蛋白純化的基本思路_第1頁
蛋白純化的基本思路_第2頁
蛋白純化的基本思路_第3頁
蛋白純化的基本思路_第4頁
蛋白純化的基本思路_第5頁
免費預覽已結束,剩余1頁可下載查看

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、蛋白質(zhì)的提取和純化-選擇分離材料及預處理 蛋白質(zhì)的提取和純化-選擇分離材料及預處理以蛋白質(zhì)和結構與功能為基礎,從分子水平上認識生命現(xiàn)象,已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學發(fā)展的主要方向,研究蛋白質(zhì),首先要得到高度純化并具有生物活性的目的物質(zhì)。蛋白質(zhì)的制備工作涉及物理、化學和生物等各方面知識,但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個組分分配率的差別,把它們分配到可用機械方法分離的兩個或幾個物相中,如鹽析,有機溶劑提取,層析和結晶等;二是將混合物置于單一物相中,通過物理力場的作用使各組分分配于來同區(qū)域而達到分 離目的,如電泳,超速離心,超濾等。在所有這些方法的應用中必須注意保存生物大分子的完整性,防 止酸、磴

2、、高溫,劇烈機械作用而導致所提物質(zhì)生物活性的喪失。蛋白質(zhì)的制備一般分為以下四個階段:選擇材料和預處理,細胞的破碎及細胞器的分離,提取和純化,濃細、干燥和保存。微生物、植物和動物都可做為制備蛋白質(zhì)的原材料,所選用的材料主要依據(jù)實驗目的來確定。對于微生物,應注意它的生長期,在微生物的對數(shù)生長期,酶和核酸的含量較高,可以獲得高產(chǎn)量,以微生物為材料時有兩種情況:(1)得用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代產(chǎn)物和胞外酶等;(2)利用菌體含有的生化物質(zhì),如蛋白質(zhì)、核酸和胞酶等。植物材料必須經(jīng)過去殼,脫脂并注意植物品種和生長發(fā)育狀況不同,其中所含生物大分子的量變化很大,另外與季節(jié)性關系密切。對動物組織,必須選擇有

3、效成份含量豐富的臟器組織為原材料,先進行絞碎、脫脂等處理。另外,對預處理好的材料,若不立即進行實驗,應冷凍保存,對于易分解的生物大分子應選用新鮮材料制備。細胞的破碎1、高速組織搗碎:將材料配成稀糊狀液,放置于筒約1/3體積,蓋緊筒蓋,將調(diào)速器先撥至最慢處,開動開關后,逐步加速至所需速度。此法適用于動物臟組織、植物肉質(zhì)種子等。2、玻璃勻漿器勻漿:先將剪碎的組織置于管中,再套入研桿來回研磨,上下移動,即可將細胞研碎,此 法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高,適用于量少和動物臟器組織。3、超聲波處理法:用一定功率的超聲波處理細胞懸液,使細胞急劇震蕩破裂,此法多適用于微生物材料,用大腸桿菌制備各種酶,常

4、選用50-100毫克菌體/毫升濃度,在1KG至10KG頻率下處理10-15分鐘,此法的缺點是在處理過程會產(chǎn)生大量的熱,應采取相應降溫措施。對超聲波敏感和核酸應慎用。4、反復凍融法:將細胞在 -20度以下冰凍,室溫融解,反復幾次,由于細胞冰粒形成和剩余細胞液的鹽 濃度增高引起溶脹,使細胞結構破碎。5、化學處理法:有些動物細胞,例如腫瘤細胞可采用十二烷基磺酸鈉(SDS)、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞,細菌細胞壁較厚,可采用溶菌酶處理效果更好。無論用哪一種方法破碎組織細胞,都會使細胞蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中,使大分子生物降解,導致天然物質(zhì)量的減少,加入二異丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或減慢自溶作用;

5、加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,加入苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酥活力,但不是全部,還可通過選擇pH、溫度或離子強度等,使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。蛋白質(zhì)的分離純化一,蛋白質(zhì)(包括酶)的提取大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液,少數(shù)與脂類結合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中,因些,可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。(一)水溶液提取法稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑,通常用量是原材料體積的1-5倍,提取時需要均勻的攪拌,以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而 定。一方面,多

6、數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大,因此,溫度高利于溶解,縮短提取時間。但另一方面,溫度升高會使蛋白質(zhì)變性失活,因此,基于這一點考慮提取蛋白質(zhì)和酶時一般采用低溫(5度以下)操作。為了避免蛋白質(zhì)提以過程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制劑(如二異丙基氟磷酸,碘 乙酸等)。下面著重討論提取液的 pH值和鹽濃度的選擇。1、pH 值蛋白質(zhì),酶是具有等電點的兩性電解質(zhì),提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH圍。用稀酸或稀堿提取時,應防止過酸或過堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團發(fā)生變化,從而導致蛋白質(zhì)構象的不可逆變化,一般來說,堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液。2、鹽濃度稀濃度可促進

7、蛋白質(zhì)的溶,稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結合,具有保護蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點,因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽,一般以 0.15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常采用0.02-0.05M 磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。(二)有機溶劑提取法一些和脂質(zhì)結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質(zhì)和酶,不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑,它們具的一定的親水性,還有較強的親脂性、是理想的提脂 蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質(zhì)結合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別優(yōu)越,一是因為丁醇親脂性強,特別是溶解磷脂的能力強;二是丁醇兼具親水性,在溶解度圍(度為1

8、0% 40度為6.6%)不會引起酶的變性失活。另外,丁醇提取法的pH及溫度選擇圍較廣,也適用于動植物及微生物材料。二、蛋白質(zhì)的分離純化通常在做純化前對自己的目標物質(zhì)特性了解越多對純化將會越有利,如果不太了解,也可以通過電泳知道目標物質(zhì) 和雜質(zhì)的情況,找到一種簡單的鑒定方法,此外在純化前必須先建立可靠的活性測定的方法。如果是未知的蛋白, 那么通??梢杂袔追N簡單的摸索:1 .凝膠過濾色譜。這個方法很常用,但是效率不高,對低濃度的樣品沒有富集作用,上樣量小。2 .離子交換色譜。此法很常用,但是樣品必須沒有高濃度的鹽。3 .疏水色譜。此法較好,它分離效率高,上樣量大,特別適合分離鹽析沉淀的樣品。4 .

9、親和色譜。是最有效的手段,關鍵了解目標物質(zhì)的特性以便選擇合適的親和色譜填料。蛋白質(zhì)的分離純化方法很多,主要有:(一)根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法1、蛋白質(zhì)的鹽析中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響,一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高,蛋白質(zhì)的溶解度增加,此稱鹽溶;當鹽濃度繼續(xù)升高時,蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出,這種現(xiàn)象稱鹽析,將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中,高濃度的鹽離子(如硫酸鏤的SO4和NH4)有很強的水化力, 可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層,使之 失水”,于是蛋白質(zhì)膠粒凝結并沉淀析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同,故鹽析所需的鹽濃度也不一樣,

10、因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。影響鹽析的因素有:(1)溫度:除對溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫(4度)操作外,一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)(如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白)在較高的溫度(25度)比0度時溶解度低,更容易鹽析。(2) pH值:大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。(3)蛋白質(zhì)濃度:蛋白質(zhì)濃度高時,欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來(共沉現(xiàn)象)。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋,使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽,主要有硫酸鏤、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應用最多的硫酸鏤,

11、它的優(yōu)點是溫度系數(shù)小而溶解度大(25度時飽和溶液為 4.1M,即767克/升;0度時飽和溶解度為3.9M,即676克/升),在這一溶解度圍,許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來;另外硫酸鏤分段鹽析效果也比其他鹽好,不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸鏤溶液的pH常在4.5-5.5之間,當用其他 pH值進行鹽析時,需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后,需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去,常用的辦法是透析,即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋(常用的是玻璃紙),用緩沖液進行透析,并不斷的更換緩沖液,因透析所需時間較長,所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽,所用的時間就比較短。2、等電點沉淀法蛋白

12、質(zhì)在靜電狀態(tài)時顆粒之間的靜電斥力最小,因而溶解度也最小,各種蛋白質(zhì)的等電點有差別,可利用調(diào)節(jié)溶液的 pH達到某一蛋白質(zhì)的等電點使之沉淀,但此法很少單獨使用,可與鹽析法結合用。3、低溫有機溶劑沉淀法用與水可混溶的有機溶劑,甲醇,乙醇或丙酮,可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出,此法分辨力比鹽析高,但蛋白質(zhì)較易變性,應在低溫下進行。(二)根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法1、透析與超濾透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開。超濾法是利用高壓力或離心力,強使水和其他小的溶質(zhì)分子通過半透膜,而蛋白質(zhì)留在膜上,可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。2、凝膠過濾法也稱分子排阻層析或分子篩層析,這是根

13、據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠(Sephadex gel )和瓊脂糖凝膠(agarose gel )。(三)根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進行分離蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同,可將其分開。1、電泳法各種蛋白質(zhì)在同一 pH條件下,因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳,這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體,電泳時兩性電解質(zhì)形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度,當帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動時,到達各自等電點的pH位置就停止,此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。2、離子交換層析法離子交換劑有陽離子交換劑(如:竣甲基

14、纖維素;CM-纖維素)和陰離子交換劑(二乙氨基乙基纖維素;DEAE等,當被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時,帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上,隨后用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。(四)根據(jù)配體特異性的分離方法-親和色譜法親和層析法(affinity chromatography )是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法,它經(jīng)常只需經(jīng)過一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來,而且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體(Ligand )的分子能特異而非共價地結合。其基本原理:蛋白質(zhì)在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在,每種類

15、型的細胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì),因此蛋白質(zhì)的分離(Separation ),提純(Purification )和鑒定(Characterization )是生物化學中的重要的一部分,至今還 沒的單獨或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來,因此往往采取幾種 方法聯(lián)合使用。蛋白質(zhì)的濃縮、干燥及保存一、樣品的濃縮生物大分子在制備過程中由于過柱純化而樣品變得很稀,為了保存和鑒定的目的,往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法的:1、減壓加溫蒸發(fā)濃縮通過降低液面壓力使液體沸點降低,減壓的真空度愈高,液體沸點降得愈低,蒸發(fā)愈快,此法適用 于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。2、空氣流動蒸發(fā)

16、濃縮空氣的流動可使液體加速蒸發(fā),鋪成薄層的溶液,表面不斷通過空氣流;或?qū)⑸锎蠓肿尤芤貉b入透析袋置于冷室,用電扇對準吹風,使透過膜外的溶劑不斷蒸發(fā),而達到濃縮目的,此法濃縮速度慢,不適于大量溶液的濃縮。3、冰凍法生物大分子在低溫結成冰,鹽類及生物大分子不進入冰而留在液相中,操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體,然后緩慢地融解,利用溶劑與溶質(zhì)融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質(zhì)和酶的鹽溶液用此法濃縮時,不含蛋白質(zhì)和酶的純冰結晶浮于液面,蛋白質(zhì)和酶則集中于下層溶液中,移去上層冰塊,可得蛋白質(zhì)和酶的濃縮液。4、吸收法通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不

17、起化學反應,對生物大分子不吸附,易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇,聚乙稀比咯酮、蔗糖和凝膠等,使用聚乙二醇吸收劑時,先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里,外加聚乙二醇復蓋置于4度下,袋溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去,聚乙二醇被水飽和后要更換新的直至達到所需要的體積。5、超濾法超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質(zhì)分子進行選擇性過濾的方法,液體在一定壓力下(氮氣壓或真空泵壓)通過膜時,溶劑和小分子透過,大分子受阻保留,這是近年來發(fā)展起來的新方法,最適 于生物大分子尤其是蛋白質(zhì)和酶的濃縮或脫鹽,并具有成本低,操作方便,條件溫和,能較好地保持生 物大分子的活性,回收率高等優(yōu)點。應用超濾法關鍵在于

18、膜的選擇,不同類型和規(guī)格的膜,水的流速, 分子量截止值(即大體上能被膜保留分子最小分子量值)等參數(shù)均不同,必須根據(jù)工作需要來選用。另 外,超濾裝置形式,溶質(zhì)成份及性質(zhì)、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。用超濾膜制成空心的纖維管,將很多根這樣的管攏成一束,管的兩端與低離子強度的緩沖液相連,使緩沖液不斷地在管中流動。然后將纖維管浸入待透析的蛋白質(zhì)溶液中。當緩沖液流過纖維管時,則小 分子很易透過膜而擴散,大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法,由于透析面積增大,因而使透析時間 縮短10倍。二、干燥生物大分子制備得到產(chǎn)品,為防止變質(zhì),易于保存,常需要干燥處理,最常用的方法是冷凍干燥和 真空干燥。真空干燥適用于不耐高溫,易于氧化物質(zhì)的干燥和保存,整個裝置包括干燥器、冷凝器及真 空干燥原理外,同時增加了溫度因素。在相同壓力下,水蒸汽壓隨溫度下降而下降,故在低溫低壓下, 冰很易升華為氣體。操作時一般先將待干燥的液體冷凍到冰點以下使之變成固體,然后在低溫低壓下將 溶劑變成氣體而除去。此法干后的產(chǎn)品具有疏松、溶解度好、保持天然結構等優(yōu)點,適用于各類生物大 分子的干燥保存。三、貯存生物大分子的穩(wěn)定性與保存方法的很大關系。干燥的制品一般比較穩(wěn)定,在

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論