原發(fā)性肝癌患者外周血GPC-3mRNA的表達(dá)與微轉(zhuǎn)移的關(guān)系柏凱(一)

1、原發(fā)性肝癌患者外周血 GPC-3 mRNA勺表達(dá)與微轉(zhuǎn)移的關(guān)系柏凱(一)【摘要】目的探討原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC患者外周血的 Glypican-3(GPC-3 mRNA檢測用于診斷HCC早期微轉(zhuǎn)移的可行性。方法采用巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反響(RT-PCR技術(shù)檢測39例原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCQ、19 例肝炎和肝硬化、 10 例轉(zhuǎn)移性肝癌、 10 例肝血管瘤患者、 19 例健康獻(xiàn)血員外周血 GPC-3mRNA水平。結(jié)果HCC患者外周血中，GPC-3mRNA 的檢出率為62%(24/39),GPC-3mRNA勺檢出率與腫瘤直徑 77妝17/22)、 癌結(jié)節(jié)數(shù)目 67%(19/24)、臨床 TNM 分期 76

2、%(19/25)、門靜脈癌栓90%( 9/10)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 100%( 6/6 )等臨床參數(shù)密切相關(guān)。 GPC-3mRNA 在轉(zhuǎn)移性肝癌、肝炎和肝硬化、肝血管瘤患者及健康獻(xiàn)血員外周血中均未檢出。結(jié)論巢式RT-PCR僉測HCC患者外周血單核細(xì)胞 GPC-3mRNA 是一種早期發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝細(xì)胞癌血道播散的可靠而又敏感的實(shí)驗(yàn)方法?！娟P(guān)鍵詞】肝細(xì)胞癌；GPC-3巢式RT-PCF微轉(zhuǎn)移【 Abstract 】 ObjectiveToexplorethefeasibilityofGlypican-3 ( GPC-3) mRNAasamarkerofmi-crometastasisinperipheralb

3、loodofpatientswithhepat ocellularcarcinoma( HCC) .MethodsSubjectsGPC-3mRNAinperipheralbloodweredetectedby nestedreversetranscriptionpolymerasechainreaction ( RT-PCR ) in39patientswithHCC ，19hepatitisBandlivercirrhosis ，10themetastaticlivercancer ，10hepatichemangioma ，and19healthyvolunteers.ResultsGP

4、C-3mRNAwaspositiveintheperipheralbloodin24patientswithHCC62%andnegativeinpatientswithhepatitisandcirrhosis ， hemangio-ma ， metastaticlivercancerandhealthyvolunteers.TheexpressionofGPC-3mRNAw asstronglycorre-latedwithtumordiameter ， portalthrombosis ， metastasiaandTNMstage P0.05 .ConclusionsNestedRT-

5、PCRisasensitiveandreliablemethodfordet ectingcirculatingHCCcells.【Keywords】HCC;GPC-3;nestedRT-PCR;micro-metastasis早期微轉(zhuǎn)移是原發(fā)性肝癌HCC難以有效診治和病死率高的主要原因 之一，因此早期檢測出外周血中的腫瘤細(xì)胞，對及早有效的綜合治療 具有重要的臨床意義。血液微轉(zhuǎn)移是 HCC的主要轉(zhuǎn)移途徑1，但血 液微轉(zhuǎn)移的診斷仍然存在困難，主要是沒有找到能準(zhǔn)確反映微轉(zhuǎn)移的 腫瘤分子標(biāo)記物。近年來發(fā)現(xiàn) Glypican-3 GPC-3與肝癌的發(fā)生開展 有密切的關(guān)系2。本研究對HCC患者的外周血進(jìn)

6、行巢式RT-PCF檢測， 探討GPC-3mRNA僉作者單位:400037重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院肝 膽外科測對肝細(xì)胞癌微轉(zhuǎn)移診斷的可行性。1 材料與方法1.1 研究對象 2004年 3月至 2005年 12月，第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院及 西南醫(yī)院診治的HCC患者39例、肝炎和肝硬化19例、轉(zhuǎn)移性肝癌患 者10例、肝血管瘤患者 10例、健康獻(xiàn)血員 19例。各類患者的診斷均 經(jīng)組織病理學(xué)或影像學(xué)檢查證實(shí)，實(shí)驗(yàn)操作同期進(jìn)行。39例HCC患者 中，男性33例，女性6例，年齡3072歲，平均49士 12歲淇中 TNM 國際抗癌聯(lián)盟第6版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)1期、H期、皿期、W期 分別為 5例 13%、9例23%

7、、19例39%、6例 15%;伴門靜 脈癌栓10例25%;伴肝外轉(zhuǎn)移6例16%腫瘤直徑 5cm者 22例55%;癌結(jié)節(jié) 2個以上者 24例62%;分化程度高、中、低者分別為 6 例32%、7 例36%、6 例32%血清 AF禺 31 g/者 25 例 69%。肝外轉(zhuǎn)移灶的診斷依據(jù)X線、CT或彩色超聲檢查。轉(zhuǎn)移性肝 癌的原發(fā)灶分別是直腸癌 4例、結(jié)腸癌 3例、胃癌 2例和膽 管癌1 例。其中 4例經(jīng)過組織病理學(xué)檢查證實(shí)，其余 6例根據(jù)影像 學(xué)及其血清學(xué)檢查確診。 10 例肝血管瘤診斷均經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)。1.2方法標(biāo)本采集采集受檢者EDTA抗凝血5ml。1.2.2 單核細(xì)胞別離采用聚蔗糖 -泛影葡

8、胺密度梯度離心法別離外周血 單核細(xì)胞。細(xì)胞總RNA提取以Trizol采用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步提取有核細(xì) 胞總mRNA,經(jīng)紫外分光光度計和變性膠電泳鑒定，證明制備RNA的純度及未被降解。合成 3卩gRNA羊本參加 20 IcDNA反響體系，參考美國Promega公司產(chǎn)品說明書進(jìn)行cDNA合成。擴(kuò)增 GPC-3mRNA寸的一級 PCR反響體系50 口1 :5 卩 lcDN模 板、5卩l(xiāng)10緩沖液、4卩IMgSO4 4卩l(xiāng)dNTP兩條外引物各10pmol、5UTaqDNA 聚 合 酶 等 。 循 環(huán) 參 數(shù):94C 3min94C 30s 57C 30s 72C 1min ,30個循環(huán)，68C延伸 7min;取出5口1 反響產(chǎn)物，參加內(nèi)引物，繼續(xù)進(jìn)行第二級PCR反響。反響體系同上，循環(huán)參數(shù)同上，共 30個循環(huán)，最后72C延伸10min。擴(kuò)增 GPC-3 外引物：上游引物：5'-AGACT-GCGGTGATGATGAAGAT下游弓 I 物:5'-GAGAACGATAGAAAGGGAGGGA-3'GPC-