高速逆流色譜法

1、高速逆流色譜法高速逆流色譜法一、概述逆流色譜逆流色譜（countercurrent chromatography, CCC） 是一種簡(jiǎn)單的液-液分配色譜技術(shù)，不用固體支撐體來(lái)保留固定相，避免了樣品的不可逆吸附、失活和變性等問(wèn)題，近年來(lái)逐步發(fā)展成為一種備受關(guān)注的新型色譜分離技術(shù)。廣義定義：任何利用兩相不混溶液體的色譜技術(shù)；其中一相以一種相對(duì)均勻的方式縱向分布在一根空管或一系列的腔體中； 固定相固定相同時(shí)另一相以一定的速度通過(guò)第一相并與之混合。 流動(dòng)相流動(dòng)相減少了溶質(zhì)分子與固體支撐體之間各種復(fù)雜的相互作用；不僅可以獲得高純度的分離組分；同時(shí)具有較高的回收率和重現(xiàn)性。逆流色譜的發(fā)展20世紀(jì)50年代，

2、逆流分溶法逆流分溶法（CCD）被廣泛用于天然產(chǎn)物的分離。有設(shè)備龐大復(fù)雜、溶劑消耗大、分離時(shí)間太長(zhǎng)等缺陷。20世紀(jì)70年代，液滴逆流色譜液滴逆流色譜（DCCC）利用重力場(chǎng)將固定相保留在管形柱中，使流動(dòng)相以液滴形式通過(guò)固定相。缺陷是分離時(shí)間長(zhǎng)，溶劑體系有限。改進(jìn)后的離心分配色譜離心分配色譜和螺旋管式逆流色譜螺旋管式逆流色譜，利用離心力場(chǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)固定相的保留，縮短了分離時(shí)間。20世紀(jì)70-80年代，高速逆流色譜高速逆流色譜(high-speed CCC, HSCCC)被研制。利用螺旋管的特殊同步行星式運(yùn)動(dòng)模式，短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效分離。1993-1994年間，pH-pH-區(qū)帶精制逆流色譜技術(shù)區(qū)帶精制逆流色

3、譜技術(shù)發(fā)展起來(lái)，成功用于有機(jī)酸和有機(jī)堿的分離。1998年，Ito研究得到離心沉淀色譜離心沉淀色譜，為生物大分子以及細(xì)胞等生物物質(zhì)分離開(kāi)辟渠道。2002年，螺線形圓盤柱式高速逆流色譜螺線形圓盤柱式高速逆流色譜，改善保留。高速逆流色譜（高速逆流色譜（HSCCCHSCCC）High-speed countercurrent chromatography建立在一種特殊的流體動(dòng)力學(xué)平衡基礎(chǔ)上，利用螺旋管的高速行星式運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的不對(duì)稱離心力場(chǎng)，實(shí)現(xiàn)兩相溶劑體系的充分保留和有效混合及分配，從而實(shí)現(xiàn)物質(zhì)在兩相溶劑中高效分離。二、基本原理現(xiàn)代逆流色譜儀器體系：流體靜力學(xué)平衡體系流體靜力學(xué)平衡體系流體動(dòng)力學(xué)平衡體系

4、（流體動(dòng)力學(xué)平衡體系（HSCCCHSCCC體系）體系）儀器的兩個(gè)特征特征：a 有一個(gè)或多個(gè)纏繞有多層聚四氟乙烯管的線軸；b 沒(méi)有旋轉(zhuǎn)密封接頭，有一個(gè)安裝有兩個(gè)旋轉(zhuǎn)軸的齒輪傳動(dòng)裝置，能產(chǎn)生一個(gè)可變的離心力場(chǎng)。 通過(guò)公轉(zhuǎn)、自轉(zhuǎn)（同步行星式運(yùn)動(dòng)）產(chǎn)生的二維力場(chǎng)，保留兩相中的其中一相作為固定相；離心力場(chǎng)的強(qiáng)度和方向都可以變化；傾析和混合交替出現(xiàn)，兩相液體在螺旋管柱中總是處在接觸狀態(tài)，沒(méi)有死體積存在；流體動(dòng)力學(xué)CCC中壓力小，固定相保留值大。高速逆流色譜法是建立在單向性流體動(dòng)力平衡體系單向性流體動(dòng)力平衡體系之上的一種逆流色譜分離方法，它是在研究旋轉(zhuǎn)管的流體動(dòng)力平衡時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)的。當(dāng)螺旋管在高速轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，螺旋

5、管中的兩相都從一端分布到另一端。用某一相作移動(dòng)相從一端向另一端洗脫時(shí)，另一相在螺旋管里的保留值大約50%，但這一保留量會(huì)隨著移動(dòng)相流速的增大而減小，使分離效率降低。但使螺旋管的轉(zhuǎn)速加快時(shí)，兩相的分布發(fā)生變化。當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到臨界范圍時(shí)，兩相就會(huì)沿螺旋管長(zhǎng)度完全分開(kāi)，其中一相全部占據(jù)首端的一段，稱這一相為首端相，另一段全部占據(jù)尾端的一段，稱為尾端相。高速逆流色譜正是利用了兩相的這種單向性分布特征，在高的螺旋管轉(zhuǎn)動(dòng)速高的螺旋管轉(zhuǎn)動(dòng)速下，如果從尾端送入首端相，它將穿過(guò)尾端相而移向首端，同樣，如果從首端相送入尾相，它將穿過(guò)首端相而移向螺旋管的尾端。分離時(shí)，在螺旋管內(nèi)首先注入其中的一相(固定相)，然后從合適的

6、一端泵入移動(dòng)相，讓它載著樣品在螺旋管中無(wú)限次的分配。儀器轉(zhuǎn)速越快，固定相保留越多，分離效果越好，且大大地提高了分離速度，故稱高速逆流色譜。 三、技術(shù)特點(diǎn)不用固體支撐體，避免了物質(zhì)的不可逆吸附、失活和變性等；滯留柱中的樣品可通過(guò)多種洗脫方式予以完全回收有廣泛的兩相溶劑體系可供選擇，大大增加其適用范圍；粗樣可以直接上樣而不會(huì)對(duì)柱子造成任何損害；操作成本低，制備量大；操作靈活，固定相和流動(dòng)相之間可以互換作用；柱子可用合適溶劑清洗后重復(fù)使用。高速逆流色譜與高效液相色譜比較HPLC和HSCCC的固定相體積不同 理論塔板數(shù)的工作范圍不同；到目前為止，逆流色譜的最高分離效率低于5000理論塔板數(shù)。HSCCC

7、中溶質(zhì)可以進(jìn)入并接觸到液態(tài)固定相的整個(gè)體積；HPLC中，溶質(zhì)不能進(jìn)入到固體支撐體內(nèi)部，僅涂漬在表面的有機(jī)層的液-固界面 HPLC有過(guò)載現(xiàn)象；HSCCC進(jìn)樣體積可達(dá)到柱體積的20%，廣泛用于制備性分離。 HSCCC HSCCC與與HPLCHPLC是互補(bǔ)的分離技術(shù)是互補(bǔ)的分離技術(shù)參數(shù)參數(shù)HSCCCHSCCCHPLCHPLC固定相液體固體機(jī)理液-液分配（簡(jiǎn)單）分配、吸附、離子交換、體積排阻等（復(fù)雜）溶質(zhì)與固定相作用與液體固定相的整個(gè)體積相接觸在固定相與固體支撐體的界面相互作用上樣量高中等分離效率低高操作容易復(fù)雜費(fèi)用便宜昂貴危險(xiǎn)性高速運(yùn)轉(zhuǎn)產(chǎn)生機(jī)械故障安全四、工作方法HSCCC的分離效果與以下因素有關(guān)：

8、所選擇的溶劑體系所選擇的溶劑體系固定相和流動(dòng)相的選擇固定相和流動(dòng)相的選擇洗脫方式洗脫方式儀器的轉(zhuǎn)向和轉(zhuǎn)速儀器的轉(zhuǎn)向和轉(zhuǎn)速樣品濃度樣品濃度進(jìn)樣方式進(jìn)樣方式1.1.柱溫等柱溫等1、溶劑體系的準(zhǔn)備滿足以下要求滿足以下要求：p不造成樣品的分解與變性；p足夠高的樣品溶解度；p樣品在系統(tǒng)中有合適的分配系數(shù)值；p固定相能實(shí)現(xiàn)足夠高的保留。溶劑體系須給予足夠時(shí)間使兩相達(dá)到充分的平衡。溶劑體系須給予足夠時(shí)間使兩相達(dá)到充分的平衡。需要對(duì)混合溶劑進(jìn)行脫氣。需要對(duì)混合溶劑進(jìn)行脫氣。幾種常用的溶劑體系選擇方法參比已知的溶劑體系：文獻(xiàn)被分離物質(zhì)種類被分離物質(zhì)種類基本兩相溶劑體系基本兩相溶劑體系輔助溶劑輔助溶劑非極性或弱極

9、性物質(zhì)正庚（己）烷-甲醇氯烷烴正庚（己）烷-乙腈氯烷烴正庚（己）烷-甲醇（或乙腈）-水中等極性物質(zhì)氯仿-水甲醇，正丙醇，異丙醇乙酸乙酯-水正己烷，甲醇，正丁醇極性物質(zhì)正丁醇-水甲醇，乙酸幾種常用的溶劑體系選擇方法分配系數(shù)測(cè)定法（K:0.5-2，用分析型HPLC確定）HPLC掃描法（15cm長(zhǎng)C18柱，乙腈-水為流動(dòng)相，梯度洗脫，觀察出峰位置）薄層色譜法生物活性物質(zhì)分配比率法：只適用于生物活性成分分析型HSCCC法：用來(lái)選擇制備型分離時(shí)所用的溶劑體系2、柱系統(tǒng)的準(zhǔn)備固定相注入螺旋管柱內(nèi)重相為固定相：尾頭輕相為固定相：頭尾儀器以選定轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)流動(dòng)相以合適流速泵入柱內(nèi)檢測(cè)器基線穩(wěn)定時(shí)，柱系統(tǒng)準(zhǔn)備就緒進(jìn)

10、樣分析3、樣品溶液的準(zhǔn)備和進(jìn)樣通常將樣品混合物溶解在分離所用的溶劑體系中樣品量較小時(shí)：可將樣品溶解流動(dòng)相中樣品量較大時(shí)：建議將樣品溶解在相同體積的上相和下相溶劑的混合液中。（物理性質(zhì)發(fā)生變化，樣品進(jìn)入分離柱后，會(huì)導(dǎo)致固定相的嚴(yán)重流失）不能進(jìn)太高濃度的樣品允許相當(dāng)量的不溶性物質(zhì)進(jìn)入色譜柱4、洗脫方式梯度洗脫梯度洗脫（1 1）三元的溶劑體系）三元的溶劑體系 選擇溶劑1和溶劑2為兩種互溶溶劑（梯度溶劑）， 溶劑3不與前面任何一種互溶。 庚烷-甲醇-水體系：庚烷（固定相）水相（流動(dòng)相） 乙酸乙酯-正丁醇-水體系：水（固定相）乙酸乙酯（流動(dòng)相） 用于糖苷混合物的分離 糖苷溶解度：正丁醇 水 乙酸乙酯（2

11、 2）多元溶劑體系：）多元溶劑體系：情況復(fù)雜 正庚（己）烷-乙酸乙酯-甲醇-水體系 上相：正庚（己）烷-乙酸乙酯有機(jī)相 下相：水-甲醇 甲醇變化 上相溶解在水相中 梯度溶劑一般總是使固定相體積減少。（3 3）線性梯度和步進(jìn)梯度）線性梯度和步進(jìn)梯度 雙向洗脫雙向洗脫 樣品組分覆蓋極性范圍寬，采用等比例或梯度洗脫都很難實(shí)現(xiàn)一次性分離。p第一步：反向洗脫極性的水相-流動(dòng)相非極性的有機(jī)相-固定相p第二步：正向洗脫有機(jī)相-流動(dòng)相 從相反方向泵入柱中雖然雙向洗脫得到的選擇性并不十分令人滿意，但是具有：被分離物質(zhì)的全部回收、無(wú)不可逆吸附 以及有可能分離極性范圍非常寬的樣品組分，柱子可以重復(fù)使用而不需補(bǔ)充任何

12、溶劑等優(yōu)點(diǎn)。清空柱子清空柱子 利用逆流色譜的液態(tài)固定相的特性，即將保留在柱中對(duì)固定相有極強(qiáng)親和力，也就是分配系數(shù)高的成分，用多余的液體推出柱外以達(dá)到回收的目的。5、檢測(cè)紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器單波長(zhǎng)、多波長(zhǎng)UV-VIS制備型HPLC的檢測(cè)器（檢測(cè)池：直形的垂直流通型的。因?yàn)榉治鲂虷PLC的U形檢測(cè)池容易使固定相液滴滯留在池中，引起檢測(cè)器噪聲。）避免措施：輕相流動(dòng)相從檢測(cè)池上端進(jìn)入，向下流出； 重相流動(dòng)相從檢測(cè)池下端進(jìn)入，向上流出。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器傅里葉紅外光譜檢測(cè)器 （HSCCC獲得高的溶質(zhì)-溶劑比的流出物，使流動(dòng)相吸收紅外光譜的問(wèn)題得到解決。）薄層色譜檢測(cè)器（樣品噴霧裝置）質(zhì)譜檢測(cè)器五、儀器結(jié)構(gòu)分

13、析型制備型方法應(yīng)用分析型分析型HSCCCHSCCC的應(yīng)用的應(yīng)用溶劑體系的快速篩選溶劑體系的快速篩選利用分析型HSCCC體積小、速度快、溶劑消耗小的特點(diǎn)。例：Pharma-tech的CCC-20分析型逆流色譜儀（柱體積43mL） Ito制備型多層螺旋管分離儀（柱體積280mL） 沙棘黃酮的分離分析型HSCCC上樣量3mg，分離過(guò)程15min；制備型HSCCC上樣量100mg，分離過(guò)程2.5hr。葛根異黃酮的分離分配系數(shù)的測(cè)定分配系數(shù)的測(cè)定 在CCC中，由于溶質(zhì)的分配系數(shù)可以從色譜圖中計(jì)算而得，因此可以作為一種新型的測(cè)定分配系數(shù)的方法。例：系列烷基苯在正庚烷-甲醇-水體系中的分配系數(shù)小量天然產(chǎn)物樣

14、品的分離小量天然產(chǎn)物樣品的分離 粗樣或其它復(fù)雜樣品可以直接進(jìn)樣而不需要預(yù)先處理，樣品也不會(huì)因?yàn)椴豢赡嫖蕉鴵p失。例：多酚類物質(zhì)的分離。 這類物質(zhì)在HPLC上容易與色譜柱上的固體填料之間產(chǎn)生相互作用，而導(dǎo)致拖尾。在硅膠柱上易發(fā)生不可逆吸附。 HSCCC被認(rèn)為是分離多酚類物質(zhì)最有效的手段。例：植物粗提物的分離純化。 很好的樣品富集和預(yù)處理的手段。 分析型HSCCC作為一種為制備型HSCCC進(jìn)行方法開(kāi)發(fā)和小量樣品的分離純化手段，會(huì)有較好的應(yīng)用前景。中藥指紋圖譜研究方面的應(yīng)用中藥指紋圖譜研究方面的應(yīng)用 在不可能將中藥復(fù)雜成分都搞清楚的情況下，指紋圖譜的作用是反映復(fù)雜成分的中藥及其制劑內(nèi)在質(zhì)量的均一性和

15、穩(wěn)定性。 HSCCC相對(duì)于其他色譜技術(shù)具有許多獨(dú)特有點(diǎn)。應(yīng)用領(lǐng)域與拓展雙水相逆流色譜在蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用離心沉淀色譜在蛋白質(zhì)等分離中的應(yīng)用逆流色譜在手性分離中的應(yīng)用逆流色譜在天然藥物工業(yè)中的應(yīng)用雙水相逆流色譜在蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用雙水相逆流色譜在蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用雙水相體系（aqueous two-phase system, ATPS）是指某些高聚物之間或高聚物與無(wú)機(jī)鹽之間在水中以適當(dāng)?shù)臐舛热芙鈺?huì)形成互不相溶的兩水相或多水相系統(tǒng)。通過(guò)溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)的差異而進(jìn)行分離的方法稱為雙水相萃取技術(shù)。最常見(jiàn)：聚乙二醇（PEG）-磷酸鹽水溶液體系 聚乙二醇（PEG）-葡聚糖（DEX）體系成功

16、用于蛋白質(zhì)的大規(guī)模分離中。離心沉淀色譜在蛋白質(zhì)等分離中的應(yīng)用離心沉淀色譜在蛋白質(zhì)等分離中的應(yīng)用色譜分離是依據(jù)被分離物在兩相中分配系數(shù)的不同而進(jìn)行；逆流色譜是利用物質(zhì)在兩相液體中分配系數(shù)的不同實(shí)現(xiàn)分離；分離也可以依據(jù)被分離物在一個(gè)含有沉淀劑的濃度梯度變化的單一溶劑中的溶解度的不同而實(shí)現(xiàn)。 （前提：沉淀劑濃度梯度移動(dòng)的速度遠(yuǎn)低于溶劑流速）溶解度具有很小差異的物質(zhì)，經(jīng)過(guò)在柱中反復(fù)的沉淀和溶解即可達(dá)到分離。離心沉淀色譜離心沉淀色譜（centrifugal precipitation chromatography, CPC）是一種建立在類似于逆流色譜的不用固體支撐體的開(kāi)放性通道基礎(chǔ)上的沉淀和溶解色譜。具

17、有一定濃度梯度的沉淀劑通過(guò)半透膜引入柱中，沉淀的樣品分子通過(guò)離心力保留在柱中?？朔藗鹘y(tǒng)色譜中由固體支撐體引起的樣品損失及柱子堵塞等問(wèn)題。應(yīng)用于蛋白質(zhì)和一些合成高聚物的分離。原理：由一層半透膜隔開(kāi)的一對(duì)通道構(gòu)成的分離柱系統(tǒng)。上層：高濃度沉淀劑硫酸銨溶液下層：水 形成沉淀劑濃度梯度將一個(gè)混合樣品引入到下層通道，所有組分根據(jù)溶解度不同逐步沉淀下來(lái)；降低上層沉淀劑濃度開(kāi)始分離洗脫。蛋白質(zhì)分離條件的優(yōu)化 逆流色譜在手性分離中的應(yīng)用逆流色譜在手性分離中的應(yīng)用逆流色譜的優(yōu)勢(shì)獨(dú)特的高制備能力、低廉的液態(tài)固定相和低溶劑消耗；不需要采用化學(xué)手段將手性試劑鍵合到固體介質(zhì)上，只需將其添加到液態(tài)固定相中即可；同一根逆流色譜分離柱可以反復(fù)多次用于不同手性化合物的分離，只需選擇合適的兩相溶劑體系和手性試劑；1.通過(guò)調(diào)節(jié)加入到液態(tài)固定相中手性試劑的量，同一根逆流色譜柱既可用于手性分析，也可用于手性制備性分離。儀器體系和操作步驟常用手性試劑N-十二烷?；?L-脯氨酸-3,5-二甲基?；桨罚―PA）磺化-環(huán)糊精（CD） CD是由6、7或8個(gè)吡喃糖（含手性碳原子）構(gòu)成的環(huán)狀化合物，具有親脂性的內(nèi)腔和親水性的周沿。當(dāng)對(duì)映體的分子大小及憎水性與腔體相匹配，且和腔體周沿