中：X ：100克樣品所含維生素C毫克數(shù)W ：稱取樣品重量毫克數(shù)V1：滴定樣品所用染料毫升數(shù)V2：滴定空白所用染料毫升數(shù)V3：樣品測(cè)定時(shí)所用濾液毫升數(shù)（即10毫升）V ：樣品提取液稀釋至總體積（即50毫升）K ：1毫升染料所能氧化維生素C之毫克數(shù)，可由標(biāo)

29、定算出。實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄各個(gè)樣的滴定體積并正確計(jì)算，單位一定要對(duì)實(shí)驗(yàn)九 琥珀酸脫氫酶的作用及其競(jìng)爭(zhēng)性抑制的觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私忡晁崦摎涿傅淖饔眉捌涓?jìng)爭(zhēng)性抑制劑對(duì)其活性的抑制。二、實(shí)驗(yàn)原理脫氫酶的作用在于激活并脫下底物上的氫，使之通過(guò)一系列傳遞最后傳給氧而生成水。在缺氧條件下適當(dāng)?shù)氖軞潴w可以接受脫氫酶脫下的氫。因此，選用適當(dāng)?shù)氖軞潴w便可以觀察到脫氫酶的作用。琥珀酸脫氫酶使琥珀酸脫氫生成延胡索酸，并將脫下的氫交給受氫體。當(dāng)缺氧條件下可用甲烯藍(lán)（美藍(lán)，藍(lán)色物質(zhì)）作為受氫體，甲烯藍(lán)還原生成甲烯白（美白，白色物質(zhì)）。根據(jù)這種藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)色的變化過(guò)程，就可以判斷出琥珀酸脫氫美起了催化作用。丙二酸的結(jié)構(gòu)與琥珀

30、酸相似，可與琥珀酸競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心，從而抑制酶的活性，是琥珀酸脫氫酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。由于甲烯白容易被空氣所氧化，所以實(shí)驗(yàn)需要在無(wú)氧條件下進(jìn)行。例如，用液體石蠟封閉反應(yīng)液，可以制造無(wú)氧環(huán)境，從而不用抽真空設(shè)備即可觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。三、實(shí)驗(yàn)試劑和器材 1.5%琥珀酸鈉溶液、1.0 %丙二酸鈉溶液、0.02%甲烯藍(lán)溶液、液體石蠟、手術(shù)剪、研缽、恒溫水浴鍋、石英砂四、實(shí)驗(yàn)步驟豬心1.52g + 1/15M磷酸氫二鈉溶液34ml 勻漿1/15M磷酸氫二鈉溶液67ml,放置30min2000r/min 離心10min,取上清備用.然后按下表進(jìn)行操作:試管號(hào)酶液(滴)琥珀酸鈉溶液丙二酸鈉溶液蒸餾水甲烯藍(lán)溶液現(xiàn)象155-25225(煮沸)5-25231055152410205-2 加好試劑混勻后,立即在各管中加入一層(約510滴)液體石蠟油。將各管置于3