葛根素在共育體系中對成骨細(xì)胞增殖分化的影響(圖文)

1、葛根素在共育體系中對成骨細(xì)胞增殖分化的影響(圖文)    論文導(dǎo)讀：藥物葛根素廣東省藥品檢驗所批號:180752-200809。在共育體系中，成骨細(xì)胞在5100g/ml的葛根素中培養(yǎng)7d后產(chǎn)生促明顯的增殖作用。其中以100g/ml促增殖作用最強(qiáng)。堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志。 關(guān)鍵詞：葛根素，成骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞，增殖，分化    葛根素(Puerarin)是葛根中具有異黃酮結(jié)構(gòu)的主要活性成分之一，有研究表明，葛根素具有預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用 1。本文觀察了葛根素在成骨-破骨細(xì)胞共育體系中對大鼠成骨細(xì)胞增殖及堿性磷

2、酸酶活性的影響, 以評價其對骨代謝的作用。 1材料 1.1動物普通級1日齡Sprange-Dawley(SD)新生大鼠和5日齡SD新生大鼠，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：2008B006。 1.2藥物葛根素 廣東省藥品檢驗所批號: 180752-200809。 1.3試劑DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司），0.25%胰蛋白酶(Amersco公司)，型膠原酶（Sigma公司），堿性磷酸酶試劑盒(Sigma公司)。 1.4儀器超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠產(chǎn)品)，倒置相差顯微鏡(Nikon產(chǎn)品)，CO2培養(yǎng)箱(ThermoForma公司產(chǎn)品)，細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar公司產(chǎn)品)， 0.45m

3、過濾膜(Costar公司產(chǎn)品)，紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）。論文格式。 2方法 2.1分離培養(yǎng)OB 參照文獻(xiàn)2。 2.2分離培養(yǎng)OC 參照文獻(xiàn)2。 2.3共育體系的建立 在已制作好并消毒的24孔共育培養(yǎng)板，以3×104個/孔的密度將OB接種到OB培養(yǎng)室內(nèi)，以3×104個/孔的密度將OC接種到OC培養(yǎng)室內(nèi)，每20min觀察一次OC貼壁情況，同時觀察是否有細(xì)胞透過半透膜進(jìn)入OC培養(yǎng)室。 2.4MTT法測定葛根素對OB增殖的影響 取第三代OB以3×104個/孔的密度接種于OB 培養(yǎng)室，3h后，將新分離的OC以3×104個/孔接種于OC培養(yǎng)室；2

4、4h后換入無血清培養(yǎng)液，待細(xì)胞周期同步化后，更換為不同濃度的葛根素培養(yǎng)液。各劑量組的終濃度分別為0.05ug/ml、0.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、50ug/ml、100ug/ml。每個濃度設(shè)6個復(fù)孔。分別培養(yǎng)7天，更換無血清的DMEM培養(yǎng)基400ul，同時加入5mg/mL的MTT80ul/孔，置37，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4h后，在酶標(biāo)儀上測OD值，波長為570nm。參比波長為630nm。論文格式。 2.5PNPP法檢測葛根素對OB ALP活性的影響 取第三代OB以5×104個/孔的密度接種于OB培養(yǎng)室，3h后，將新分離的OC以5×104個/孔接種于OC

5、培養(yǎng)室；待細(xì)胞周期同步化后，再分別加入0.5g/ml、5g/ml、50g/ml的葛根素，與空白組對照。培養(yǎng)7d后，加入500ul 0.1%TritonX-100作用30min, 收集細(xì)胞裂解液，采用ALP試劑盒檢測其活性。 3結(jié)果 3.1葛根素對成骨細(xì)胞增殖的影響 在共育體系中，成骨細(xì)胞在5100g/ml的葛根素中培養(yǎng)7d后產(chǎn)生促明顯的增殖作用。其中以100g/ml促增殖作用最強(qiáng)。而0.05g/ml、0.5g/ml的葛根素作用無明顯差異。見表1。 表1不同濃度的葛根素對OB增殖的影響(X±S，n=6)      組別  &#

6、160; 空白組    0.05g/ml    0.5g/ml    5g/ml    10g/ml    50g/ml    100g/ml     OD值    0.256± 0.093    0.279 ±

7、;0.039    0.302± 0.021    0.326± 0.041*    0.338±0.029*    0.432±0.024*    0.572±0.030*     3.2葛根素對成骨細(xì)胞ALP活性的影響 堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志。在共育體系中，成骨細(xì)胞在不同濃度葛根素的培養(yǎng)下7d

8、，發(fā)現(xiàn)5g/ml、50g/ml濃度呈現(xiàn)明顯的促分化作用，其它濃度作用無顯著差異，見表2。 表2各實驗組堿性磷酸酶活性測定（，n=6）      組別    空白組    0.5g/ml    5g/ml    50g/ml     ALP( 金氏單位)    1.541±0.142  &#

9、160; 2.664±0.453    3.241±0.581*    4.256±0.187*     4討論 在正常生理條件下，骨組織中OB與OC間的功能活動并不是相互孤立存在的，骨組織的代謝依賴這兩種細(xì)胞的相互作用；OB介導(dǎo)的骨形成與OC介導(dǎo)的骨吸收相互耦聯(lián)，使骨重建處于一種動態(tài)平衡中，從而維持機(jī)體骨量與骨密度的正常。本實驗研究注重OB和OC兩者之間的相互作用，建立體外OB和OC聯(lián)合培養(yǎng)體系以反應(yīng)骨代謝的實際情況。 ALP是一種普

10、遍存在的細(xì)胞內(nèi)酶，是OB功能及分化的早期指標(biāo)之一。論文格式。ALP在細(xì)胞中的表達(dá)多少，可反映出OB的分化程度和功能狀態(tài)，ALP活性越高，說明前OB向成熟的OB分化得越明顯3。 本實驗研究表明葛根素在共育體系中對大鼠OB有明顯的促增殖作用。葛根素對OB ALP的影響隨濃度增強(qiáng)而增強(qiáng)，表明葛根素能夠促進(jìn)OB合成和分泌ALP，提示葛根素可能通過促進(jìn)OB的增殖和分化來增加OB的數(shù)量, 從而具有促進(jìn)骨形成的作用。臧洪敏等4研究證實葛根素具有刺激OB增殖，提高ALP活性，與本實驗結(jié)論相吻合。 本實驗在細(xì)胞水平觀察了葛根素對OB的直接作用，說明其預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制與其促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化的作用有關(guān)，為葛根素預(yù)防骨質(zhì)疏松癥提供了理論和實驗依據(jù)。    參考文獻(xiàn) 1王新祥,張允嶺,吳堅,等. 葛根對骨質(zhì)疏松模型小鼠骨密度和骨組織構(gòu)造的作用J.中國骨質(zhì)疏松雜志.2008，14(5):349-353. 2薛慶善主編. 體外培養(yǎng)的原理與技術(shù). 北京：科學(xué)出版社，2001年第1版：4