免疫學(xué)診斷及檢測技術(shù)-

1、現(xiàn)已明確支氣管哮喘是以氣道炎癥細(xì)胞(包括嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等浸潤為主要病理特征的免疫性疾病。在其發(fā)病過程中,免疫系統(tǒng)的多種成分如T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、免疫球蛋白、細(xì)胞因子和粘附因子等起著關(guān)鍵的作用。對這些成分的免疫學(xué)監(jiān)測有助于闡明支氣管哮喘的病因、發(fā)病過程以及對疾病嚴(yán)重程度的r解,并可指導(dǎo)支氣管哮喘的治療。這些檢測大致可分為特異性的免疫學(xué)檢測和非特異性的免疫學(xué)檢測兩大類。第一節(jié)特異性免疫學(xué)檢測試驗特異性免疫試驗主要包括體內(nèi)過敏試驗、體外特異性IgE抗體的檢測、嗜堿性粒細(xì)胞釋放能力的檢測等,這些試驗可以直接或間接反映引起支氣管哮喘發(fā)作的過敏原、體內(nèi)特異性IgE的水平。一、體內(nèi)過

2、敏試驗主要有過敏原皮試和激發(fā)試驗兩種。(一過敏原皮試過敏性哮喘患者產(chǎn)生的針對某一種或多種過敏原的IgE或IgG4與皮膚粘膜下層的肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞Fe受體結(jié)合。局部接觸過敏原后,引起I型變態(tài)反應(yīng),從而使局部充血,水腫,形成風(fēng)團(tuán)和紅暈等臨床表現(xiàn),故我們通過皮試來了解過敏性哮喘患者的過敏原以及機體的敏感狀態(tài)和脫敏的療效。常用的過敏原皮試法有皮內(nèi)試驗、點刺法、抓痕法、斑貼法、被動皮膚轉(zhuǎn)移試驗法等五種,其中前兩種的應(yīng)用較為廣泛。皮試的部位一般采用上臂的伸側(cè),也可在大腿或背部。1.皮內(nèi)試驗(intradermal test 常用過敏原皮試液的濃度為1:100,對于花粉浸液則可用l1000或1:100

3、00。方法及步驟:酒精消毒局部皮膚后,用1ml注射器分別吸入不同過敏原的皮試液,在受試部位依次注入皮內(nèi)0.02ml,使之形成一3-4mm直徑的皮丘。為避免結(jié)果互相影響,相鄰皮丘間距為3cm左右。15分鐘后觀察結(jié)果。有些患者反應(yīng)較遲,可在皮試后30分鐘時再觀察一次。皮內(nèi)試驗的結(jié)果主要表現(xiàn)為風(fēng)團(tuán)和紅暈,其分級判斷標(biāo)準(zhǔn)參見表14-1。 皮內(nèi)法結(jié)果敏感、準(zhǔn)確、重復(fù)性較好,但由于其注入的過敏原量較多,有可能使高度敏感的病人產(chǎn)生過敏性哮喘或過敏性休克等全身反應(yīng),因此有一定的危險性。此外,該試驗結(jié)果的假陽性率比較高。2點刺試驗(prick test 所用過敏原皮試液的濃度為皮內(nèi)法的10 N100倍。方法及步

4、驟:先在皮試部位滴上一滴過敏原皮試液,然后用特制的點刺針在滴有皮試液的皮膚中央進(jìn)行點刺,點刺的深度以不引起出血為度。1分鐘后擦去皮試液,15分鐘后觀察結(jié)果,以局部出現(xiàn)風(fēng)團(tuán)和紅暈為陽性反應(yīng)。其結(jié)果分級判斷標(biāo)準(zhǔn)參見表14-2: 點刺法優(yōu)點:同皮內(nèi)法相比,其方法更為簡單;患者的局部疼痛比較輕;易于為患者所接受;進(jìn)入患者體內(nèi)的過敏原量比皮內(nèi)法少得多,因而引起全身過敏反應(yīng)的可能性小,比較安全;假陽性率也比較低。目前,國內(nèi)外皮試多采用此法。但該法的敏感性不如皮內(nèi)法,而且對皮試結(jié)果的分級不如皮內(nèi)法明顯。3.劃痕法( scratch test 方法及步驟:用消毒后的粗針頭在局部皮膚劃痕,其深度也是以不出血為度

5、,每一痕長為0.5cm,相鄰兩條痕之間間隔約3cm。然后依次滴上過敏原皮試液或?qū)φ找?十五分鐘后觀察結(jié)果。劃痕部位隆起并繞以紅暈者為陽性。該法優(yōu)點是不引起疼痛,尤適用于兒童。但由于進(jìn)入皮內(nèi)的過敏原量難以控制,故準(zhǔn)確性較差。4斑貼法(patch test 方法及步驟:在病人的前臂曲側(cè)皮膚上滴上一滴O.lN的NaOH 溶液用來軟化皮膚表面的角質(zhì)層。擦干后,將純凈的過敏原研成粉末,置于該處。滴上生理鹽水或人工汗液(其主要成份含氯化鈉13、乳酸2、脂酸2、硫酸鈉l%、尿素l%,輕輕拌勻后,覆蓋一層塑料薄膜,再用紗布包扎。2448小時后觀察結(jié)果。以出現(xiàn)紅暈、丘疹、水皰者為陽性反應(yīng),該試驗的觀察時間長,假

6、陽性和假陰性率均比較高,因而目前已不常用于哮喘病的病因?qū)W診斷,但仍是皮膚科用于接觸性變應(yīng)原診斷的重要手段之一。5.被動皮膚轉(zhuǎn)移試驗( passive transfer test 該法由德國的Prallsnitz和Kustner于1921年共同發(fā)現(xiàn),故又稱為P-K試驗。方法及步驟:采取病人全血后,分離血清(內(nèi)含特異性IgE,然后在受試者皮內(nèi)注入O.lml病人血清,并在注入處做好標(biāo)記,于2448小時后,在受試者皮膚的原血清注入處進(jìn)行各種過敏原皮試。被動皮膚轉(zhuǎn)移試驗適用于皮膚反應(yīng)性過強(如皮膚劃痕征陽性或過弱(注射1:10000的磷酸組胺后皮膚無反應(yīng)以及皮膚廣泛病變而不能進(jìn)行自身過敏原皮試的患者。其

7、缺點是易傳播乙肝、梅毒、愛滋病等傳染性疾病,故病人試驗前應(yīng)注意對這些傳染性疾病進(jìn)行檢測。隨著體外檢測特異性IgE技術(shù)的不斷發(fā)展本法已經(jīng)很少應(yīng)用于臨床,主要在研究時應(yīng)用。過敏原皮試同其它方法比,具有敏感性高,檢測速度快,重復(fù)性好,操作簡單,費用低的優(yōu)點。但是,應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到,支氣管哮喘的靶器官是在支氣管,而不是在皮膚。因此,過敏原皮試的結(jié)果與實際上引起患者支氣管哮喘發(fā)作的過敏原種類及其反應(yīng)程度之間有一定的差距。必要時,應(yīng)進(jìn)行過敏原氣道激發(fā)試驗或直接檢測抗原特異性IgE。(二激發(fā)試驗(provocation tests對于一些皮膚反應(yīng)性過強或過弱不適合皮試,以及皮試結(jié)果與臨床癥狀不符的病人可進(jìn)一步采用

8、激發(fā)試驗。常用的激發(fā)試驗有支氣管激發(fā)試驗及鼻粘膜激發(fā)試驗等。1.支氣管激發(fā)試驗( bronchial provocation test,BPT BPT在支氣管哮喘的病因診斷,發(fā)病機理和免疫治療方面的研究具有重要價值。它是通過讓患者霧化吸入過敏原后觀察患者有無哮喘發(fā)作及肺通氣功能的變化情況,從而明確引起哮喘發(fā)作的過敏原種類以及機體對其敏感程度。方法及步驟:試驗應(yīng)在哮喘緩解期進(jìn)行。試驗前23天內(nèi)停用任何有關(guān)哮喘治療的藥物(包括2激動劑、激素、茶堿、肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑等。常用的吸入過敏原包括各種花粉、霉菌、螨、室內(nèi)塵土等。一般以10倍的梯度配制溶液系列,將過敏原稀釋成濃度為1:100、1:1000、1

9、:10000、1:100000等。如估計在直接吸入下一濃度有可能誘發(fā)哮喘發(fā)作,則可在上述濃度系列中插入中間濃度的稀釋液如l:500、1: 5000等。一般最高吸入濃度,室內(nèi)塵土不超過1:10,花粉不超過1:100,霉菌不超過1:1000。試驗開始時首先測定患者的基礎(chǔ)肺功能(FEV1或PEFR等。然后按照濃度從低到高的次序,分別給病人霧化吸入定量過敏原稀釋液。觀察患者反應(yīng)并在10分鐘后復(fù)查患者肺功能指標(biāo)。當(dāng)病人出現(xiàn)胸部緊迫感、喘息;肺部聞及哮鳴音;FEV、下降大于15%時,表明該試驗結(jié)果陽性,立即終止試驗。若吸入最高濃度的稀釋液后仍無上述表現(xiàn),結(jié)果可判為陰性。在試驗過程中應(yīng)注意:為避免支氣管哮喘

10、的嚴(yán)重發(fā)作,必須從最低濃度開始;由于遲發(fā)性反應(yīng)的存在,有條件者應(yīng)觀察24小時以上;在進(jìn)行多種過敏原的BPT時,兩次激發(fā)試驗應(yīng)間隔足夠長時間,以免影響結(jié)果。近年來,Tamura等人提出應(yīng)用單次過敏原吸入法,從而簡化了BPT的測定。該法的過敏原稀釋液只有一個濃度,室內(nèi)塵土為1:5,豚草為1:10,花粉為1:10,患者一次性霧化吸入過敏原稀釋液一分鐘后,連續(xù)測定其基礎(chǔ)呼吸阻力(Rrs 10分鐘,若10分鐘內(nèi)Rrs上升超過基礎(chǔ)值的35%,則為陽性反應(yīng)。BPT直接以支氣管粘膜作為靶器官,因而,對引起支氣管哮喘發(fā)作的過敏原及機體敏感狀態(tài)的判斷不僅直接,而且敏感、準(zhǔn)確。同一種待測過敏原,如果皮試結(jié)果與BPT

11、 結(jié)果相矛盾,則以BPT試驗結(jié)果為準(zhǔn)。但本法也存在著一些不足:引起敏感病人支氣管哮喘嚴(yán)重發(fā)作的危險性較大;需要有專門的儀器和設(shè)備;每次激發(fā)只能采用一種過敏原,因而檢驗效率低。同時,我們還?？吹竭@樣的現(xiàn)象,有些病人對某一種過敏原的BPT呈陽性反應(yīng),但這些病人卻在同樣過敏原存在的場所或空間并不表現(xiàn)哮喘發(fā)作,或者只出現(xiàn)輕度的鼻部癥狀,即BPT試驗也存在一定的假陽性率。鑒于以上不足,BPT在臨床上的應(yīng)用也受到一定的限制。目前國外多采用“自然暴露法”以降低假陽性率。2.眼激發(fā)試驗(ophthalmic prococation test 方法及步驟:一側(cè)眼中滴入一滴濃度為1:1000的過敏原稀釋液,另一側(cè)

12、滴入一滴不含過敏原的過敏原溶媒作為對照,十五分鐘后觀察結(jié)果。若無反應(yīng),可在同側(cè)眼中滴入1:100的過敏原稀釋液,十五分鐘后仍無反應(yīng),則依次用1:10、純凈的過敏原粉末進(jìn)行試驗。其陽性反應(yīng)表現(xiàn)為眼刺癢感、流淚、結(jié)膜充血水腫。由于受試部位在眼睛,故我們在試驗中應(yīng)注意:觀察后,應(yīng)立即用生理鹽水或3%的硼酸溶液沖洗;反應(yīng)重的可滴入12滴腎上腺素或0.5%的醋酸可的松溶液。眼激發(fā)試驗比較簡單、直觀。但過敏原稀釋液、純凈的過敏原粉末對結(jié)膜的非特異性刺激作用,易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。此外,具有強刺激性的過敏原切不可采用此法。3.鼻粘膜激發(fā)試驗( nasal provocation test 方法及步驟:用兩張0.

13、5cmx lcm大小的濾紙片浸滿過敏原原液或不含過敏原的過敏原溶解液(也可直接將過敏原粉末或淀粉分別置于兩側(cè)鼻甲的前端。如果五到十五分鐘內(nèi)出現(xiàn)鼻癢、鼻塞、噴嚏、流涕等癥狀,檢查可見接觸過敏原側(cè)鼻腔粘膜蒼白、水腫,鼻腔中有大量漿液性分泌物,表明該試驗結(jié)果陽性。鼻粘膜激發(fā)試驗的結(jié)果較為直觀、可靠,其與臨床相符率比皮試高,但該試驗每次只能檢測一種抗原,檢驗效率低。二、特異性IgE抗體的檢測隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,通過對抗原特異性IgE的檢測從而明確過敏原的方法已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。其中包括放射性變應(yīng)原吸附試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗和嗜堿性粒細(xì)胞組胺釋放試驗等。(一放射性變應(yīng)原吸附試驗(radio all

14、ergosorbent test,RASTRAST于1967年,由Wide等人首次應(yīng)用于血清中特異性IgE的檢測。它的原理是:將待測過敏原結(jié)合于固相聚合體(纖維素顆?；驗V紙等,聚合體上的過敏原與待測血清中特異性IgE結(jié)合,形成聚合體一過敏原.特異性IgE的復(fù)合物。當(dāng)加入用同位素標(biāo)記(常用125 I的抗IgE抗體后,進(jìn)一步結(jié)合形成聚合體.過敏原特異性IgE-125 I抗IgE抗體的大復(fù)合物。用-計數(shù)器測定整個大復(fù)合物的放射活性。待測血清中的特異性IgE的濃度與大復(fù)合物的放射性成正比。由此判斷待測血清中特異性lgE的水平。1.RAST的一般步驟用溴化氫技術(shù)將過敏原(如花粉、屋塵、螨等兩價結(jié)合于濾紙

15、片后,將濾紙片放入容器的底部,用微量加樣器小心將待測血清(或標(biāo)準(zhǔn)品加在濾紙上,室溫孵育至血清IgE(標(biāo)準(zhǔn)品與過敏原充分結(jié)合后,應(yīng)用磷酸緩沖液(PBS液多次沖洗容器及濾紙片,洗去未結(jié)合的IgE;加入125 I標(biāo)記的抗人IgE,室溫孵育后,再用磷酸緩沖液洗去未結(jié)合的碘標(biāo)記抗人IgE抗體;置于-計數(shù)器計數(shù)。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):一般以大于正常人平均數(shù)加兩個標(biāo)準(zhǔn)差者為陽性。2.RAST的優(yōu)點結(jié)果準(zhǔn)確,RAST與過敏原皮試和支氣管粘膜激發(fā)試驗等方法的檢測結(jié)果符合率高;可同時進(jìn)行多種過敏原和多個病人血清的檢測;敏感度高、特異性好;不受所用平喘藥物的影響?；谏鲜鰞?yōu)點,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為RAST是檢測血清特異性IgE 的

16、金標(biāo)準(zhǔn),成為抗原特異性IgE檢測的首選方法。目前已成為支氣管哮喘的病因?qū)W診斷和免疫治療療效的可靠指標(biāo)。3.RAST的缺點同皮試法相比,其敏感性稍低于皮試;易受到一些因素的干擾,如特異性IgG水平的增高可影響RAST的結(jié)果;需要采用-計數(shù)器、液體閃爍儀等專門儀器設(shè)備;采用放射性核素,易污染環(huán)境,需要一系列的同位素防護(hù)和處理措施。故不能廣泛開展。目前,國外多采用“Cap-system”使RAST檢測自動化,并且使檢測結(jié)果更加敏感。Cap 是內(nèi)裝高度親水、具有一定彈性的載體的塑料帽狀物,該載體實質(zhì)上是一種纖維素的化學(xué)衍生物,具有纖維素的特性。但Cap同普通纖維素圓盤相比,它具有三維空間的立體結(jié)構(gòu)模式

17、,增加了載體的表面積,有利于過敏原的吸附和有利于過敏原同特異性IgE快速結(jié)合。其結(jié)合過敏原的量是相應(yīng)大小的纖維素圓盤的三倍,而且也將特異性IgE同過敏原結(jié)合達(dá)到平衡所需要的時間縮短為二十分鐘。此外,利用載體的彈性,可用自動化擠壓的方法把未結(jié)合的物質(zhì)沖洗干凈,盡量減少了測量“本底”。目前,“Cap-system”多應(yīng)用-半乳糖苷酶( -galsctosidase分解底物4-甲基傘桂- -D半乳糖苷(4-methylumbelliferryi-p-falactoside產(chǎn)生熒光的原理,采用熒光酶聯(lián)法(RAST FEIA代替常用的放免法(RIA。這些改進(jìn)使“Cap-system”能對特異性IgE進(jìn)行

18、自動化檢測,而且更加敏感、特異、高效。鑒于RAST的不足之處,我們可以看到,RAST并不能夠代替病史的詢問和過敏原皮試。臨床研究結(jié)果也顯示皮試與臨床的符合率常常比RAST結(jié)果更為接近。世界衛(wèi)生組織(WHO在評價臨床免疫學(xué)八種廣泛使用的診斷方法的備忘錄中指出,在以下情況下考慮作RAST的檢測:因皮膚劃痕征陽性或嚴(yán)重皮炎不能作皮試者;抗組胺等對癥治療藥物影響皮膚反應(yīng)者;皮試可能發(fā)生危險者;不能用于皮試的變應(yīng)原,如毒素,非水溶性或高度致敏性物質(zhì);食物過敏,皮試結(jié)果不可靠者;皮試結(jié)果可疑者。(二酶聯(lián)免疫吸附試驗I enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA1976年

19、,Weltman應(yīng)用單抗體法,以半乳醇苷酶標(biāo)記的ELISA技術(shù)首次測定了血清中特異性的IgE抗體后,ELISA法測定血清特異性IgE的方法漸為人們所采用。其操作方法也已經(jīng)有了很大的改進(jìn)。ELISA的原理是:將過敏原吸附于聚苯乙烯小孔后,加入待測IgE,使過敏原與特異性IgE相結(jié)合,形成過敏原特異性IgE的復(fù)合物。再加入酶標(biāo)的抗人IgE抗體(常用辣根過氧化物酶HRP或堿性磷酸酶AKP標(biāo)記形成過敏原特異性IgE-酶標(biāo)抗人'IgE的復(fù)合物。最后加入酶的底物(鄰苯二胺或4-硝基苯磷酸鹽酶解有色底物形成有色產(chǎn)物,根據(jù)顏色深淺測出特異性IgE的含量。ELISA的一般步驟:取潔凈聚苯乙烯凹空反應(yīng)板,

20、每孔加入含過敏原的包被緩沖液,置37濕盒中過夜,使過敏原充分吸附于反應(yīng)板;倒去包被液,用緩沖液洗去未結(jié)合的過敏原后,每孔內(nèi)加入待測血清和陰性參考血清,并設(shè)定空白對照,然后放置37濕盒2小時,使過敏原與特異性IgE結(jié)合;洗去未結(jié)合的血清部分,每孔加入稀釋的抗人IgE酶標(biāo)抗體(如辣根過氧化物酶,再置之濕盒孵育形成三重復(fù)合物;洗去未結(jié)合部分,每孔加入底物溶液,反應(yīng)一段時間后,每孔內(nèi)加入抑制劑終止酶反應(yīng);酶標(biāo)光度計在一定波長下測定其光密度值;計算結(jié)果,以待測血清和陰性對照血清的光密度比值( P/N來表示特異性IgE水平,以P/N2.1為陽性。同RAST相比,ELISA具有簡便、快速、安全的優(yōu)點,而且價

21、格便宜,可避免接觸同位素;同時,酶標(biāo)抗體相對穩(wěn)定,可以長期保存;在準(zhǔn)確性方面,ELISA同RAST、BPT、過敏原皮試結(jié)果有符合率高,故而目前在國內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用。在ELISA的基礎(chǔ)上,Hawkes等人于1982年利用硝酸纖維膜能夠吸附蛋白質(zhì)、核酸的特性,刨建了點免疫結(jié)合試驗(DOT ELISA.使ELISA的操作更為簡單,現(xiàn)將具體方法介紹如下:將硝酸纖維素膜在TBS緩沖液(50mmol/L Tris-Hcl, 150mmol/LNacl,pH7,6中浸泡10分鐘后用濾紙吸干水分;將硝酸纖維素膜切成小條,每隔一定距離(5mm加入過敏原溶液2ul,每種過敏原做2個點,滲入后,置溫箱,使其完全吸

22、附;TBS液沖洗數(shù)次后,將膜條置入一多槽盤中,每槽一條,各自加入稀釋的血清,室溫反應(yīng)過夜;洗滌后,各槽加入稀釋有酶標(biāo)(HRP標(biāo)記抗人IgE抗體,室溫?fù)u動一個半小時;洗滌后各槽加入底物溶液(可用3mg/ml的4-氯-l-萘酚甲醇貯存液0.6ml+ 5mLTBS液+2130%的H2 02,反應(yīng)一段時間后用蒸餾水漂洗纖維膜,直至背景清晰;判斷結(jié)果,以出現(xiàn)藍(lán)色斑點為陽性。DOT ELISA檢測抗原特異性IgE,其結(jié)果與ELISA基本符合,符合率達(dá)85%以上。該方法與皮試結(jié)果的符合率也較高。該方法與ELISA法相比,不需要特別儀器,抗原膜可以長期保存,還可同時檢測多種抗原特異性IgE抗體。三、嗜堿性粒細(xì)

23、胞釋放能力的體外檢測嗜堿性粒細(xì)胞釋放能力( human basophil releasability,HBR是指嗜堿性粒細(xì)胞在應(yīng)答各種刺激時釋放化學(xué)介質(zhì)(脫顆粒的能力。眾所周知,支氣管哮喘的發(fā)作與否,并非直接取決于循環(huán)中IgE抗體水平,而是取決于已致敏的嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞在各種特異性和非特異刺激下釋放化學(xué)介質(zhì)(脫顆粒的能力。研究表明,哮喘病人血中嗜堿性粒細(xì)胞對各種特異性的免疫刺激(過敏原和非特異性的免疫刺激(抗IgE抗體的反應(yīng)性同哮喘發(fā)作的嚴(yán)重性呈平行關(guān)系。因而嗜堿性粒細(xì)胞釋放能力的檢測越來越受到人們的重視,現(xiàn)已成為人們尋找過敏原、預(yù)示病情和判斷療效的常用方法。它的檢測方法主要有兩種,嗜堿

24、性粒細(xì)胞組胺釋放試驗和人嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒試驗。(一嗜堿細(xì)胞組胺釋放試驗(histatnine release from besophil test,HRBT HRBT是由Lichtenstein于1964年首先建立。其原理:人血中的組胺幾乎全部存在于嗜堿性粒細(xì)胞中。哮喘病人的嗜堿性粒細(xì)胞在體外與相應(yīng)過敏原孵育時,過敏原披嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE所識別,產(chǎn)生橋聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致胞漿顆粒釋放,從而使組胺也得到了釋放,應(yīng)用熒光法或同位素酶法測定組胺的水平能夠反映出患者對某種過敏原是否敏感以及機體的敏感程度。其具體的操作方法有兩種:洗滌白細(xì)胞法和全血法。現(xiàn)介紹如下:1 洗滌白細(xì)胞法(1制備白細(xì)胞懸液:用硅

25、油處理的無菌注射器采集lOml靜脈血,肝素化后加入3%葡萄糖3%葡聚糖溶液2ml,混勻,靜置6090分鐘,直至紅細(xì)胞和血漿層之聞出現(xiàn)明顯分層。小心吸出血漿和白細(xì)胞層,離心后棄上清。用Tris-A緩沖液沖洗白細(xì)胞兩次,最后用含鈣、鎂離子的Tris-ACM緩沖液將其稀釋成3×105個白細(xì)胞懸液。(2孵育:細(xì)胞懸液中加入待測過敏原,并在37條件下孵育60分鐘后,離心,取上清液備測。(3組胺的檢測:采用熒光法檢測,應(yīng)用正丁醇溶液提取上清中的組胺,接著用正庚烷的鹽酸溶液提出組胺,然后在堿性條件下,加入苯二甲醛,產(chǎn)生帶熒光的縮合物,用熒光分光光度計測定,并計算組胺釋放率:組胺釋放率%=(過敏原管

26、一對照管÷(總細(xì)胞管一試劑空白管×100%組胺釋放率大于15%為陽性。2.全血法直接將過敏原加入肝素化全血中進(jìn)行組胺釋放試驗,可以更好地反映機體反應(yīng)狀態(tài),同時還具有用血量少和操作簡單的優(yōu)點。HRBT可用于評價機體的過敏反應(yīng),HRBT狀態(tài)的結(jié)果與過敏性哮喘病人的臨床癥狀、過敏原皮試及血清特異性IgE抗體水平有顯著的相關(guān)性;還可以測定IgE抗體活性及檢測嗜堿性粒細(xì)胞表面特異性的IgE抗體;此外也可測定特異性IgG和脫敏療法對此抗體的影響。HBRT的敏感度高,結(jié)果可靠,但所需儀器設(shè)備要求高,影響因素也比較多,故目前較多采用人嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒試驗。(二人嗜堿細(xì)胞脫顆粒試驗(hum

27、an basophil degranulation test,HBDTHBDT利用嗜堿性粒細(xì)胞胞漿內(nèi)硫酸肝素顆?？杀患妆桨匪{(lán)和阿利新藍(lán)等堿性染料染色的原理,在加入過敏原后,過敏原與吸附與嗜堿性粒細(xì)胞表面的特異性IgE結(jié)合,產(chǎn)生橋聯(lián)反應(yīng),可導(dǎo)致嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒,從而使被染色的細(xì)胞減少。因而,可以通過測定管與對照管中的被染色的嗜堿性粒細(xì)胞計數(shù)值的對比;來了解過敏原及機體過敏狀況。HBDT的一般步驟:先制備細(xì)胞懸液,取肝素抗凝血3ml與等量pH7.6HepesACM 緩沖液混合,平鋪于3ml葡聚糖一泛影葡胺分離液面后,離心,用滴管輕輕吸取中間層細(xì)胞,置于含5ml同樣緩沖液的試管中,充分混勻后離心,

28、棄上清,留0.3ml懸液混勻;孵育。用微量加樣器分別吸取不同濃度的過敏原溶液加入各試管中,再加入已制備的細(xì)胞懸液混勻;將細(xì)胞一過敏原混合液置37水浴,然后用阿利新藍(lán)( Alcianblue染色后,滴入計數(shù)板,數(shù)兩個九大格嗜堿性粒細(xì)胞數(shù),取均值計算脫顆粒指數(shù)(Degranulation index, DI:DI=(對照管嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)一測定管嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)÷對照管嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)×100%DI> 30%為陽性。HBDT可用于過敏原的檢測和哮喘發(fā)病機制的研究。同HBRT相比,具有設(shè)備簡單、價格低廉、操作簡單、易于在基層醫(yī)院開展的優(yōu)點。但本法不適用于少數(shù)外周血嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)少

29、于20個/l的病人。第二節(jié)非特異性免疫學(xué)檢測試驗一、血清中總IgE的檢測本試驗主要檢測血清中的總IgE水平。IgE是支氣管哮喘發(fā)病有關(guān)的重要的免疫球蛋白。支氣管哮喘病人血清中的總IgE常有升高,血清中的總IgE水平的升高也預(yù)示了受試者患有支氣管哮喘等特應(yīng)性疾病。目前,檢測血清IgE的常用方法包括紙片放射免疫吸附試驗、酶聯(lián)免疫法、反向被動血凝試驗、放免吸附技術(shù)、放射單擴散技術(shù)等。(一紙片免疫吸附試驗( paper radioimmunosorbent test,PRIST國外多采用此法檢測血清中的總IgE。1.原理及步驟(1將抗IgE抗體偶聯(lián)于經(jīng)溴化氫活化的濾紙片上;(2加入待測標(biāo)本或IgG標(biāo)準(zhǔn)

30、品,形成抗IgE - IgE的復(fù)合物;(3加入125I標(biāo)記的抗IgE抗體,形成抗IgE-lgE-125I_抗IgE復(fù)合物;(4測定復(fù)合物的放射性活度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定代測血清中總IgE的水平。2評價PRIST具有靈敏度高、重復(fù)性好的優(yōu)點,但需要-計數(shù)器或液體閃爍儀等檢測設(shè)備,費用高,并需要一定的同位數(shù)防護(hù)和處理措施,因此在國內(nèi)臨床應(yīng)用受到很大的限制。(二酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linded immunosorbent assay.ELISAELISA測血清總IgE在國內(nèi)應(yīng)用較為廣泛。目前經(jīng)常采用雙抗體法。1.原理及步驟(1將抗人IgE包被于聚苯乙烯微量測定凹空板中;(2加入待測血清樣品

31、或標(biāo)準(zhǔn)品與之相結(jié)合,形成抗人IgE -IgE復(fù)合物;(3加入辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgE抗體,形成抗人IgE - lgE-酶標(biāo)抗人IgE復(fù)合物;(4洗去菲結(jié)合部分后,加入酶的底物鄰苯二胺或4-硝基苯磷酸鹽;(5根據(jù)酶解底物呈現(xiàn)的顏色反應(yīng),應(yīng)用微量分光光度計測定光密度值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測血清總lgE的量。2.評價ELISA法具有特異、敏感、迅速、簡單、易于開展的優(yōu)點。但仍需要一定的檢測儀器、費用也較高。(三反向被動血凝試驗(rerersed passive hemmmogglutination test,RPHAT是一種半定量的血清總IgE測定方法。1.原理及步驟應(yīng)用戊二醛或甲

32、醛固定綿羊紅細(xì)胞;將抗人IgE結(jié)合于綿羊紅細(xì)胞使之成為“致敏紅細(xì)胞”;對待測血清進(jìn)行二倍法稀釋,然后分別在各管中加入“致敏紅細(xì)胞”;觀察不同血清濃度試管中紅細(xì)胞的凝集情況,從而了解總IgE的水平。2.評價RPHAT法不需要特別儀器、操作簡單、快速、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點,能夠在我國廣大基層醫(yī)院開展應(yīng)用。但其敏感性較ELISA法和PRIST法稍低。(四放射單擴散法(radioactive single radical diffusdion technique,RSRD和放射免疫吸附技術(shù)( radio immunosorbent technique.RIST前者操作復(fù)雜、敏感性低,而后者國內(nèi)缺少必要的試劑,因

33、兩者在國內(nèi)很少應(yīng)用故不再贅述。二、嗜酸性粒細(xì)胞及其介質(zhì)的檢測嗜酸性粒細(xì)胞是支氣管哮喘發(fā)病過程中的重要細(xì)胞,它在哮喘的遲發(fā)性的反應(yīng)中起著關(guān)鍵的作用。早已明確,支氣管哮喘患者支氣管肺泡灌洗液和痰液中,嗜酸性粒細(xì)胞明顯升高,而對于具有雙相哮喘反應(yīng)者同時還伴有血嗜酸性粒細(xì)胞的升高。故而,嗜酸性粒細(xì)胞的檢測成為支氣管哮喘免疫學(xué)診斷的一個重要方面。(一血液嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)利用嗜酸性粒細(xì)胞中的顆粒的染色反應(yīng)進(jìn)行計數(shù)細(xì)胞,常用的染色液有伊紅甲醛稀釋液、伊紅甘油稀釋液及伊紅一丙酮稀釋液三種。其一般步驟為:吸取稀釋液0. 38ml 加入試管內(nèi);用毛細(xì)取血管吸取末梢血液20L加入該試管內(nèi),輕輕混勻,靜置五分鐘;用滴管吸取少量樣品滴入Fuchs-Rlsenthal血球計數(shù)池內(nèi),用低倍鏡觀察10個大方格內(nèi)的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)(嗜酸性粒細(xì)胞被染成桔紅色;計算,嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)/L= 10個大方格內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)×20×106,正常值為(0.050.3×l09/L。(二痰液的嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)痰液是來源于氣道表面的粘液,因而對痰液嗜酸性粒細(xì)胞的檢測能夠反映氣道的嗜酸性粒細(xì)胞的炎癥情況。其方法及步驟如下:用棉簽蘸取或用小的金屬鉤和剪刀切取痰塊的一小部分,涂f載玻片上;滴加等體積的leishma