登革熱實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指南

1、附件2登革熱實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指南一、目的（一）及時(shí)發(fā)現(xiàn)、診斷病例。（二）及時(shí)了解伊蚊媒介攜帶登革病毒狀況。（三）病毒分型和溯源。（四）為登革熱流行趨勢(shì)的預(yù)測(cè)、預(yù)警和制定防治對(duì)策、措施提供科學(xué)依據(jù)。二、檢測(cè)對(duì)象（一）疑似和臨床診斷病例（按照登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)WS216-2008）。（二）伊蚊成蚊和幼蟲。三、樣本采集、保存和運(yùn)輸（一）臨床標(biāo)本采集用無(wú)菌真空干燥管，采集患者非抗凝血，及時(shí)分離血清，分裝2份，保存于帶螺旋蓋、內(nèi)有墊圈的凍存管內(nèi)，標(biāo)記清楚后低溫保存，其中1份用于現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，1份用于上級(jí)預(yù)防控制機(jī)構(gòu)復(fù)核（附件1，附表1）。1.登革熱臨床診斷病例及疑似病例，每次采集血液標(biāo)本5mL。 2.登革熱臨床

2、診斷和疑似的住院病例（包括初篩陰性），應(yīng)采集雙份血液標(biāo)本，入院當(dāng)天和出院前1天各一份。3.疫點(diǎn)首發(fā)病例，必要時(shí)應(yīng)采集第二份血標(biāo)本，距第一份血樣采集日期間隔在7天以上。（二）蚊媒標(biāo)本采集疫點(diǎn)內(nèi)采集的伊蚊成蚊及幼蟲，分類鑒定后，填寫媒介標(biāo)本采集信息表，按照采集地點(diǎn)分裝，每管10-20只。（三）標(biāo)本保存、運(yùn)送標(biāo)本應(yīng)-70以下保存，血液標(biāo)本可-20以下保存，但不超過(guò)1周。標(biāo)本運(yùn)送時(shí)采用低溫冷藏運(yùn)輸，避免凍融，樣本運(yùn)輸應(yīng)遵守國(guó)家相關(guān)生物安全規(guī)定。四、檢測(cè)內(nèi)容（一）實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)登革熱疑似病例發(fā)生所在地醫(yī)院和/或縣（市）疾控機(jī)構(gòu)采集病例血清，檢測(cè)登革病毒抗原、核酸或抗體，檢測(cè)流程參見圖1。（二）復(fù)核檢測(cè)1.送

3、市或省級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)的臨床標(biāo)本，抽樣30%進(jìn)行復(fù)核檢測(cè)，疫點(diǎn)首發(fā)病例需采用病原學(xué)和/或雙份標(biāo)本血清學(xué)方法復(fù)核檢測(cè)，暴發(fā)疫情復(fù)核檢測(cè)不少于5例，疫情少于5例者應(yīng)全部檢測(cè)，病毒核酸陽(yáng)性標(biāo)本應(yīng)分型檢測(cè)。2.疫點(diǎn)首發(fā)病例，重癥病例、輸入病例急性期標(biāo)本應(yīng)采用PCR方法進(jìn)行分型檢測(cè)，陽(yáng)性者分離病毒，從臨床標(biāo)本或所分離病毒中擴(kuò)增E蛋白編碼基因，完成序列分析。3.每次暴發(fā)疫情應(yīng)開展病毒全基因組序列分析。4.實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)陰性臨床病例以及重癥病例，應(yīng)對(duì)恢復(fù)期血清進(jìn)行IgM、IgG抗體和/或中和抗體檢測(cè)。（三）媒介標(biāo)本檢測(cè)1.核酸檢測(cè)捕獲的伊蚊成蚊或幼蟲，進(jìn)行核酸分型檢測(cè)，并擴(kuò)增病毒E蛋白編碼基因，完成序列分析。

4、2.病毒分離病毒核酸陽(yáng)性的標(biāo)本由國(guó)家、省或有條件的市級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)進(jìn)行病毒分離、基因組序列分析。圖1登革熱疑似病例實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)流程五、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法（一）臨床標(biāo)本檢測(cè)1、病原學(xué)檢測(cè)病原學(xué)檢測(cè)主要適用于急性期血液標(biāo)本。（1）抗原檢測(cè)：一般發(fā)病后6天內(nèi)血液標(biāo)本NS1抗原檢出率高。標(biāo)本中檢出NS1抗原可以確診病毒感染，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，可用于早期診斷（附件2，3）。（2）核酸檢測(cè)：一般發(fā)病后6天內(nèi)血液標(biāo)本病毒核酸檢出率高。在病人血清中檢出病毒核酸，可確診而且能夠分型，可用于早期診斷，但核酸檢測(cè)容易因污染而產(chǎn)生假陽(yáng)性，因此要求嚴(yán)格分區(qū)操作（附件4）。（3）病毒分離：一般發(fā)病后5天內(nèi)血液標(biāo)本病毒分離

5、率較高。將標(biāo)本接種于蚊源細(xì)胞（C6/36）或哺乳動(dòng)物細(xì)胞（BHK21、Vero）進(jìn)行分離培養(yǎng)（附件5），出現(xiàn)病變以后，用檢測(cè)抗原或核酸的方法鑒定病毒。分離到登革病毒可以確診，但其耗時(shí)長(zhǎng)，不適于快速診斷。2.血清學(xué)檢測(cè)血清學(xué)特異性抗體檢測(cè)主要適用于發(fā)病5天以后血液樣本，但需注意可能與其他黃病毒感染發(fā)生交叉反應(yīng)。（1）血清特異性IgM抗體：采用ELISA、免疫層析等方法檢測(cè)。IgM抗體陽(yáng)性，提示患者可能新近感染登革病毒，適用于登革熱早期診斷，但單份標(biāo)本不能確診（附件6）。（2）血清特異性IgG抗體：采用ELISA、免疫熒光（IFA）、免疫層析等方法檢測(cè)?；颊呋謴?fù)期血清 IgG 抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)或滴度較急性

6、期呈4倍及以上升高可以確診（附件7，8）。（3）中和抗體：采用空斑減少中和實(shí)驗(yàn)、微量中和實(shí)驗(yàn)等方法檢測(cè)，可用于分型?；颊呋謴?fù)期血清中和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)或滴度較急性期呈4倍及以上升高可以確診。（二）媒介標(biāo)本檢測(cè)1.標(biāo)本處理將分類后的伊蚊成蚊或幼蟲，按照采集地點(diǎn)，每1020只為一份進(jìn)行研磨處理（附件9）。2.病毒核酸檢測(cè)用RT-PCR的方法進(jìn)行登革病毒核酸檢測(cè)（見附件4）。3.病毒分離病毒核酸陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行病毒分離（見附件5）。六、實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制（一）標(biāo)本采集、保存和運(yùn)送采集的標(biāo)本要做好標(biāo)識(shí)，并記錄標(biāo)本的基本信息和流行病學(xué)信息，按本指南要求采集、保存和運(yùn)送。（二）實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)1.根據(jù)發(fā)病時(shí)間，按本指南要求選

7、擇不同的檢測(cè)方法。2.核酸檢測(cè)要防止各種污染，按操作規(guī)范設(shè)立相應(yīng)對(duì)照。3.應(yīng)對(duì)檢測(cè)試劑開展質(zhì)控評(píng)價(jià)。（三）各級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)應(yīng)定期開展督導(dǎo)檢查、實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員培訓(xùn)與考核，及時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題。七、結(jié)果的報(bào)告和反饋疫點(diǎn)首發(fā)病例、重癥病例和輸入病例實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果24小時(shí)內(nèi)反饋標(biāo)本送檢單位。省級(jí)疾病防控機(jī)構(gòu)應(yīng)每年1月將上一年登革熱實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)（包括核酸檢測(cè)、病毒分離、序列測(cè)定）監(jiān)測(cè)結(jié)果，報(bào)國(guó)家疾病預(yù)防控制中心（見附表2），將結(jié)果發(fā)送至denguetest。八、生物安全登革熱實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)應(yīng)按照病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例等相關(guān)規(guī)定要求，做好生物安全工作。附件：1.血液標(biāo)本采集.血清分離.運(yùn)送.保存標(biāo)準(zhǔn)化操

8、作程序2.酶聯(lián)免疫法檢測(cè)登革病毒NS1抗原標(biāo)準(zhǔn)操作程序3.免疫層析法檢測(cè)登革病毒NS1抗原標(biāo)準(zhǔn)操作程序4.RT-PCR法分型檢測(cè)登革病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)操作程序5.細(xì)胞培養(yǎng)分離登革病毒6.IgM捕捉ELISA法（MacELISA）檢測(cè)登革熱IgM抗體7.酶聯(lián)免疫法檢測(cè)登革病毒IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)操作程序8.免疫熒光法檢測(cè)登革病毒IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)操作程序9.蚊媒標(biāo)本處理標(biāo)準(zhǔn)操作程序附表：1.疑似登革熱病人檢材送檢一覽表2.病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果一覽表附件1血液標(biāo)本采集、血清分離、運(yùn)送、保存標(biāo)準(zhǔn)化操作程序1 目的正確采集血液標(biāo)本、分離血清、運(yùn)送和保存。2 范圍適用于有資質(zhì)的人采集登革熱患者或疑似患者血液標(biāo)本、分離血清、編

9、號(hào)、分裝、保存和運(yùn)送。3 操作步驟3.1 采血3.1.1 用70%酒精擦拭靜脈穿刺部位待30秒鐘以上。3.1.2 然后用一根碘酊或碘伏棉簽消毒皮膚（1-2%碘酊30秒或10%碘伏消毒60秒），從穿刺點(diǎn)向外以1.5-2cm直徑畫圈進(jìn)行消毒。3.1.3 用70%酒精脫碘。3.1.4 嚴(yán)格執(zhí)行三步消毒后 (注意對(duì)碘過(guò)敏的患者，只能用70%酒精消毒，消毒60秒鐘)，待穿刺部位酒精揮發(fā)干燥用無(wú)菌真空管，采集患者非抗凝血5mL。3.2分離血清3.2.1輕緩顛倒采血管數(shù)次，使血液與促凝劑混勻后靜置，待血塊完全凝固（放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)造成溶血，避免留置過(guò)夜）。3.2.23000rpm離心，5分鐘，然后用無(wú)菌吸管小

10、心取上清轉(zhuǎn)入3支凍存管，應(yīng)避免吸取血細(xì)胞。3.2.3 標(biāo)記。用標(biāo)簽紙或持久性標(biāo)記筆在凍存管的側(cè)壁標(biāo)記標(biāo)本編號(hào)，頂端標(biāo)記序列號(hào)，標(biāo)記清楚后將血清放進(jìn)標(biāo)本盒，保存于2-8冰箱待初篩檢測(cè)或運(yùn)送保存。在編碼規(guī)則為“地區(qū)拼音首字母（JH）年份（2位）月（2位）-序列號(hào)（3位）”，如景洪市2013年8月份采集的第12份血標(biāo)本的血清編號(hào)為JH1308-012，凍存管頂端分別標(biāo)記012-1，012-2和012-3。3.3 運(yùn)送保存。3.3.1 如果24小時(shí)能夠完成初篩檢測(cè)，并將標(biāo)本運(yùn)送至上級(jí)單位，運(yùn)送前應(yīng)將標(biāo)本保存于2-8冰箱，運(yùn)送時(shí)采用低溫冷藏運(yùn)輸。3.3.2 如果不能及時(shí)運(yùn)送，運(yùn)送前應(yīng)將標(biāo)本保存于-20冰

11、箱，運(yùn)送時(shí)采用干冰或低溫冷藏運(yùn)輸。3.3.3 樣本長(zhǎng)期保存應(yīng)記錄剩余血清量和盒中位置，保存于-70以下冰箱。3.3.4 所有樣本運(yùn)輸和保存應(yīng)遵守國(guó)家相關(guān)生物安全規(guī)定。4 注意事項(xiàng)4.1 使用后的注射器和針頭應(yīng)放置于耐扎的容器中，最后集中高壓消毒，在任何情況下均不應(yīng)試圖將針頭重新蓋帽。4.2 采血結(jié)束后脫掉手套并棄于耐高壓的廢棄袋中，以備集中高壓滅菌，并立即用肥皂和水洗手。4.3 若發(fā)生針刺、皮膚破損或其它損傷，應(yīng)立即用肥皂和水清洗傷口，不要立即止血。4.4 當(dāng)血液污染了身體的任何地方或發(fā)生針刺等事故時(shí)，均應(yīng)及時(shí)報(bào)告上級(jí)并按醫(yī)療救護(hù)規(guī)程進(jìn)行評(píng)估和救護(hù)。附件2酶聯(lián)免疫法檢測(cè)登革病毒NS1抗原標(biāo)準(zhǔn)操

12、作程序1 目的酶聯(lián)免疫法檢測(cè)患者血清中登革病毒NS1抗原。2 適用范圍適用于患者血清或血漿中登革熱病毒NS1抗原的快速檢測(cè)。3 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備3.1 核對(duì)被檢樣品（血清或血漿）患者的姓名、編號(hào)及檢測(cè)項(xiàng)目等。3.2檢測(cè)前應(yīng)將待測(cè)樣品置于2-8冰箱或冰上。4 檢測(cè)項(xiàng)目及參數(shù)本方法檢測(cè)項(xiàng)目為檢測(cè)血清或血漿中登革熱病毒抗原。5 檢測(cè)儀器設(shè)備和材料加樣器、溫箱、洗板機(jī)、含波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀、登革病毒抗原檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）（萬(wàn)泰公司）6 檢測(cè)的環(huán)境條件生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-2）中進(jìn)行,滅活后樣本在生物安全一級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-1）內(nèi)進(jìn)行。7操作步驟7.1 將試劑盒在冰箱中取出，放置室溫平衡30分

13、鐘，使用前將試劑輕輕震蕩混勻。7.2 配液：將試劑盒中濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋。7.3 編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)微孔板編號(hào)，每板設(shè)陰性對(duì)照3孔，陽(yáng)性對(duì)照2孔和空白對(duì)照1孔。7.4 加稀釋液：每孔加稀釋液50µL，空白孔除外。7.5 加樣：分別在相應(yīng)孔加入待測(cè)樣品或陰陽(yáng)性對(duì)照各50µL，空白孔除外。7.6 溫育：用封板膜封板后，置37溫育60分鐘。7.7 每孔加酶標(biāo)試劑50µL，空白孔除外，輕輕震蕩混勻。7.8 溫育：用封板膜封板后，置37溫育30分鐘。7.9 洗板：小心揭掉封板膜，用洗板機(jī)洗滌5遍，最后一次盡量扣干。7.10顯色：每孔加入顯色劑A、B液各50µ

14、;L，輕輕震蕩混勻，37避光顯色15分鐘。7.11測(cè)定：每孔加終止液50µL，10分鐘內(nèi)測(cè)定結(jié)果。設(shè)定酶標(biāo)儀波長(zhǎng)于450nm處（建議使用雙波長(zhǎng)450nm/600-650nm檢測(cè)），用空白孔調(diào)零后測(cè)定各孔A值。8 結(jié)果判定8.1 臨界值計(jì)算：臨界值=0.10+陰性對(duì)照孔A值均值（陰性對(duì)照孔A值低于0.05者以0.05計(jì)算）。8.2 陰性對(duì)照的正常值范圍：陰性對(duì)照孔A0.1（若1孔A大于0.1應(yīng)舍棄，若兩孔或兩孔以上陰性對(duì)照大于0.1，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)）。8.3 陽(yáng)性對(duì)照正常值范圍：A0.8.8.4陽(yáng)性判定：樣品A值臨界值者為登革病毒抗原陽(yáng)性。8.5陰性判定：樣品A值臨界值者為登革病毒抗原陰性

15、。9 意義結(jié)合臨床信息，陽(yáng)性結(jié)果可以診斷為登革病毒感染，但陰性結(jié)果并不排除登革病毒感染的可能。附件3膠體金免疫層析法檢測(cè)登革病毒NS1抗原標(biāo)準(zhǔn)操作程序1 目的檢測(cè)患者血液中登革病毒抗原。2 適用范圍檢測(cè)患者血清、血漿、全血中登革熱病毒抗原水平，主要用于登革病毒感染的輔助診斷。3 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備3.1 核對(duì)被檢樣品（血清或血漿）患者的姓名、編號(hào)及檢測(cè)項(xiàng)目等。3.2檢測(cè)前應(yīng)將待測(cè)樣品置于2-8冰箱或冰上。4 檢測(cè)項(xiàng)目及參數(shù)本方法檢測(cè)項(xiàng)目為檢測(cè)血清或血漿中登革熱病毒抗原。5 檢測(cè)儀器設(shè)備和材料加樣器、登革熱病毒抗原檢測(cè)試劑盒（膠體金法）6 檢測(cè)的環(huán)境條件生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-2）中進(jìn)行,滅活后樣本

16、在生物安全一級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-1）內(nèi)進(jìn)行。7 檢測(cè)步驟7.1 將試劑盒和待檢樣本自冰箱中取出平衡至室溫。7.2 當(dāng)準(zhǔn)備好測(cè)試時(shí)，打開密封的鋁箔袋，取出檢測(cè)卡，平放于水平桌面上。7.3 在檢測(cè)卡上標(biāo)記病人的樣本號(hào)。7.4 加樣：用滴管從樣本中取1滴（約30-45µL）血清或血漿標(biāo)本，加于檢測(cè)卡/條上的加樣區(qū)內(nèi)，另外加1滴（約30-45µL）稀釋液，保證操作過(guò)程中沒有氣泡產(chǎn)生。（如果加樣后30秒鐘，沒有看到樣本移動(dòng)，可能是由于樣本太黏稠，可在樣本加樣孔內(nèi)再加1滴樣本稀釋液。7.5 加入樣本后20-25分鐘內(nèi)判讀結(jié)果，并將結(jié)果拍照。8 結(jié)果解釋8.1 陰性結(jié)果：僅質(zhì)控線C出現(xiàn)肉眼

17、可見條帶。8.2 陽(yáng)性結(jié)果：質(zhì)控線C和檢測(cè)線T均出現(xiàn)肉眼可見條帶。8.3 無(wú)效結(jié)果：未肉眼可見的質(zhì)控線C8.4 質(zhì)量控制：如遇下列情況，請(qǐng)按上述操作步驟使用實(shí)驗(yàn)室備用的陽(yáng)性和陰性樣本對(duì)該批產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制：8.4.1 新檢驗(yàn)員使用本產(chǎn)品。8.4.2 使用新批號(hào)產(chǎn)品。8.4.3 試劑卡儲(chǔ)存溫度在2-30以外。8.4.4 測(cè)試區(qū)溫度在2-30以外。9 意義陽(yáng)性結(jié)果說(shuō)明檢測(cè)到登革病毒抗原，結(jié)合臨床可以診斷為登革病毒感染；陰性結(jié)果說(shuō)明沒有檢測(cè)到登革病毒抗原，但不能排除登革病毒感染。附件4RT-PCR法分型檢測(cè)登革病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)操作程序1 目的登革熱患者和/或媒介伊蚊標(biāo)本中病毒核酸的提取及PCR分型檢測(cè)。

18、2 適用范圍適用于患者血標(biāo)本及其傳播媒介標(biāo)本的檢測(cè)。3 檢測(cè)的環(huán)境條件在標(biāo)本中提取登革病毒RNA的實(shí)驗(yàn)要求在BSL-2實(shí)驗(yàn)室操作，PCR分型檢測(cè)在專門PCR室或區(qū)域操作。4實(shí)驗(yàn)步驟4.1實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備4.1.1在標(biāo)本中提取登革病毒RNA要求在BSL-2實(shí)驗(yàn)室，PCR分型在綜合實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立區(qū)域或?qū)ｉTPCR室操作。進(jìn)入實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所之前，要事先準(zhǔn)備好所需試劑，樣品。預(yù)約實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所，并看前一位實(shí)驗(yàn)者是否已經(jīng)清場(chǎng)。4.2 RNA的提取4.2.1 使用QIAampViral RNA Mini 試劑盒提取血清標(biāo)本中病毒RNA4.2.1.1 吸取560l包含載體RNA的AVL 緩沖液至1.5ml的離心管中。4.2.1.2

19、向上述的液體中加入140l樣品，脈沖渦旋式混勻15秒，室溫孵育10分鐘，簡(jiǎn)單離心使離心管頂端液體落到底部。4.2.1.3 在樣品中加入560l 96100的乙醇，混勻15秒，再簡(jiǎn)單離心。4.2.1.4 小心將630l液體加入未浸濕的QIAamp小柱中，蓋好蓋，離心8000rpm/min 1min,棄去收集管，將柱子置于一新的2ml收集管上。4.2.1.5 打開QIAamp小柱的蓋子，重復(fù)步驟6，直至樣品全部離心。4.2.1.6 打開蓋子，向柱中加入500l AW1 緩沖液，蓋好蓋，離心8000rpm/min 1min，棄去收集管，將柱子置于一新的2ml收集管上。4.2.1.7 打開蓋子，加入5

20、00lAW2 緩沖液，蓋好蓋，離心 14，000rpm/min 3min。4.2.1.將柱子置于一新的2ml收集管上，空離1min。h.將柱子置于一新的1.5ml離心管上，加入50l AVE洗脫緩沖液，室溫孵育1min,離心8000rpm/min 1min。4.2.2 RNeasy Mini Kit提取媒介組織標(biāo)本或血液標(biāo)本病毒RNA4.2.2.1 從Kit中取出RLT液，根據(jù)標(biāo)本數(shù)量分裝適量RLT液按照1：100體積比分別加入-巰基乙醇，分裝至相應(yīng)的預(yù)先標(biāo)記好的微量離心管中，每管600µL。4.2.2.2 將150 µl組織研磨混懸液分別加入相應(yīng)的RLT液管中，充分混勻。

21、4.2.2.3 混勻后依次加入750µl 70的乙醇，充分混勻。4.2.2.4 從Kit中取出帶收集管的濾柱，打開包裝將其做好標(biāo)記。取步驟2中的混合液750µl加入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄收集管中的離心液。4.2.2.5 濾柱仍放回收集管上，將步驟2剩余的混合液全部轉(zhuǎn)入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄離心液；4.2.2.6 于濾柱中加入700µl Wash Buffer RW1液，12000rpm，離心15s。4.2.2.7 從QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干凈的2mL收集管，將離心后的濾柱移到新的收集管上，加入500

22、µl Wash Buffer RPE液，12000rpm，離心15s。4.2.2.8 棄收集管中的離心液，再于濾柱中加入500µl Wash Buffer RPE液，1300014000rpm，離心2min。4.2.2.9 將濾柱移到一個(gè)無(wú)RNA酶的干凈的1.5mL eppendorf管上，向?yàn)V柱中加入3050µl的RNase-free Water,室溫靜置13min。4.2.2.10 12000rpm，離心1min，離心液即為病毒RNA，立即檢測(cè)或-70以下保存。4.3 常規(guī)半套式RT-PCR方法檢測(cè)登革病毒核酸4.3.1 引物：引物序列見下表引物序列片段大小D

23、1 5-TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG-3 511 D2 5-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC-3 511 TS1 5-CGTCTCAGTGATCCGGGGG-3 482 (D1+TS1) TS2 5-CGCCACAAGGGCCATGAACAG-3 119 (D1+TS2) TS3 5-TAACATCATCATGAGACAGAGC-3 290 (D1+TS3) TS4 5-CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA-3 392 (D1+TS4) 4.3.2 PCR擴(kuò)增根據(jù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)所使用病毒核酸PCR擴(kuò)增試劑盒特點(diǎn)，正向引物 D1和反向引物D

24、2配置第一輪PCR體系，進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。推薦反應(yīng)條件為94預(yù)變性2min，然后94變性30秒，55退火30秒， 72延伸1分鐘，反應(yīng)40循環(huán)，最后72延伸10分鐘。第二輪分型PCR擴(kuò)增體系配置采用正向引物D1與反向引物TS1、TS2、TS3和TS4。推薦反應(yīng)條件為94預(yù)變性2min，然后94變性30秒，55退火30秒， 72延伸1分鐘，反應(yīng)30循環(huán)，最后72延伸10分鐘。4.3.3 1.5%濃度瓊脂糖電泳分析，確定病毒型別。4.3.4 結(jié)果判讀4.3.4.1 陽(yáng)性：1型：電泳顯示略小于500 bp的DNA片段。2型：電泳顯示略大于100bp的DNA片段。3型：電泳顯示略小于300bp的D

25、NA片段。4型：電泳顯示略小于400bp的DNA片段。4.3.4.2 陰性：無(wú)特異性核酸片段擴(kuò)增。4.3.5 意義陽(yáng)性結(jié)果可以確診登革病毒感染，可用于登革熱早期診斷。4.4實(shí)時(shí)定量RT-PCR法分型檢測(cè)登革病毒核酸4.4.1引物與探針引物/探針序列熒光標(biāo)記DEN-1 8973FCAAAAGGAAGTCGTGCAATADEN-1 9084CCTGAGTGAATTCTCTCTACTGAACCDEN-1 8998probeCATGTGGTTGGGAGCACGCFAM/BHQ-1DEN-2 1443FCAGGTTATGGCACTGTCACGATDEN-2 1518CCCATCTGCAGCAACACCA

26、TCTCDEN-2 1469probeCTCTCCGAGAACAGGCCTCGACTTCAAHEX/BHQ-1DEN-3 740FGGACTGGACACACGCACTCADEN-3 813CCATGTCTCTACCTTCTCGACTTGTCTDEN-3 762probeACCTGGATGTCGGCTGAAGGAGCTTGTesasRed/BHQ-2DEN-4 904FTTGTCCTAATGATGCTGGTCGDEN-4 992CTCCACCTGAGACTCCTTCCADEN-4 960probeTTCCTACTCCTACGCATCGCATTCCGCy5/BHQ-34.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-

27、PCR擴(kuò)增實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)配置體系，參考如下：RNA模板5µl，酶0.5µl，緩沖液12.5µl，引物各0.5µl(共4對(duì),8條)，探針各0.25µl，加水至總體積25µl。推薦反應(yīng)條件為5030min，952min，9515s、6030s反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。4.4.3 結(jié)果判斷以熒光PCR反應(yīng)的前315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為本底信號(hào)，以本底信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍作為熒光閾值，標(biāo)本擴(kuò)增產(chǎn)生的熒光信號(hào)達(dá)到熒光閾值時(shí)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)為循環(huán)閾值（Ct值），以Ct<35熒光信號(hào)數(shù)據(jù)線性化處理后對(duì)應(yīng)循環(huán)數(shù)生成的曲線圖成“S”形的標(biāo)本，

28、可判斷為相應(yīng)的登革病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性。4.4.4 意義是一種靈敏、特異、低污染的登革病毒RNA檢測(cè)方法，可以定性或定量檢測(cè)登革熱患者血清或蚊媒標(biāo)本中的登革病毒。附件5細(xì)胞培養(yǎng)分離登革病毒1 目的分離登革病毒。2 適用范圍2.1無(wú)菌采集發(fā)病后5日內(nèi)的登革患者血標(biāo)本。2.2經(jīng)研磨處理的媒介蚊標(biāo)本（參見附件11）。4 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備4.1 核對(duì)被檢樣品：患者標(biāo)本應(yīng)核對(duì)患者的姓名、性別、年齡、編號(hào)及檢測(cè)項(xiàng)目等。蚊媒標(biāo)本應(yīng)核對(duì)標(biāo)本種類、編號(hào)、性狀等。4.2生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單層登革病毒敏感細(xì)胞C6/36，BHK21，VERO等4.3待測(cè)樣品在檢測(cè)前應(yīng)放置于2-8冰箱或置于冰上。5、操作步驟5.1取10µ

29、L患者血清或蚊懸液20µL用Hanks液稀按1：10稀釋至0.1mL或0.2mL備用。5.2將在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)好的單層細(xì)胞上清棄掉，用Hanks液洗滌2遍。5.3將稀釋好的標(biāo)本接種細(xì)胞，接種C6/36細(xì)胞在28吸附1小時(shí)， BHK21細(xì)胞在37吸附1小時(shí)，補(bǔ)加維持液至1mL，C6/36細(xì)胞在28培養(yǎng)，BHK21細(xì)胞在37培養(yǎng)。5.4第二天開始觀察細(xì)胞病變情況。如果沒有細(xì)胞病變，則盲傳3代（每次取細(xì)胞懸液0.1ml）接種細(xì)胞傳代。5.4免疫熒光法鑒定登革病毒5.4.1細(xì)胞抗原片的制備：出現(xiàn)“+”細(xì)胞病變的細(xì)胞倒去維持液（若盲傳無(wú)細(xì)胞病變出現(xiàn)，仍然按此方法制備），用pH7.2 P

30、BS洗滌2次，加PBS用滴管把細(xì)胞從管壁上吹下，吹散，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄去PBS，細(xì)胞沉淀用0.2mlPBS吹散，滴加在抗原片上，吹干，冷丙酮固定10分鐘，PBS沖洗2次，蒸餾水漂洗1次，吹干備用；5.4.2按順序滴加熒光標(biāo)記單克隆抗體2孔，對(duì)照2孔（加PBS），置濕盒內(nèi)37水浴30分鐘；5.4.3取出，用PBS沖洗3次，蒸餾水漂洗1次，吹干；5.4.4熒光顯微鏡觀察結(jié)果。5.5其他檢測(cè)病毒抗原或核酸鑒定登革病毒參見附件2、4、5。5.6結(jié)果判斷：免疫檢測(cè)有特異性黃綠色顆粒狀熒光，檢測(cè)出病毒NS1抗原或病毒核酸可確定病毒分離成功。5.7意義：從病人血清或蚊媒中分離出登革病毒，可確診

31、登革感染。6廢棄物處理所有實(shí)驗(yàn)用品都應(yīng)嚴(yán)格按照有關(guān)傳染病處理方法高壓處理。附件6IgM捕捉ELISA法（MacELISA）檢測(cè)登革熱IgM抗體1 目的檢測(cè)出登革病毒特異性IgM抗體。2 適用范圍適用于人血清或血漿中登革病毒特異性IgM抗體的快速檢測(cè)。3 樣品接收和準(zhǔn)備3.1 核對(duì)被檢樣品（血清或血漿）患者的姓名、編號(hào)及檢測(cè)項(xiàng)目等。3.2 待測(cè)樣品在檢測(cè)前應(yīng)放置于2-8冰箱或置于冰上。4 檢測(cè)項(xiàng)目及參數(shù)本方法檢測(cè)項(xiàng)目為檢測(cè)血清或血漿中病毒特異性IgM抗體5 檢測(cè)儀器設(shè)備和材料加樣器、溫箱、洗板機(jī)、含波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀、登革病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒，或?qū)嶒?yàn)室自備材料：5.1 抗原：陽(yáng)性抗原：采

32、用C6/36細(xì)胞感染登革病毒培養(yǎng)物為陽(yáng)性抗原。陰性抗原：未接種病毒的正常C6/36細(xì)胞為陰性抗原對(duì)照。5.2抗人IgM（鏈）單克隆抗體或多克隆抗體；5.3登革病毒IgM陽(yáng)性、陰性對(duì)照血清；5.4辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記登革病毒單克隆抗體；5.5緩沖液：洗滌液：pH7.4 PBST（0.05吐溫20）；稀釋液：pH7.4 PBS（5牛血清）；封閉液：pH9.6 碳酸緩沖液（1牛血清白蛋白）；5.6顯色液：A/B液5.7終止液：4N H2SO46 檢測(cè)的環(huán)境條件生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-2）中進(jìn)行,滅活后樣本在生物安全一級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-1）內(nèi)進(jìn)行。7 檢測(cè)原理本方法采用抗人鏈捕獲人血清IgM抗體，加

33、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的病毒抗原物，用以檢測(cè)出血熱特異性IgM抗體。具有較高的敏感性、特異性和重復(fù)性。適用于出血熱的早期特異性診斷及其它實(shí)驗(yàn)性研究。8 檢測(cè)步驟8.1 用稀釋液按效價(jià)稀釋抗人鏈單克隆抗體，100l/孔，加蓋，4過(guò)夜；8.2 棄去抗人鏈，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，加封閉液，100l/孔，置37水浴孵育2小時(shí)；8.3 棄封閉液，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干。8.4 將待檢血清用稀釋液從1：10開始作2或4倍連續(xù)稀釋，加入酶標(biāo)板孔中，100l/孔，同時(shí)加入已1：10稀釋的陽(yáng)性血清、陰性血清對(duì)照各4孔，100l/孔，置37水浴孵育2小時(shí)；8.5 棄去血清，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，分別加4個(gè)型

34、DV抗原及陰性抗原對(duì)照，100l/孔，4過(guò)夜；8.6 棄抗原，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，加用稀釋液稀釋至工作濃度的相應(yīng)的登革熱酶標(biāo)單克隆抗體，正?？乖?個(gè)型混合的酶標(biāo)單克隆抗體，100l/孔，37水浴2小時(shí)；8.7 棄去標(biāo)記物，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，于各反應(yīng)孔內(nèi)加A/B液各一滴，37，避光35分鐘；8.8 加終止液于每反應(yīng)孔，一滴/孔。9 結(jié)果判斷（1）目測(cè)方法：陽(yáng)性對(duì)照孔呈明顯藍(lán)色，陰性對(duì)照孔呈無(wú)色，對(duì)照成立；若待檢血清孔呈明顯淡藍(lán)色或深藍(lán)色（TMB），則標(biāo)本為登革熱IgM抗體陽(yáng)性，反之陰性。（2）酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)：于450nm（TMB）陽(yáng)性對(duì)照孔OD值/陰性對(duì)照孔OD值，即P/N2

35、.1，對(duì)照成立；若待檢血清孔OD值與陰性對(duì)照孔OD比值2.1，則標(biāo)本為登革熱IgM抗體陽(yáng)性，反之陰性。（陰性對(duì)照孔OD值小于0.05按0.05記，若大于0.05按實(shí)際數(shù)值計(jì)算）10 意義陽(yáng)性結(jié)果，提示患者新近登革病毒感染，用于登革熱早期臨床診斷。附件7酶聯(lián)免疫法檢測(cè)登革病毒IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)操作程序1 目的檢測(cè)出登革病毒特異性IgG抗體。2 適用范圍適用于人血清或血漿中登革病毒特異性IgG抗體的快速檢測(cè)。3 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備（1）核對(duì)被檢樣品（血清或血漿）患者的姓名、編號(hào)及檢測(cè)項(xiàng)目等。（2）待測(cè)樣品在檢測(cè)前應(yīng)放置于2-8冰箱或置于冰上。4 檢測(cè)項(xiàng)目及參數(shù)本方法檢測(cè)項(xiàng)目為檢測(cè)血清或血漿中病毒特異性IgG抗

36、體5 檢測(cè)儀器設(shè)備和材料加樣器、溫箱、洗板機(jī)、含波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀、登革病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒，或?qū)嶒?yàn)室自備材料：5.1 抗原：陽(yáng)性抗原：采用C6/36細(xì)胞感染登革病毒培養(yǎng)物為陽(yáng)性抗原。陰性抗原：未接種病毒的正常C6/36細(xì)胞為陰性抗原對(duì)照。5.2 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體；5.3 緩沖液：包被液：pH9.6碳酸緩沖液；稀釋液：pH7.4 PBS（含5%脫脂奶）洗滌液：pH7.4 PBST（0.05吐溫20）；5.4 顯色液：A/B液5.5 終止液：4NH2SO45.6 酶標(biāo)板、酶標(biāo)儀。6 檢測(cè)的環(huán)境條件生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-2）中進(jìn)行,滅活后樣本在生物安全一級(jí)實(shí)驗(yàn)室（B

37、SL-1）內(nèi)進(jìn)行。7 檢測(cè)步驟7.1 用包被液按工作濃度稀釋抗原，100l/孔，4過(guò)夜；7.2 棄去包被液，用PBS-T重復(fù)洗滌35次，甩干；7.3 將待檢血清用稀釋液從1：100開始作2或4倍連續(xù)稀釋，加入抗原孔，100l/孔，同時(shí)設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照，37水浴1小時(shí)；7.4 棄去血清，用洗滌液洗滌56次；7.5 加酶結(jié)合物，用稀釋液按工作濃度稀釋，100l/孔，37水浴1小時(shí)；7.6 棄去酶標(biāo)抗體，用洗滌液洗滌6次，甩干；7.7 加顯色液：于各反應(yīng)孔內(nèi)加A/B液各一滴，37，避光35分鐘；7.8 加終止液于每反應(yīng)孔，100l /孔。8 結(jié)果判斷于450nm（TMB）陽(yáng)性對(duì)照孔OD值/陰性對(duì)照孔O

38、D值，即P/N2.1，對(duì)照成立；若待檢血清孔OD值與陰性對(duì)照孔OD比值2.1，則標(biāo)本為登革熱IgG抗體陽(yáng)性，反之陰性。（陰性對(duì)照孔OD值小于0.05按0.05記，若大于0.05按實(shí)際數(shù)值計(jì)算）9 意義陽(yáng)性結(jié)果，表明曾受到DV感染；恢復(fù)期血清抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)，或抗體滴度比急性期抗體滴度有4倍及以上升高則可確診。附件8免疫熒光法檢測(cè)登革病毒IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)操作程序1 目的免疫熒光法（IFA）檢測(cè)抗登革病毒IgG抗體。2 適用范圍適用于人血清或血漿中登革熱病毒特異性IgG抗體的快速檢測(cè)。3 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備（1） 核對(duì)被檢樣品（血清或血漿）患者的姓名、編號(hào)及檢測(cè)項(xiàng)目等。（2）待測(cè)樣品在檢測(cè)前應(yīng)放置于2-8冰箱或置于冰上。5 檢測(cè)項(xiàng)目及參數(shù)本方法檢測(cè)項(xiàng)目為檢測(cè)血清或血漿中抗登革熱病毒IgG抗體6 檢測(cè)儀器設(shè)備和材料6.1 DV14型抗原片：DV標(biāo)準(zhǔn)毒株感染VERO或BHK21細(xì)胞制備，低溫干燥保存；6.2 對(duì)照：登革熱患者恢復(fù)期血清（陽(yáng)性對(duì)照），非登革熱患者血清陰性對(duì)照)；6.3 羊抗人（或兔抗人）IgG熒光素標(biāo)記抗體；6.4 常用稀釋液：pH7.27.4PBS、伊文思蘭等；6.5 熒光顯微鏡。7 檢測(cè)的環(huán)境條件生