限制性內切酶酶切位點及保護堿基

1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上寡核苷酸近末端位點的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides) 為什么要添加保護堿基？在分子克隆實驗中，有時我們會在待擴增的目的基因片段兩端加上特定的酶切位點，用于后續(xù)的酶切和連接反應。由于直接暴露在末端的酶切位點不容易直接被限制性核酸內切酶切開，因此在設計PCR引物時，人為的在酶切位點序列的5端外側添加額外的堿基序列，即保護堿基，用來提高將來酶切時的活性。其次，在分子克隆實驗中選擇載體的酶切位點時，相臨的兩個酶切位點往往不能同時使用，因為一個位點切割后留下的堿基過少以至于影響旁邊的

2、酶切位點切割。該如何添加保護堿基？添加保護堿基時，最關心的應該是保護堿基的數(shù)目，而不是種類。什么樣的酶切位點，添加幾個保護堿基，是有數(shù)據(jù)可以參考的。添加什么保護堿基，如果嚴格點，是根據(jù)兩條引物的Tm值和各引物的堿基分布及GC含量。如果某條引物Tm值偏小，GC%較低，添加時多加G或C，反之亦反。為了解不同內切酶對識別位點以外最少保護堿基數(shù)目的要求，NEB采用了一系列含識別序列的短雙鏈寡核苷酸作為酶切底物進行實驗。實驗結果對于確定雙酶切順序將會有幫助（比如在多接頭上切割位點很接近時），或者當切割位點靠近DNA末端時也很有用。在本表中沒有列出的酶，則通常需在識別位點兩端至少加上6個保護堿基，以確保酶

3、切反應的進行。實驗方法：用-32PATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下標記0.1A260單位的寡核苷酸。取1 µg已標記了的寡核苷酸與20單位的內切酶，在20°C條件下分別反應2小時和20小時。反應緩沖液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及適量的NaCl或KCl（視酶的具體要求而定）。20%的PAGE（7 M尿素）凝膠電泳分析，經放射自顯影確定酶切百分率。本實驗采用自連接的寡核苷酸作為對照。若底物有較長的回文結構，切割效率則可能因為出現(xiàn)發(fā)夾結構而降低。酶寡核苷酸序列鏈長切割率%2 hr20 hrAcc IGGTCG

4、ACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 8 10 120 0 00 0 0Afl IIICACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG8 10 120 >90 >900 >90 >90Asc IGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >90Ava ICCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA8 10 1250 >90 >90>90 >90 >90BamH ICGGATCCG

5、CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG8 10 1210 >90 >9025 >90 >90Bgl IICAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC8 10 120 75 250 >90 >90BssH IIGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 120 0 500 0 >90BstE IIGGGT(A/T)ACCC9010BstX IAACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT22 24

6、 270 25 250 50 >90Cla ICATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG8 8 10 120 0 >90 500 0 >90 50EcoR IGGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >90Hae IIIGGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >90Hind IIICAAGCTTG CCAAGCTTGG

7、 CCCAAGCTTGGG8 10 120 0 100 0 75Kpn IGGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG8 10 120 >90 >900 >90 >90Mlu IGACGCGTC CGACGCGTCG8 100 250 50Nco ICCCATGGG CATGCCATGGCATG8 140 500 75Nde ICCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC8 10 12 18 20 220

8、0 0 0 75 750 0 0 0 >90 >90Nhe IGGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG8 10 120 10 100 25 50Not ITTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA12 16 20 24 280 10 10 25 250 10 10 90 >90Nsi ITGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT12 2210 >90>

9、;90 >90Pac ITTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG8 10 120 0 00 25 >90Pme IGTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG8 10 12 240 0 0 750 25 50 >90Pst IGCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT8 14 22 24 260 10 >90 >90 0

10、0 10 >90 >90 0Pvu ICCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA8 10 120 10 00 25 10Sac ICGAGCTCG81010Sac IIGCCGCGGC TCCCCGCGGGGA8 120 500 >90Sal IGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA28 30 320 10 100 50 75Sca IGAGTACTC AAAAGTACTTTT8 1210 7525 75Sma

11、 ICCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA6 8 10 120 0 10 >9010 10 50 >90Spe IGACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG8 10 12 1410 10 0 0>90 >90 50 50Sph IGGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT8 12 140 0 100 25 50Stu IAAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >90Xba ICTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG8 10 12 140 >90 75 750 &g