鵝源H5N1亞型禽流感病毒對(duì)SPF雛雞血液免疫功能的影響.docxVIP

1、2011年】2月JournalofNortheastAgriculturalUniversityDec.2011鵝源H5N1亞型禽流感病毒對(duì)SPF雛雞血液免疫功能的影響鄭世民】，王濱坤2,高雪麗】，劉超男】，劉明3,呂曉萍】(I.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱I5OO3O：2.上海恒豐強(qiáng)動(dòng)物藥業(yè)有限公司，上海201620；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，哈爾濱150001)摘要：以21日齡SPF雛雞為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，應(yīng)用知胞培養(yǎng)和免疫酶技術(shù)，通過(guò)外周血液免疫球蚩白(Igs)含量、T和B淋巴細(xì)胞數(shù)量及其增殖功能的檢測(cè).枝全面系統(tǒng)的研究,了鵝源H5N1亞型中強(qiáng)毒禽流感病毒(A】V)感染SPF站雞后

2、，其外周血液上述被檢指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明，鵝源H5N1亞型中強(qiáng)毒AIV感染SPF維雞后，其血清IgG和IgA含量在14d顯著或極顯著低于對(duì)照雛雞(P<0.05或PvO.Ol),并分別于82Id和58d顯著高于對(duì)照雛雞(P<0.05或PvO.Ol);而IgM在病事感染后4d開始升高，58d明顯高于對(duì)照維雞。血液T淋巴細(xì)胞數(shù)量于病毒感染后114d顯著低于對(duì)照雛雞(P<0.05或P<0.0I),B淋巴細(xì)胞在314d明顯降低(P<0.05或P<0.01)；T、B淋巴細(xì)胞對(duì)ConA或PMA的增殖反應(yīng)分別于314d、38d明星低于對(duì)照雛雞(P<0.05或P&l

3、t;0.0】)。表明AIV感染21日齡SPF雛雞后的早期，其外周血液無(wú)論是細(xì)胞免疫還是體液免疫功能均降低,關(guān)鍵詞：H5N1亞型禽流感病毒；SPF雛雞；血液；T、B淋巴細(xì)胞數(shù)量及其功能；免疫球蛋白含量中圖分類號(hào)：S852.56文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1005-9369(2011)12-0069-05InfluenceofH5N1avianinfluenzavirusfromgoosetoimmunefunctioninbloodofSPFChickens/ZHENGShimin1,WANGBinkun2,GAOXueli1,LIUChaonan1,LIUMing3,LVXiaoping1(1.C

4、ollegeofVeterinaryMedicines,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China;2.ShanghaiHengfengqiangAnimalPharmaceuticalCo.Ltd.,Shanghai201620,China;3.HarbinVeterinaryResearchInsititute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150001,China)Abstract:Thedynamicchangesoftheimmunoglobulins(Igs)conte

5、nt,thenumberandfunctionofT、Blymphocytesinperipheralbloodof21day-oldSPFchickensinfectedwithH5N1subtypeavianinfluenzavirus(AIV)fromgooseweredetectedbyusingcellularcultureandimmunoenzymetechniques.TheresultsshowedthatcontentofIgGandIgAinserumofchickensinfectedwithAIVweresignificantlyorverysignificantly

6、lowerthanthecontrolchickensinpostinfection(PI)1-4days(P<0.05orP<0.01),andweresignificantlyhigherthanthoseofthecontrolchickens,respectively,inPI8-21daysand5-8days;andIgMcontentbegantoincreaseinPI4days,wassignificantlyhigherthanthatofthecontrolchickensinPI5-8days.ThenumberofTlymphocytesinperiphe

7、ralbloodofchickensinfectedwithAIVwassignificantlylowerthanthecontrolchickensinPI1-14days(P<0.05orP<0.01).ThenumberofBlymphocytesdecreasedsignificantlyatPI3-14days(P<0.05orP<0.01).TheproliferationresponseofT,BlymphocytestoConAorPMAreducedmarkedlythanthecontrolchickens,respectively,atPI3-1

8、4days,3-8days.Theseresultsindicatedthattheeithercellimmunityorhumoralimmunityinperipheralbloodof21-day-oldSPFchickensinfectedwithH5N1AIVshowedacertaininhibition.收稿日期：2011-01-24基金項(xiàng)目：黑龍江省自然基金(C20084I)作者簡(jiǎn)介：鄭世民(1959-),男.教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物免疫病理學(xué)。E-mail:zhengshiminblKeywords:H5N1avianinfluenzavirus;SPFchicke

9、n;blood;numberandfunctionofTandBlymphocyte;immunoglobulincontent禽流感(Avianinfluenza,Al)是一種急性熱性接觸性傳染病"I,流行范圍很廣，尤其近年AI疫情呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，給主要養(yǎng)禽國(guó)家造成巨大經(jīng)濟(jì)損失叫自上世紀(jì)90年代香港禽流感事件以來(lái)叫AI的公共衛(wèi)生學(xué)意義發(fā)生了質(zhì)的改變，AI不但得到廣大學(xué)者的關(guān)注，而且已引起了包括聯(lián)合國(guó)在內(nèi)的世界各國(guó)政府的高度重視?？v觀對(duì)AI已有的研究資料，主要集中在病原學(xué)、流行病學(xué)、特異性診斷、DNA序列分析和疫苗研制等方面A”。在宿主抗AIV免疫反應(yīng)機(jī)制方面，只見于人和小鼠的少量報(bào)道

10、咿，對(duì)SPF雛雞感染A1V后外周血液體液免疫和細(xì)胞免疫變化的全面系統(tǒng)研究尚未見報(bào)道。因此，本項(xiàng)目以21日齡SPF雛雞為研究對(duì)象，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、免疫酶組織化學(xué)等方法，對(duì)AIV感染21日齡SPF雛雞外周血IgG、IgM和IgA含量.T、B淋巴細(xì)胞數(shù)量及其對(duì)ConA或PMA的增殖反應(yīng)進(jìn)行了較全面系統(tǒng)的檢測(cè)，旨在為進(jìn)一步探討流感病毒的免疫致病機(jī)制，為其獸醫(yī)臨診綜合防治提供重要的參考依據(jù)。1材料與方法1.1材料1.1.1實(shí)臉動(dòng)物21日齡CSIRO-MVS品系SPF雛雞70只，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng)。1.1.2禽流感病毒(A1V)鵝源H5N1亞型AIV中強(qiáng)毒株，血

11、凝價(jià)為26,由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室提供，并監(jiān)督使用。1.1.3主要試劑酶標(biāo)羊抗兔IgG結(jié)合物(HRP-SARIgG),北京中山生物制品公司產(chǎn)品；兔抗雞IgG、妁、IgA血清(RACIgS),本研究室制備；刀豆蛋白A(ConA)、乙酸豆寇佛波醇(PMA)、RPMH640完全培養(yǎng)液和四甲基偶氮哇鹽(MTT)均為Sigma公司產(chǎn)品，按實(shí)驗(yàn)要求配成相應(yīng)使用液，4無(wú)保存?zhèn)溆谩?.2方法1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理70只SPF雛雞隨機(jī)分為AIV感染組(簡(jiǎn)稱I組)和對(duì)照組(簡(jiǎn)稱C組)，每組35只錐雞。其中I組雛雞經(jīng)點(diǎn)眼、滴鼻和口感染1：】00稀釋的AIV稀釋液O.lmL只氣C組

12、雛雞經(jīng)上述相同途徑給予高壓消毒的0.01mol-L-1PBS0.1mL-R',兩組雛雞分別飼養(yǎng)于禽病感染實(shí)驗(yàn)室的負(fù)壓隔離器內(nèi)，嚴(yán)格按照高致病性禽流感實(shí)驗(yàn)要求和SPF動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)程飼養(yǎng)管理。1.2.2被檢材料兩組雛雞分別于AIV感染后1、3、4、5、8、14和21d,每組隨機(jī)抽取5只雛雞，心臟采血2mL供外周血液T、B淋巴細(xì)胞數(shù)髭及其增殖功能檢測(cè)，然后心臟采血處死雛雞，收集0.5mL血清供IgG、gM、IgA檢測(cè)用。1.3檢測(cè)指標(biāo)與方法1.3.1外周血液T、B淋巴細(xì)胞數(shù)量測(cè)定采用免疫SPA菌體花環(huán)法。1.3.2 血清IgG、IgM、IgA含量測(cè)定采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Indirecte

13、nzyme-linkedimmuncsor-bentassay,iELISA)法。1.3.3 外周血液T、B淋巴細(xì)胞增殖功能測(cè)定133.1淋巴細(xì)胞懸液制備無(wú)菌采取外周血液，以淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法(2000r-min-*,20min)分離淋巴細(xì)胞，再用RPMI1640培養(yǎng)液離心洗滌(1500r-min-1,10min)淋巴細(xì)胞3次，臺(tái)盼蘭拒染法檢測(cè)細(xì)胞活率95%,并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度至2x10,個(gè)-mL-'o1332T、B淋巴細(xì)胞增殖功能測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)及MTT法96孔微量培養(yǎng)板，每孔加入50皿，含ConA(80jjtg-mL-1ConA)或PMA(

14、1200ng-mL-*PMA)的RPMI1640完全培養(yǎng)液，對(duì)照孔只加RPMI1640完全培養(yǎng)液，再加淋巴細(xì)胞懸液50nL,培養(yǎng)物總體積為100aL,細(xì)胞終濃度為1X10,個(gè)mLL刺激孔的ConA、PMA終濃度分別為40、600ng-mL',對(duì)照孔無(wú)ConA或PMA,每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。細(xì)胞培養(yǎng)板置40Y、5%C()2、飽和濕度條件下培養(yǎng)21h。然后每?L加5mgmLTMTT溶液10皿，再繼續(xù)培養(yǎng)3ho每孔加入10%SDS-0.01moI-L-*HC1溶液100jjlL,置細(xì)胞培養(yǎng)箱中8h,然后取出以空白孔調(diào)零。測(cè)定每孔0D知的0D值，結(jié)果以淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率表示。T、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率=Con

15、A或PMA刺激孔平均0D值/X寸照孔平均0D值1.4數(shù)據(jù)處理應(yīng)用Minitab軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，經(jīng)檢驗(yàn)分析組間差異。2結(jié)果與分析AIV感染21日齡SPF雛雞血液體液免疫功能變化2.1.1 AIV感染21日齡SPF雛雞血清免疫球蛋白含量的動(dòng)態(tài)變化21日齡SPF雛雞感染AIV后，其血清IgG含量于病毒感染后14d明顯低于對(duì)照雛雞（P<0.05或P<O.Ol）,第5天后開始逐漸升高，821d顯著高于對(duì)照雛雞（P<0.05或P<0.01）；【gM含量于第4天開始增加，58d顯著或極顯著高于對(duì)照雛雞（P<0.05或P<0.01）；而IgA含址在病毒感染后4d內(nèi)顯著

16、降低（P<0.05或PvO.Ol）,58d病毒感染雛雞較對(duì)照維雞明顯增加（P<0.05）,其余未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見表1）。2.1.2AIV感染21日齡SPF雛雞外周血液B淋巴細(xì)胞數(shù)量及其對(duì)PMA增殖功能變化21日齡SPF雛雞感染AIV后，其外周血液B淋巴細(xì)胞數(shù)量除第1天明顯高于對(duì)照雛雞（PvO.05）外，314d均顯著或極顯著（P<0.05或PvO.Ol）低于對(duì)照雛雞；B淋巴細(xì)胞對(duì)PMA的增殖反應(yīng)于病毒感染后38d明顯減弱（P<0.05或PcO.Ol）,其他除第1天外，其余盡管病毒感染雛雞較對(duì)照雛雞增加，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（己>0.05）（見表2）。項(xiàng)目天數(shù)Dayhe

17、m34581421IgGC1.36±0.0281.51±0.027l.56±0.0841.59±O.O76l.56±0.0391.55±0.074l.54±0.042I1.22±0.082*1.32±O.O47*l.43±0.074*1.60*0.0311.72±0.088»*1.67±0.095*l.64±0.086»IgMC1.28±0.0151.34±0.09!1.35±0.0021.3910.0861.34&

18、#177;0.076l.39±0.08l1.46±0.087I1.26±0.0571.28±0.0071.39±0.0341.49±0.038*l.53±O.O15”】.4810.1091.43±O.O15IgAC1.29±0.005l.52±0.0411.58H.OOI1.53±O.O651.53±O.O3Ol.49±0.0521.57±0.063Il.ll±0.076”1.32±O.O33”1.44±0.038*1.64&

19、#177;0.048*1.64±0.094*i.50±0.0881.59±0.045Table1Changesoftheimmunoglobulin(Igs)contentinserumof21-day-oldchickensInfectedwithAIV注:C-對(duì)照組,1-AlV感染組；*表示差異顯著P<0.05,，*表示差異極顯著R0.01.無(wú)衣示者差異不顯著/*>0.05;T同。Note：Q)Ccontrolgroup.I-groupinfectedwithAIV;ThevaJuenwithasteriskdiffersignificantly(

20、withsingleasterisk,P<0.05)orverysignificantly(withdoubleasterisk,戶vO.Ol)andviseversa.Thesameasbelow.表1AIV感染21日齡SPF雛雞血清免疫球蛋白含量變化表2AIV感染21日齡SPF雛雞血液B淋巴細(xì)胞數(shù)量及其增殖反應(yīng)變化Table2ChangesofthenumberandproliferativeresponsestoPMAofBlymphocytesinbloodof21-day-oldchickensinfectedwithAIV項(xiàng)目Item天數(shù)Day134581421數(shù)址C4.39

21、±0.885.60M.395.80±0.416.50±0.696.82±0.897.09t0.416.54±0.37Number15.78±0.44*3.12±O.O2“3.52±0.69"5.50±0.56*5.46±0.38"5.87±O.23“7.0410.46功能C1.50±0.08.36*0.071.13±O.O71.17±O.O51.2O±O.O81.23±0.110.99±0.03Functi

22、onI1.67*0.08*1.15±O.O2”1.00±0.05"1.01±0.02"l.O3±O.O9*1.26±0.09l.08±0.08注:B淋巴細(xì)胞數(shù)般單位是106個(gè)51：；功能為刺激指數(shù)。Note:UnitofBlymphocytesnumberis10*celbmL'1;functiona)unitsforthestimulationindex.22AIV感染SPF雛雞外周血液細(xì)胞免疫功能變化21日齡SPF雛雞感染AIV后l14d,其外周血液T淋巴細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照雛雞顯著或極顯著減少（P<0

23、.05或P<0.01）;T淋巴細(xì)胞對(duì)ConA的增殖反應(yīng)于病毒感染后314d明顯降低（P<0.05或P<0.01）,其余未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見表3）o表3AIV感染21日齡SPF雛雞血液T淋巴細(xì)胞數(shù)量及其對(duì)ConA增殖反應(yīng)變化Table3ChangesofthenumberandproliferativeresponsestoConAofTlymphocytesinbloodof21-day-oldchickensinfectedwithAIV項(xiàng)目hem天數(shù)Day134581421數(shù)址C5.78±O.2I7.65±0.248.46±0.!78.48*0

24、.4610.05±0.847.09±0.419.3010.89NumberI4.41±0.29*5.48±0.46*5.78±0.74*6.8910.36*6.99±0.40*5.87±0.23"8.50±0.78功能C1.4310.041.22±0.051.24±0.051.21±0.07l.O3±O.O81.23±0.11l.O3±O.O8FunctionI1.39±O.O50.95±0.0r*0.68±0.09

25、*0.92±0.10»*0.92±0.04*0.97±0.05*O.94±O.O8注:T淋巴細(xì)胞數(shù)量單位是I。個(gè)-mL1;功能為刺激指數(shù)。Note：UnitofTlymphocytesnumberisIO6cell,mL"1;functionalunitsforthestimulationindex.3討論本研究應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和免疫酶組織化學(xué)方法對(duì)21日齡SPF雛雞人工感染鵝源H5N1亞型中強(qiáng)毒AIV后,其外周血液的IgG、IgM、IgA含量，T、B淋巴細(xì)胞數(shù)屆及其對(duì)ConA或PMA增殖功能的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，21日齡

26、SPF雛鴻感染H5N1亞型AIV后，其血清IgG含量于病毒感染后14d明顯低于對(duì)照雛雞，隨后開始逐漸升高;IgM含量于58d顯著或極顯著高于對(duì)照維雞；而IgA含量在病毒感染早期顯著降低，58d較對(duì)照雛雞明顯增加。外周血液B淋巴細(xì)胞數(shù)扯于病毒感染后314d顯著或極顯著低于對(duì)照雛雞；B淋巴細(xì)胞對(duì)PMA的增殖反應(yīng)于病毒感染后38d明顯減弱。表明AIV感染雛雞外周血液的體液免疫功能受到一定程度抑制°據(jù)報(bào)道叫，雞自然感染AIV后第3天已有HA特異性抗體的產(chǎn)生，并且可維持較高水平。在抵御流感病毒感染中，以B淋巴細(xì)胞為主的體液免疫發(fā)揮了十分重要的作用。B淋巴細(xì)胞在致敏Th細(xì)胞及其分泌的某些細(xì)胞因子

27、(如IL-1、B細(xì)胞生長(zhǎng)因子、B細(xì)胞分化因子、IL-2等)作用下，分化發(fā)育為漿細(xì)胞，分泌T細(xì)胞依賴性(TD)ft體。Walter等研究發(fā)現(xiàn)叫T淋巴細(xì)胞缺陷小鼠流感病毒感染后也可誘導(dǎo)抗體反應(yīng)，表明流感病毒可不依賴于T細(xì)胞輔助抗體應(yīng)答，稱為T細(xì)胞非依賴性(TI)抗體應(yīng)答，該抗體通常只產(chǎn)生IgM型抗體，而且不發(fā)生抗體類別轉(zhuǎn)換，且無(wú)記憶反應(yīng)。進(jìn)一步研究表明，上述兩種抗體均能在一定程度上降低流感病毒感染動(dòng)物的死亡率，但TD抗體對(duì)機(jī)體的保護(hù)比TI抗體更有效時(shí)。Kostolansky等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)叫，小鼠自然感染AIV后，可引起強(qiáng)烈的抗HA2抗體應(yīng)答，表明AIV的HA2可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生清除病毒的抗體。本研究還發(fā)現(xiàn)

28、，21H齡SPF雛雞感染AIV后，其外周血液T淋巴細(xì)胞不但數(shù)量較對(duì)照雛雞顯著或極顯著減少，而且T淋巴細(xì)胞對(duì)ConA的增殖反應(yīng)于病毒感染后314d也明顯降低，表明AIV感染可顯著降低SPF雛雞外周血液的細(xì)胞免疫功能。王穎彥等報(bào)道«,感染H5N1病毒小鼠血液中CD/T、CD/T、CD/T細(xì)胞數(shù)量下降，脾臟中T細(xì)胞數(shù)量下降趨勢(shì)與血液相同，AJV感染對(duì)T淋巴細(xì)胞數(shù)最影響較大，特別是CD。'淋巴細(xì)胞受損害更為明顯°另有研究發(fā)現(xiàn)時(shí)，在AIV感染急性期T、B淋巴細(xì)胞數(shù)量均減少，但不改變CD；與CD/T細(xì)胞比率，T淋巴細(xì)胞對(duì)PHA和ConA的應(yīng)答降低，表明AIV可抑制細(xì)胞免疫功能。

29、雞、雉雞人工或自然感染高致病性禽流感病毒后，其胸腺、法氏囊和脾臟等器官均呈現(xiàn)壞死性炎咋吐由于病毒感染使免疫器官發(fā)生變性、壞死，不但導(dǎo)致淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而且淋巴細(xì)胞對(duì)有絲分裂原的應(yīng)答功能也顯著降低。本項(xiàng)目的另一部分研究也發(fā)現(xiàn)網(wǎng)，AIV感染SPF雛雞后，其胸腺、法氏囊和脾臟等免疫器官的T、B淋巴細(xì)胞對(duì)ConA或PMA的增殖反應(yīng)在一定時(shí)間內(nèi)明顯下降，但兩者的程度并不相同，其中T淋巴細(xì)胞對(duì)有絲分裂原的反應(yīng)性較B淋巴細(xì)胞降低尤為明顯。AIV感染SPF線雞后，其外周血液的細(xì)胞免疫和體液免疫功能下降是機(jī)體免疫器官免疫功能低下的外在表現(xiàn)，而免疫器官免疫功能的減弱或喪失是外周血液免疫功能改變的基礎(chǔ)或根源。

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