蛋白純化的基本思路

1、蛋白質(zhì)的提取和純化-選擇分離材料及預處理 蛋白質(zhì)的提取和純化-選擇分離材料及預處理以蛋白質(zhì)和結構與功能為基礎，從分子水平上認識生命現(xiàn)象，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學發(fā)展的主要方向，研究蛋白質(zhì)，首先要得到高度純化并具有生物活性的目的物質(zhì)。蛋白質(zhì)的制備工作涉及物理、化學和生物等各方面知識，但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配到可用機械方法分離的兩個或幾個物相中，如鹽析，有機溶劑提取，層析和結晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于來同區(qū)域而達到分 離目的，如電泳，超速離心，超濾等。在所有這些方法的應用中必須注意保存生物大分子的完整性，防 止酸、磴

2、、高溫，劇烈機械作用而導致所提物質(zhì)生物活性的喪失。蛋白質(zhì)的制備一般分為以下四個階段：選擇材料和預處理，細胞的破碎及細胞器的分離，提取和純化，濃細、干燥和保存。微生物、植物和動物都可做為制備蛋白質(zhì)的原材料，所選用的材料主要依據(jù)實驗目的來確定。對于微生物，應注意它的生長期，在微生物的對數(shù)生長期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產(chǎn)量，以微生物為材料時有兩種情況：（1）得用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代產(chǎn)物和胞外酶等；（2）利用菌體含有的生化物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸和胞酶等。植物材料必須經(jīng)過去殼，脫脂并注意植物品種和生長發(fā)育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節(jié)性關系密切。對動物組織，必須選擇有

3、效成份含量豐富的臟器組織為原材料，先進行絞碎、脫脂等處理。另外，對預處理好的材料，若不立即進行實驗，應冷凍保存，對于易分解的生物大分子應選用新鮮材料制備。細胞的破碎1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動開關后，逐步加速至所需速度。此法適用于動物臟組織、植物肉質(zhì)種子等。2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此 法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用于量少和動物臟器組織。3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常

4、選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鐘，此法的缺點是在處理過程會產(chǎn)生大量的熱，應采取相應降溫措施。對超聲波敏感和核酸應慎用。4、反復凍融法：將細胞在 -20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由于細胞冰粒形成和剩余細胞液的鹽 濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。5、化學處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；

5、加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。蛋白質(zhì)的分離純化一，蛋白質(zhì)（包括酶）的提取大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數(shù)與脂類結合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中，因些，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。（一）水溶液提取法稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而 定。一方面，多

6、數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度升高會使蛋白質(zhì)變性失活，因此，基于這一點考慮提取蛋白質(zhì)和酶時一般采用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質(zhì)提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘 乙酸等）。下面著重討論提取液的 pH值和鹽濃度的選擇。1、pH 值蛋白質(zhì)，酶是具有等電點的兩性電解質(zhì)，提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH圍。用稀酸或稀堿提取時，應防止過酸或過堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團發(fā)生變化，從而導致蛋白質(zhì)構象的不可逆變化，一般來說，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液。2、鹽濃度稀濃度可促進

7、蛋白質(zhì)的溶，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結合，具有保護蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以 0.15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常采用0.02-0.05M 磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。（二）有機溶劑提取法一些和脂質(zhì)結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強的親脂性、是理想的提脂 蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質(zhì)結合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別優(yōu)越，一是因為丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親水性，在溶解度圍（度為1

8、0% 40度為6.6%）不會引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇圍較廣，也適用于動植物及微生物材料。二、蛋白質(zhì)的分離純化通常在做純化前對自己的目標物質(zhì)特性了解越多對純化將會越有利，如果不太了解，也可以通過電泳知道目標物質(zhì) 和雜質(zhì)的情況，找到一種簡單的鑒定方法，此外在純化前必須先建立可靠的活性測定的方法。如果是未知的蛋白， 那么通?？梢杂袔追N簡單的摸索：1 .凝膠過濾色譜。這個方法很常用，但是效率不高，對低濃度的樣品沒有富集作用，上樣量小。2 .離子交換色譜。此法很常用，但是樣品必須沒有高濃度的鹽。3 .疏水色譜。此法較好，它分離效率高，上樣量大，特別適合分離鹽析沉淀的樣品。4 .

9、親和色譜。是最有效的手段，關鍵了解目標物質(zhì)的特性以便選擇合適的親和色譜填料。蛋白質(zhì)的分離純化方法很多，主要有：（一）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法1、蛋白質(zhì)的鹽析中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續(xù)升高時，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸鏤的SO4和NH4）有很強的水化力， 可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之 失水”，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結并沉淀析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，

10、因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。（2） pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來（共沉現(xiàn)象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸鏤、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應用最多的硫酸鏤，

11、它的優(yōu)點是溫度系數(shù)小而溶解度大（25度時飽和溶液為 4.1M,即767克/升；0度時飽和溶解度為3.9M,即676克/升），在這一溶解度圍，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來；另外硫酸鏤分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸鏤溶液的pH常在4.5-5.5之間，當用其他 pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋（常用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。2、等電點沉淀法蛋白

12、質(zhì)在靜電狀態(tài)時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的 pH達到某一蛋白質(zhì)的等電點使之沉淀，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。3、低溫有機溶劑沉淀法用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應在低溫下進行。（二）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法1、透析與超濾透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開。超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質(zhì)分子通過半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。2、凝膠過濾法也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根

13、據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex gel ）和瓊脂糖凝膠（agarose gel ）。（三）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進行分離蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同，可將其分開。1、電泳法各種蛋白質(zhì)在同一 pH條件下，因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體，電泳時兩性電解質(zhì)形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度，當帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動時，到達各自等電點的pH位置就停止，此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。2、離子交換層析法離子交換劑有陽離子交換劑（如：竣甲基

14、纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE等，當被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。（四）根據(jù)配體特異性的分離方法-親和色譜法親和層析法(affinity chromatography )是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法，它經(jīng)常只需經(jīng)過一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體(Ligand )的分子能特異而非共價地結合。其基本原理：蛋白質(zhì)在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類

15、型的細胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的分離(Separation ),提純(Purification )和鑒定(Characterization )是生物化學中的重要的一部分，至今還 沒的單獨或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來，因此往往采取幾種 方法聯(lián)合使用。蛋白質(zhì)的濃縮、干燥及保存一、樣品的濃縮生物大分子在制備過程中由于過柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法的：1、減壓加溫蒸發(fā)濃縮通過降低液面壓力使液體沸點降低，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發(fā)愈快，此法適用 于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。2、空氣流動蒸發(fā)

16、濃縮空氣的流動可使液體加速蒸發(fā)，鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流；或?qū)⑸锎蠓肿尤芤貉b入透析袋置于冷室，用電扇對準吹風，使透過膜外的溶劑不斷蒸發(fā)，而達到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適于大量溶液的濃縮。3、冰凍法生物大分子在低溫結成冰，鹽類及生物大分子不進入冰而留在液相中，操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然后緩慢地融解，利用溶劑與溶質(zhì)融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質(zhì)和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質(zhì)和酶的純冰結晶浮于液面，蛋白質(zhì)和酶則集中于下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質(zhì)和酶的濃縮液。4、吸收法通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不

17、起化學反應，對生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀比咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里，外加聚乙二醇復蓋置于4度下，袋溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和后要更換新的直至達到所需要的體積。5、超濾法超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質(zhì)分子進行選擇性過濾的方法，液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留，這是近年來發(fā)展起來的新方法，最適 于生物大分子尤其是蛋白質(zhì)和酶的濃縮或脫鹽，并具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生 物大分子的活性，回收率高等優(yōu)點。應用超濾法關鍵在于

18、膜的選擇，不同類型和規(guī)格的膜，水的流速， 分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數(shù)均不同，必須根據(jù)工作需要來選用。另 外，超濾裝置形式，溶質(zhì)成份及性質(zhì)、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。用超濾膜制成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束，管的兩端與低離子強度的緩沖液相連，使緩沖液不斷地在管中流動。然后將纖維管浸入待透析的蛋白質(zhì)溶液中。當緩沖液流過纖維管時，則小 分子很易透過膜而擴散，大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法，由于透析面積增大，因而使透析時間 縮短10倍。二、干燥生物大分子制備得到產(chǎn)品，為防止變質(zhì)，易于保存，常需要干燥處理，最常用的方法是冷凍干燥和 真空干燥。真空干燥適用于不耐高溫，易于氧化物質(zhì)的干燥和保存，整個裝置包括干燥器、冷凝器及真 空干燥原理外，同時增加了溫度因素。在相同壓力下，水蒸汽壓隨溫度下降而下降，故在低溫低壓下， 冰很易升華為氣體。操作時一般先將待干燥的液體冷凍到冰點以下使之變成固體，然后在低溫低壓下將 溶劑變成氣體而除去。此法干后的產(chǎn)品具有疏松、溶解度好、保持天然結構等優(yōu)點，適用于各類生物大 分子的干燥保存。三、貯存生物大分子的穩(wěn)定性與保存方法的很大關系。干燥的制品一般比較穩(wěn)定，在