釀酒酵母不對稱遺傳分析(設(shè)計)

1、釀酒酵母不對稱遺傳分析原理在酵母細胞出芽過程中,細胞衰老造成的損傷在母細胞和子細胞之間的分配是不對稱的,絕大部分損傷被母細胞所保留。然而,這種不對稱遺傳也不總是這樣,在母細胞衰老到達一定程度時,它所產(chǎn)生的子細胞將不可避免地帶有母細胞的部分衰老物質(zhì)。釀酒酵母很早就被當(dāng)做研究衰老的模式生物,早在1989年,Egilmez和Jazwinski就提出了“細胞質(zhì)衰老因子”假說。1997年,Sinclair等人提出了酵母復(fù)制衰老的ERC積累學(xué)說,認為染色體外rDNA環(huán)ERC可能就是“細胞質(zhì)衰老因子”。釀酒酵母rDNA座占整個基因組的10%,由編碼rRNA的9.1kb重復(fù)單元串聯(lián)重復(fù)100200個拷貝組成,

2、定位于染色體。ERC可以通過胞內(nèi)DNA加工系統(tǒng)的作用,由串聯(lián)重復(fù)的rDNA經(jīng)同源重組從基因組中切出。而ERC具有自身ARS(autonomously replicating sequence,能在每一次S期復(fù)制1次,而在母細胞內(nèi)呈指數(shù)型增長。同時由于酵母細胞出芽分裂的不對稱遺傳,ERC在分裂時保留在母細胞中而不進入子細胞,從而使母細胞中大量積累ERCs。但隨著母細胞持續(xù)地衰老,這種不對稱遺傳將無法維持下去,最終極度衰老的母細胞產(chǎn)生的子細胞中也將不可避免地帶有ERCs。本實驗將通過培養(yǎng)釀酒酵母,分離檢測ERCs,對比不同代數(shù)母細胞產(chǎn)生的子細胞及衰老母細胞中ERCs的含量,驗證釀酒酵母的不對稱遺傳

3、。注:關(guān)于ERCs的不對稱遺傳的機制,Shcheprova等人提出了一種氯芐乙胺依賴的細胞核擴散屏障,它阻礙了母細胞核孔通向子細胞的通道。而環(huán)形DNA分子,比如ERCs,缺乏一種著絲粒序列而無法通過該屏障,最終被留在了母細胞中。盡管ERCs如何造成酵母細胞衰老的機制尚未明確,但很多假說已被提出。一種猜測是, ERCs會與那些在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄過程中起重要作用的因子發(fā)生物理上的相互作用,從而使它們無法行使正常的功能。另一種可能性是,過多的ERCs導(dǎo)致了rRNA和核糖體蛋白之間數(shù)量的不平衡,進一步削弱了核糖體其本身的功能。而Ganley等人的研究則認為,ERCs通過誘導(dǎo)rDNA使其不穩(wěn)定性限制了酵母細胞

4、的RLS(復(fù)制型壽命,并且,他們認為這正是衰老的最根本的原因。材料釀酒酵母細胞培養(yǎng)基1(單位均為g:葡萄糖25、酵母浸粉2、(NH42SO42、KH2PO45、MgSO47H2O0.4、CaCl20.2、1000ml蒸餾水培養(yǎng)基2(單位均為g:葡萄糖10、酵母浸粉2、(NH42SO42、KH2PO45、MgSO47H2O0.4、CaCl20.2、1000ml蒸餾水儀器與試劑1.儀器恒溫搖床,高速離心機,振蕩器,電泳儀,電泳槽,透視式紫外分析儀(或凝膠成像儀,離心管,搖瓶2.試劑蔗糖、酵母質(zhì)粒小提試劑盒中相關(guān)試劑(北京莊盟國際生物基因科技有限公司,也可采用其他公司試劑盒,那樣步驟中數(shù)值可能要作改

5、變、瓊脂糖、溴化乙錠等操作程序1.酵母細胞的培養(yǎng)與分離(1活化:取適量酵母菌體,接入培養(yǎng)基1的搖瓶中,于30在150r/min搖床中培養(yǎng)24h,菌體密度約為4×107個/ml。(2蔗糖梯度制備:于15ml(內(nèi)徑1.4cm,長11cm離心管中自上而下鋪加40%蔗糖溶液1.5ml,再加20%、10%及2%的蔗糖溶液各3ml制成不連續(xù)梯度。(3離心篩選:收集菌液,在800g離心力下離心5min,收集菌體重懸于1.5ml無菌水中。將菌體鋪在蔗糖梯度溶液頂層,60g離心5min,收集最上層清液(約占總體積5%10%,得到的為剛脫離母體的芽殖細胞。(4同步培養(yǎng):將得到的菌液轉(zhuǎn)入50ml培養(yǎng)基2搖

6、瓶,30下150r/min搖床中培養(yǎng)。2.ERCs的提取(參照部分質(zhì)粒提取操作,部分地方改動以適應(yīng)ERCs的提取(1取1-5 ml 酵母培養(yǎng)物(不超過5×107 酵母細胞,12,000 rpm (13,400×g 離心1分鐘,盡量吸除上清(菌液較多時可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中。(2酵母細胞壁的破除:酶法:向菌體中加入300 l Lytic ase buffer,充分混勻,并在搖床上220rpm/min,30處理1 小時。4000 rpm(1500×g離心10 鐘,棄上清,收集沉淀。加入250l 溶液1(請先檢查是否已加入RNaseA重懸沉淀。注意

7、:根據(jù)酵母菌株和酵母細胞數(shù)量的不同,所用Lyticase buffer 的濃度和孵育時間應(yīng)該進行適當(dāng)調(diào)整。(3向管中加入250 l 溶液2,上下翻轉(zhuǎn)68 次使菌體充分混勻,室溫放置5-10 分鐘。注意:混勻,略微用力。此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠。(4向管中加入350 l 溶液3,略微用力上下翻轉(zhuǎn)68 次,充分混勻,此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。9,000 rpm (13,400×g 離心15 分鐘。注意:溶液3 加入后應(yīng)立即混合,避免產(chǎn)生局部沉淀。(5小心地將上清液加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中,9,000 rpm (13,400×g 離心1 分鐘,倒掉廢液,將吸附柱放入收集管中。

8、(6向吸附柱中加入500 l 去蛋白液W1,12,000 rpm (13,400×g 離心1 分鐘,倒掉廢液。(7向吸附柱中加入600 l 漂洗液W2(請先檢查是否已加入無水乙醇,12,000 rpm(13,400×g 離心1 分鐘,倒掉廢液,將吸附柱放入收集管中。重復(fù)此步聚一次。(8將吸附柱放入收集管中置于12,000 rpm (13,400×g 離心2 分鐘,目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。(9將吸附柱置于一個干凈的離心管中,向吸附膜的中間部位滴加50100 l 洗脫緩沖液TE,室溫放置2 分鐘,12,000 rpm (13,400×g 離心2 分

9、鐘將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。3.實際步驟順序(1進行操作1酵母細胞的培養(yǎng)與分離。(2取第0代細胞,即同步培養(yǎng)0h的細胞,提取ERCs,電泳并紫外檢測(具體步驟不再贅述。(324h后,取菌液進行步驟1(3離心篩選,取上清液和下層液體,分別提取ERCs,電泳并紫外檢測。(448h后(可略提前,取菌液進行步驟1(3離心篩選,取上清液和下層液體,分別提取ERCs,電泳并紫外檢測。結(jié)果預(yù)測與分析1.0h:檢測不到正常條帶,因為此時出芽細胞中不帶有ERCs,且酵母本身質(zhì)粒拷貝數(shù)較低,無PCR基本難以檢測,所以應(yīng)該不會出現(xiàn)固定位置的明顯條帶。2.24h:上清液中為出芽細胞,若以酵母代時2h計算,此時經(jīng)過12

10、代,還未足夠衰老,ERCs不會進入所出芽體中(詳細見原理,所以也不會出現(xiàn)固定位置的明顯條帶。下層液體中為已經(jīng)一定程度衰老的細胞,產(chǎn)生ERCs,所以應(yīng)該出現(xiàn)9kb左右條帶,考慮超螺旋,應(yīng)該顯示小于9kb,但由于衰老程度不高,可能難以檢測出,條帶不夠明顯。3.48h:上清液中的出芽細胞為高度衰老的酵母細胞產(chǎn)生,將會帶有部分ERCs,可能出現(xiàn)9kb左右條帶,考慮超螺旋,應(yīng)該顯示小于9kb,但因為量不是很多,條帶可能不夠明顯。下層液體中大多為高度衰老的細胞,含有大量ERCs,應(yīng)該會檢測出比較明顯的略小于9kb的條帶。實驗失敗分析與建議以上實驗結(jié)果為比較理想狀況,但實際可能會出現(xiàn)一些問題。1.酵母本身質(zhì)

11、粒對結(jié)果影響有多大,具體不是很清楚,如果酵母量較大可能會出現(xiàn)6kb左右條帶。2.此次電泳條帶分子量較大,所選marker也要相應(yīng)改變,而且要延長電泳時間或提高電泳電壓。3.根據(jù)理想狀況,酵母代時2h,25代為極度衰老狀態(tài),所以我估計24h為中度衰老,48h(也就是24代為高度衰老,但實際代時可能并不是這樣,若提前衰老則可能死亡后ERCs進入上清液,則24h和48h的上清結(jié)果會受影響,若代時比2h長,則可能出現(xiàn)衰老程度不夠,ERCs積累量不足的情況,使檢測結(jié)果受到影響。所以時間可能要根據(jù)實際情況做相應(yīng)調(diào)整。4.由于ERCs是環(huán)狀DNA而且只是比質(zhì)粒略大,因此提取方法參考了質(zhì)粒提取,實際情況可能會有些不同,雖然已經(jīng)對數(shù)值及操作細節(jié)做了改動。5.雖然ERCs最終是在酵母細胞中大量積累,但究竟能提取多少,顯示情況如何我也不是很清楚。如果量不足,可能要進行PCR再檢測,那樣實驗復(fù)雜程度會進一步增加,可以考慮改編成一系列實驗。6.衰老細胞雖然是處于下層液體中,但具體在什么位置不是很清楚,可能需要進一步實驗摸索,來確定所取下層液體合適的