血小板二磷酸腺苷受體研究的進(jìn)展

1、血小板二磷酸腺苷受體研究的進(jìn)展    血小板聚集在止血與血栓形成中具有關(guān)鍵的作用，多種物質(zhì)都可以通過各自特異性受體引起血小板的活化與聚集。目前已發(fā)現(xiàn)了四十多種血小板受體，其中絕大多數(shù)的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)都已闡明1。二磷酸腺苷(ADP)是人們發(fā)現(xiàn)最早、也是體內(nèi)最重要的誘導(dǎo)血小板聚集的物質(zhì)。在體外實(shí)驗(yàn)中可觀察到ADP誘導(dǎo)的兩種血小板聚集類型。低劑量ADP引起較弱的、可逆性聚集，不伴有釋放反應(yīng)；高劑量ADP引起較強(qiáng)的、不可逆性聚集，同時(shí)有顆粒成分的釋放。由于ADP易被磷酸酶破壞，目前還缺乏特異的ADP受體的配體及抗ADP受體單克隆抗體，血小板表面ADP受體數(shù)量較少以及

2、血小板是無核細(xì)胞等原因，在技術(shù)上很難研究ADP受體的特性，人血小板ADP受體一直未能鑒定或純化。近年來由于配體-受體研究的開展，臨床上先天性血小板ADP受體缺陷性疾病的發(fā)現(xiàn)，抗血小板ADP受體藥物的應(yīng)用，以及分子生物學(xué)的進(jìn)步，血小板ADP受體的性質(zhì)、功能與結(jié)構(gòu)已基本闡明，這已成為當(dāng)前病理生理、血栓與止血以及藥理學(xué)研究的一個(gè)重要進(jìn)展。 1血小板ADP配體-受體的研究ADP受體屬嘌呤類受體（P2受體），在機(jī)體廣泛存在，參與調(diào)節(jié)血小板聚集、血管張力、心臟收縮、中樞與外周神經(jīng)傳導(dǎo)以及細(xì)胞分裂等多種生理病理反應(yīng)。多數(shù)嘌呤類受體的基因已克隆，分子結(jié)構(gòu)已基本闡明。嘌呤類受體按結(jié)構(gòu)可分為P2X與P2Y兩種類型

3、，目前已發(fā)現(xiàn)了7種P2X的亞型與11種P2Y的亞型2。人們已合成了數(shù)十種腺嘌呤核苷酸類似物，由于分子中取代的基團(tuán)及其結(jié)構(gòu)的不同，它們對(duì)血小板ADP受體的結(jié)合特性與能力也不同。一部分表現(xiàn)為受體激動(dòng)劑，而另一部分表現(xiàn)為受體拮抗劑，主要作用于P2X嘌呤受體。用33P標(biāo)記的2-MeS-ADP測定，每個(gè)血小板表面有600個(gè)高親和性結(jié)合位點(diǎn)（kd=5nmol/L）3。2-MeS-ADP具有剌激ADP受體的作用。其誘導(dǎo)血小板聚集的能力比ADP強(qiáng)5倍，特別是對(duì)活化的腺苷酸環(huán)化酶的抑制能力要比ADP強(qiáng)200倍。-亞甲基-5-三磷酸腺苷也是P2X受體激動(dòng)劑，但不引起血小板變形。另一方面，ADP的異構(gòu)物2，5-二磷

4、酸腺苷（A2P5P）及3，5-二磷酸腺苷（A3P5P）是P2Y1受體的抑制劑，能抑制ADP誘導(dǎo)的血小板變形和聚集，抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+移動(dòng)，但不影響ADP對(duì)腺苷酸環(huán)化酶的抑制。其它P2Y1受體抑制劑ATP與其人工合成的類似物Sp-ATPS以及一種ADP衍生物ARL66096也抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，抑制細(xì)胞內(nèi)鈣流，同時(shí)有激活腺苷酸環(huán)化酶的作用。這些配體已成為血小板ADP受體研究的有用工具。 2血小板ADP受體缺陷性疾病1992年Cattaneo等4首先報(bào)道一例先天性血小板功能異常的患者。其主要表現(xiàn)為ADP雖可引起血小板變形，但不能誘導(dǎo)血小板聚集與釋放，不能促進(jìn)125I標(biāo)記的纖維蛋白原或von

5、 willebrand因子結(jié)合于血小板表面，不能增高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，也不能抑制前列腺素E1引起的cAMP的升高。而患者血小板對(duì)高濃度的膠原或凝血酶的反應(yīng)正常。此外，凝血酶或蝰蛇毒加腎上腺素可引起正常的血塊退縮，但蝰蛇毒加ADP不能使血塊退縮。3H2-ADP與甲醛固定的血小板的結(jié)合減少。這些特點(diǎn)都表明患者血小板的ADP受體缺陷。以后Nurden等5也報(bào)道一例先天性出血患者。ADP可引起血小板變形，但不引起聚集；纖維蛋白原結(jié)合減少；不抑制腺苷酸環(huán)化酶活性。同時(shí)，3H2-MeS-ADP在血小板膜上的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)減少95%以上。一些新的病例或家系正陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，提示本病并非罕見?；颊叩母改付酁榻H婚配

6、，表明為常染色體隱性遺傳的特點(diǎn)。 3抗血小板ADP受體藥物噻恩并吡啶（thienopyridine）類藥物主要包括噻氯匹定及其類似物clopidogrel。這類藥物除對(duì)各種誘導(dǎo)劑引起的血小板聚集都有一定的抑制作用外，而對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集有完全與特異的抑制效果，能取消ADP誘導(dǎo)的一相聚集，這一點(diǎn)與阿司匹林及其它抗血小板藥物顯著不同。噻氯匹定類藥物能明顯延長出血時(shí)間，阻斷血小板纖維蛋白原受體的利用性，降低由前列腺素E1升高的細(xì)胞cAMP水平，但不能阻斷Ca2+經(jīng)血小板膜通道的內(nèi)流。長期以來，人們對(duì)噻氯匹定類藥物的作用機(jī)制一直未能了解。近年來人們在大鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，噻氯匹定類藥物使33P2-Me

7、S-ADP與血小板的結(jié)合數(shù)量減少70%。這種抑制是非競爭性的，進(jìn)一步增加藥物的劑量也不能取消另外30%受體與配體的結(jié)合。這些結(jié)果表明，在血小板表面可能存在著兩類ADP受體。一類受體與血小板變形以及Ca2+離子通道有關(guān)。另一類受體與G蛋白（主要是Gi蛋白 ）偶聯(lián)，影響細(xì)胞內(nèi)信息傳遞，從而降低了細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，促進(jìn)致密管道系統(tǒng)Ca2+流入胞漿與GPb-a復(fù)合物纖維蛋白原受體的暴露，并最終導(dǎo)致了血小板聚集。噻氯匹定類藥物主要是通過抑制第二類ADP受體發(fā)揮抗血小板作用6。噻氯匹定類藥物并不是血小板ADP受體拮抗劑，也不能抑制ADP受體的合成，可能是通過干擾ADP受體的功能發(fā)揮了抗血小板作用。 應(yīng)該

8、指出，噻氯匹定類藥物對(duì)血小板兩種ADP受體的藥理作用與上述嘌呤受體拮抗劑的作用并不完全相同。噻氯匹定類藥物與P2Y1受體抑制劑（如A2P5P和A3P5P）都分別對(duì)33P2-MeS-ADP與血小板ADP受體的結(jié)合有部分的抑制作用，只有在這兩類藥物共同作用時(shí)才能出現(xiàn)完全的抑制效果7。這種差異的機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。 4血小板ADP受體基因研究血小板是一種無核細(xì)胞，給基因研究帶來一定的困難。Vial等8從人血小板和培養(yǎng)的巨核細(xì)胞系（Meg-01，CHRF-288等）提取RNA，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增出P2X1的cDNA片段，并經(jīng)Southern印跡技術(shù)證實(shí)。這證明血小板內(nèi)和巨核細(xì)胞內(nèi)

9、有P2X1的mRNA存在，可以合成P2X1嘌呤受體。最近Sun等9從人血小板RNA克隆出完整的P2X1的cDNA。人血小板和某些巨核細(xì)胞系P2X1的mRNA全長為1.8?kb。將cDNA編碼區(qū)裝入載體后，轉(zhuǎn)染至無嘌呤受體的人星狀細(xì)胞瘤細(xì)胞。后者在ADP剌激下,細(xì)胞膜鈣通道開放，Ca2+從胞外流入胞內(nèi)。而P2X1受體特異性拮抗劑suramin與PPADS可以阻斷這一現(xiàn)象。用蛋白印跡技術(shù)與抗P2X1多克隆抗體在血小板與轉(zhuǎn)染的人星狀細(xì)胞瘤細(xì)胞均檢測到一條相對(duì)分子質(zhì)量為70×103的蛋白。這些結(jié)果充分證實(shí)，人血小板存在著P2X1嘌呤受體，其主要功能之一是調(diào)節(jié)血小板膜的鈣通道。另一方面，Leon等10按雞P2Y1的cDNA設(shè)計(jì)引物，用PCR方法從人內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增出一條片段，再以后者為探針，從人胎盤cDNA文庫中找P2Y1受體的cDNA。人的P2Y1受體cDNA有3?055?bp。其開放閱讀框架編碼一條由372個(gè)氨基酸殘基組成的多肽。有七個(gè)疏水的穿膜區(qū)。用