凍干皮上劃痕人用布氏菌病活菌苗制造及檢定規(guī)程

1、凍干皮上劃痕人用布氏菌病活菌苗制造及檢定規(guī)程本品系采用布氏菌弱毒菌株，經(jīng)培育后凍干制成。用于預(yù)防 布氏菌病。1菌種1.1 用弱毒牛型104M菌種。菌種應(yīng)由中國(guó)藥品生物制品檢 定所分發(fā)或經(jīng)同意。1.2 菌種應(yīng)經(jīng)凍干，保存于28C,并指定專(zhuān)人負(fù)責(zé)保管。1.3 禁止使用通過(guò)動(dòng)物后再分離培育出之菌株制造菌苗。1.4 菌種的免疫力試驗(yàn)每 3年至少檢定一次。1.5 菌種檢定1.5.1 培養(yǎng)特性在含有1 : 50000堿性復(fù)紅培養(yǎng)基上應(yīng)生長(zhǎng)，但在含有同樣 濃度的硫堇培養(yǎng)基上不應(yīng)生長(zhǎng)（亦可用紙片法檢查），在肝瓊脂 斜面培養(yǎng)基上產(chǎn)生微量硫化氫。涂片鏡檢應(yīng)為革蘭氏陰性球桿 菌。1.5.2 變異檢查菌懸液，置90C

2、水浴中30分鐘，不應(yīng)出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。用同樣濃 度的菌懸液，與1 : 1000三勝黃素水溶液等量混合，于37C放24小時(shí)，不應(yīng)出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。用結(jié)晶紫菌落染色法檢查，菌落 變異率不得超過(guò)3%1.5.3 噬菌體裂解試驗(yàn)將菌種接種于肝瓊脂平皿上，滴加布氏菌Tb噬菌體1滴，于37C培育4448小時(shí)，在噬菌體流過(guò)的地方應(yīng)無(wú)本菌生長(zhǎng)。1.5.4 血清學(xué)試驗(yàn)用生理鹽水將新鮮培養(yǎng)物制成含菌數(shù)為 50億/ml的菌懸液， 與已知效價(jià)的布氏菌診斷血清作凝集反應(yīng)， 其凝集價(jià)應(yīng)達(dá)到血清 原效價(jià)。1.5.5 殘余毒力檢查用生理鹽水將37 C培育4448小時(shí)之肝瓊脂斜面新鮮培養(yǎng) 物制成菌懸液，并稀釋成 15億/ml、30億/m

3、l、60億/ml、120 億/ml和240億/ml等5個(gè)濃度的菌懸液。取體重 1820g小白 鼠25只分為5組，各組分別用不同濃度的菌懸液腹腔注射，每 只0.5ml，觀(guān)察7天，計(jì)算LD5Q其值應(yīng)為1020億菌。1.5.6 免疫力試驗(yàn)用生理鹽水將菌種1代新鮮培養(yǎng)物制成濃度為 2億/ml的菌 懸液。取體重300350g豚鼠10只。每只皮下注射1ml,經(jīng)25 30天后，每只豚鼠皮下攻擊羊型強(qiáng)毒布氏菌10個(gè)或20個(gè)感染量（MID）。同時(shí)取3組健康豚鼠作對(duì)照，每組 3只，分別于各 組豚鼠皮下注射0.5、1及2個(gè)MID。免疫及對(duì)照豚鼠于注射毒 菌懸液后均觀(guān)察2530天后解剖，取出鼠蹊部淋巴結(jié)、腹主動(dòng) 脈旁

4、淋巴結(jié)、肝及脾分別接種肝瓊脂中管斜面培養(yǎng)基，于37C培育10天。如免疫動(dòng)物組織之培養(yǎng)物有布氏菌生長(zhǎng)，應(yīng)用硫堇 染科培養(yǎng)基（亦可用紙片法）和硫化氫反應(yīng)做菌型鑒別試驗(yàn)。注 射1個(gè)MID的3只對(duì)照豚鼠都必須發(fā)生全身感染，即肝臟或脾臟應(yīng)分離出羊型毒菌。免疫組攻擊 10個(gè)MID時(shí)，10只豚鼠中不 應(yīng)有2只以上分離出羊型毒菌；攻擊 20個(gè)MID時(shí)，10只豚鼠中 不應(yīng)有3只以上分離出羊型毒菌。2菌苗制造2.1 制造菌苗的工作室應(yīng)專(zhuān)用，不得與其他細(xì)菌工作混用。 生產(chǎn)中應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作，非制造菌苗用的其他布氏菌不得帶 到生產(chǎn)工作室內(nèi)。2.2 制造菌苗可用pH6.67.2的肝浸液瓊脂或其他適宜 培養(yǎng)基。2.3

5、啟開(kāi)凍干菌種，接種在肝瓊脂斜面或其他適宜的培養(yǎng)基上，放37C培育4448小時(shí)為第1代。第1代菌須進(jìn)行1 ：500 三勝黃素玻片凝集試驗(yàn)，只有光滑型菌方可用于制造菌苗。第1代菌種斜面于28C可保存15日。2.4 將第1代菌種接種到肝瓊脂或其他適宜培養(yǎng)基上，放 37C培育4448小時(shí)為第2代菌種。經(jīng)肉眼純菌檢查合格后， 棄去凝固水，用無(wú)菌生理鹽水制成菌懸液。2.5 將第2代菌種接種到瓊脂或其他適宜培養(yǎng)基上，放37C培育4448小時(shí)，肉眼逐瓶檢查，有雜菌者廢棄。2.6 用含有蔗糖、明膠、硫脲和味精組成的保護(hù)液或其他適宜的保護(hù)液洗下菌苔或刮取菌苔，放入保護(hù)液內(nèi)。每數(shù)瓶培養(yǎng)物可采入或刮入1瓶（或1大管）

6、保護(hù)液內(nèi)，此為菌苗原液，置 28C保存。每瓶（或大管）原液均按生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程 進(jìn)行純菌試驗(yàn)。2.7 將純菌試驗(yàn)合格的原液合并，如每安瓿凍干菌苗為10人份，裝量0.5ml原液，則應(yīng)合并后的原液稀釋成每 ml含菌1800 億2000億，使每1人份菌苗含90億100億。由原液采集到 冷凍干燥之間隔不得超過(guò) 7天。稀釋后的原液經(jīng)純菌試驗(yàn)合格后 即可分裝安瓿凍干。2.8 同一日采集的原液同一次凍干者為1批。如1批有數(shù)瓶，應(yīng)分為亞批。3冷凍干燥菌苗原液分裝安瓿完畢后應(yīng)立即在 -30 C以下進(jìn)行冷凍。干 燥時(shí)間可根據(jù)水分含量及活菌數(shù)來(lái)決定。干燥完畢后進(jìn)行真空封 口。亦可用充氮封口。4成品檢定4.1 物

7、理化學(xué)檢查凍干菌苗應(yīng)為乳白色疏松體， 加入生理鹽水后，應(yīng)于1分鐘 內(nèi)溶解成均勻懸液。用真空測(cè)定器檢查安瓿應(yīng)為真空。 水分含量 不得超過(guò)3%4.2 菌型檢查每亞批菌苗應(yīng)用硫堇培養(yǎng)基或紙片法及硫化氫反應(yīng)做菌型鑒別檢查，應(yīng)呈牛型布氏菌的培養(yǎng)特性。4.3 純菌試驗(yàn)每亞批菌苗抽樣按生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行。4.4 活菌計(jì)數(shù)及菌落變異檢查每亞批取3支安瓿，加生理鹽水溶解混勻后比濁。將菌液濃度稀釋為含菌10億/ml，再用生理鹽水做10倍系列稀釋至10-6， 取10-6或其他適宜的稀釋度之菌液接種5個(gè)平皿，每個(gè)平皿接種0.1ml。用涂菌棒涂勻后放 37C培育45天，計(jì)算活菌數(shù)。凍 干后活菌率不得少于50%如不

8、合格可復(fù)試，經(jīng)復(fù)試仍低于 50% 者則該批菌苗廢棄。同時(shí)用結(jié)晶此菌落染色法檢查，菌落變異率 不得超過(guò)10%4.5 濃度測(cè)定菌苗經(jīng)溶解后，按中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定濃度，每人份含菌數(shù)應(yīng)為90億100億。4.6 安全試驗(yàn)每亞批取3支安瓿，用生理鹽水溶解后混勻。用體重 18 20g小白鼠5只，每只皮下注射10億菌/ml的菌懸液0.5ml。觀(guān) 察7日不應(yīng)有死亡，如有死亡應(yīng)復(fù)試一次，仍有死亡，則該批菌 苗廢棄。4.7 免疫力試驗(yàn)10批以下者至少抽1批進(jìn)行免疫力試驗(yàn)，10批以上者，每 10批抽1批。用滅菌生理鹽水溶解凍干菌苗，并稀釋成 5億菌 /ml菌懸液。取體重300350g豚鼠10只，每只皮下注射1ml。 經(jīng)2530日后，每只豚鼠皮下攻擊羊型線(xiàn)毒布氏菌 10個(gè)或20 個(gè)MID。同時(shí)用3組健康豚鼠作對(duì)照，每組 3只，各組豚鼠分別 于皮下注射0.5、1和2MIDb各組不能自拔于注射毒菌懸液后 25 30日解剖，取鼠蹊部淋巴結(jié)、腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)、肝及脾，分別接種肝瓊脂中管斜面培養(yǎng)基，于 37C培育10天。如免疫動(dòng)物 組織之培養(yǎng)物有布氏菌生長(zhǎng)，需用硫堇培養(yǎng)基（亦可用紙片法） 和硫化氫反應(yīng)做菌型鑒別試驗(yàn)。 注射1個(gè)MID