生物化學(xué)-第3章-氨基酸

1、第3章 氨基酸一、氨基酸是蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子（一）蛋白質(zhì)的水解 1.酸水解：常用6mol/L HCl回流20h，水解完全，不引起消旋，但色氨酸破壞，羥基氨基酸部分水解，酰胺鍵水解。 2.堿水解：水解完全，會引起消旋，但色氨酸不破壞。 3.酶水解：水解不完全，不引起消旋，色氨酸不破壞，主要用于蛋白質(zhì)的部分水解。2020種氨基酸的發(fā)現(xiàn)年代表種氨基酸的發(fā)現(xiàn)年代表天冬酰氨天冬酰氨 1806 Vauquelin 天門冬芽天門冬芽甘氨酸甘氨酸 1820 Braconnot 明膠明膠亮氨酸亮氨酸 1820 Braconnot 羊毛、肌肉羊毛、肌肉酪氨酸酪氨酸 1849 Bopp 奶酪奶酪絲氨酸絲氨酸 1865

2、 Cramer 蠶絲蠶絲谷氨酸谷氨酸 1866 Ritthausen 面筋面筋天冬氨酸天冬氨酸 1868 Ritthausen 蠶豆蠶豆苯丙氨酸苯丙氨酸 1881 Schultze 羽扇豆芽羽扇豆芽丙氨酸丙氨酸 1881 Weyl 絲心蛋白絲心蛋白 賴氨酸賴氨酸 1889 Drechsel 珊瑚珊瑚精氨酸精氨酸 1895 Hedin 牛角牛角組氨酸組氨酸 1896 Kossel,Hedin 奶酪奶酪胱氨酸胱氨酸 1899 Morner 牛角牛角纈氨酸纈氨酸 1901 Fischer 奶酪奶酪脯氨酸脯氨酸 1901 Fischer 奶酪奶酪色氨酸色氨酸 1901 Hopkins 奶酪奶酪異亮氨酸

3、異亮氨酸 1904 Erhlich 纖維蛋白纖維蛋白甲硫氨酸甲硫氨酸 1922 Mueller 奶酪奶酪蘇氨酸蘇氨酸 1935 McCoy et al 奶酪奶酪（二）-氨基酸的一般結(jié)構(gòu)氨基在-位，為L-構(gòu)型.二、氨基酸的分類(一)常見的蛋白質(zhì)氨基酸1.常見的蛋白質(zhì)氨基酸共二十種。 2.按化學(xué)結(jié)構(gòu)分為脂肪族、芳香族和雜環(huán)族三類。這種分類方法對于研究氨基酸的合成與分解有重要意義。 3.按R-基的極性分為非極性R-基氨基酸、不帶電荷的極性R-基氨基酸、帶正電荷的極性R-基氨基酸、帶負電荷的極性R-基氨基酸四類。這種分類方法對于研究氨基酸在蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中的作用，和對于氨基酸的分離純化均有重要意義。

4、4.也可將氨基酸分為非極性脂肪族R-基氨基酸、非極性芳香族R-基氨基酸、不帶電荷的極性R-基氨基酸、帶正電荷的極性R-基氨基酸、帶負電荷的極性R-基氨基酸五類。 要熟悉氨基酸的結(jié)構(gòu)特點、分類和符號。注意結(jié)構(gòu)特點(二) 不常見的蛋白質(zhì)氨基酸5-羥賴氨酸4-羥脯氨酸甲狀腺素3-甲基組氨酸-N-甲基賴氨酸-N，N，N-三甲基賴氨酸-氨基己二酸-羧基谷氨酸焦谷氨酸磷酸絲氨酸磷酸蘇氨酸磷酸酪絲氨酸N-甲基精氨酸N-乙酰賴氨酸(三) 非蛋白質(zhì)氨基酸肌氨酸-氨基丁酸甜菜堿-丙氨基疊氮絲氨酸O-重氮乙酰絲氨酸高絲氨酸羊毛硫氨酸高半胱氨酸苯絲氨酸氯胺苯醇（氯霉素）環(huán)絲氨酸腎上腺素組胺5-羥色氨青霉胺鳥氨基瓜氨基

5、三、氨基酸的酸堿化學(xué)（一）氨基酸的兼性離子形式 氨基酸在晶體狀態(tài)和水溶液中均以兼性離子形式存在。因此,氨基酸有很高的熔點。（二）氨基酸的解離(三)氨基酸的等電點1.等電點的定義2.等電點的計算對于R基無解離基團的氨基酸：pI=（pK1+pK2）/2對于R基有解離基團的氨基酸：pI等于等電形式兩側(cè)的pK值之和的一半，以等電形式為中心，另一個pK值為第二級解離，可以忽略不計。如Glu:Glu+Glu+-Glu-Glu2-若pH=pI=3.22，根據(jù)pH = pKa+log質(zhì)子受體質(zhì)子受體/質(zhì)子供體質(zhì)子供體3.22=9.67+logGlu2-/Glu-得Glu2-/Glu-=3.510-7Lys，A

6、rg和His的pI等于兩個大的pK值之和的一半；Asp，Glu，Tyr和Cys的pI等于兩個小的pK值之和的一半。2.194.259.67(四)氨基酸的甲醛滴定滴定終點由12左右降到9左右，可以用酚酞為指示劑，用標準氫氧化鈉滴定。四、氨基酸的化學(xué)反應(yīng)(一)-氨基參加的反應(yīng)1.與亞硝酸的反應(yīng) 測量氮氣的體積可計算氨基酸的含量。2.與?；噭┑姆磻?yīng) 可用于氨基的保護。3.烴基化反應(yīng) 可用于測定多肽鏈的氮末端氨基酸。4.形成西佛堿的反應(yīng) 為轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的中間步驟。5.脫氨基反應(yīng) 為氨基酸分解反應(yīng)的重要中間步驟。 ( (二)-)-羧基參加的反應(yīng) 1.成鹽和成酯反應(yīng) 可用于羧基的保護。2.成酰氯反應(yīng) 可用

7、于羧基的活化。3.脫羧基反應(yīng) 是生成胺類的重要反應(yīng)。4.疊氮反應(yīng) 可用于羧基的活化。 (三)-氨基和-羧基共同參加的反應(yīng)1. 與茚三酮的反應(yīng)常用于氨基酸的定性或定量檢測。2.成肽反應(yīng)( (四) )側(cè)鏈R基參加的反應(yīng)1.酪氨酸可發(fā)生碘化、硝化、重氮反應(yīng)，后者可用于檢測酪氨酸。2.組氨酸可發(fā)生重氮反應(yīng)。3.精氨酸可與環(huán)己二酮發(fā)生縮合反應(yīng)，曾被用于氨基酸序列分析。4.色氨酸可被N-溴代琥珀酰亞胺氧化，生成有色化合物，可用于色氨酸定量測定。5.半胱氨酸可生成烷基衍生物，可用于巰基的保護。巰基可與重金屬生成鹽，使蛋白質(zhì)失活。巰基在空氣中可被氧化，金屬離子對此有催化作用。6.胱氨酸的二硫鍵可被還原為兩個巰

8、基。也可以被過甲酸氧化成兩個磺酸基。N-乙酰馬來酰亞胺半胱氨酸胱氨酸碘乙酸丙烯腈5，5-二硫雙（2-硝基苯酸）巰基陰離子對羥基汞苯酸賴氨酸希夫堿五、氨基酸的光學(xué)活性和光譜性質(zhì)1.氨基酸的光學(xué)活性和立體化學(xué)： 氨基酸的不對稱碳原子可用D-或L-表示，其比旋值可用于氨基酸的鑒別。2.氨基酸的光譜性質(zhì)：芳香族氨基酸的紫外吸收光譜如圖所示。這一性質(zhì)可用于蛋白質(zhì)的定量測定。氨基酸的氨基酸的1 1H H NMR譜譜3.3.氨基酸的核磁共振（氨基酸的核磁共振（NMRNMR） 在外加磁場的作用下，原子核的自旋方向達到一致，可以和一定頻率的外加磁場共振而形成吸收峰，同一種原子核在分子中的位置不同，因其外圍的電子

9、云對核的屏蔽作用引起的吸收峰位置移動（化學(xué)位移）也不同，由吸收峰的位置可以推斷原子處于哪一個基團，在1H NMR譜中，當(dāng)相鄰基團上有n個質(zhì)子時，該基團的質(zhì)子吸收峰將分裂成n+1個峰。aabbcc六、氨基酸混合物的分析分離(一)分配層析法的一般原理分配系數(shù)=物質(zhì)在流動相中的總量/物質(zhì)在固定相中的總量逆流分溶符合二項式的展開式，但對于紙層析和柱層析來說，有關(guān)的計算無實際意義。(二)分配柱層析可以同檢測器、記錄儀、餾分收集器、輸液泵構(gòu)成層析系統(tǒng)。(三)紙層析Rf主要與R基的極性有關(guān)，溶劑的pH可影響R基的極性，氨基酸與濾紙的吸附作用也影響Rf。(四) 薄層層析速度快，硅膠等支持物可以使用較強烈的顯色

10、方法。（五）離子交換層析離子交換樹脂的結(jié)構(gòu)如圖所示，功能基團種類較多。氨基酸的離子交換分離原理氨基酸的離子交換分離原理若pIpH 0，兩性離子帶凈正電荷，若pIpH 0，兩性離子帶凈負電荷，差值越大，所帶的凈電荷越多。氨基酸的分離過程氨基酸的分離過程用氨基酸自動分析儀分析氨基酸混合物的洗脫曲線（陽離子交換劑）。（六）氣液層析(七)高效液相層析HPLC分析氨基酸混合物的洗脫曲線 基本要求1.掌握氨基酸的一般結(jié)構(gòu)和氨基酸的分類；2.掌握氨基酸的酸堿性質(zhì)和等電點的計算方法；3.熟悉氨基酸的常見化學(xué)反應(yīng)的應(yīng)用價值；4.熟悉分離和分析氨基酸的常用方法。作業(yè)題作業(yè)題第155頁第2題；第155頁第3題；第1

11、55頁第5題；第155頁第6題；第155頁第7題；第155頁第8題；第155頁第9題；第156頁第14題；1. 第156頁第15題。 第4章蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)通論、蛋白質(zhì)通論(一)蛋白質(zhì)的化學(xué)組成和分類 蛋白質(zhì)的元素組成：C、H、O、N、S,其中含N平均為16%，這一數(shù)據(jù)可用于蛋白質(zhì)的含量測定。1.簡單蛋白 完全由氨基酸組成，不含非蛋白成分。 根據(jù)溶解性的不同，可將簡單蛋白分為7類：清蛋白（溶于水）、球蛋白（溶于稀鹽溶液）、谷蛋白（溶于稀酸或稀堿）、醇溶蛋白（溶于70%-80%的乙醇）、組蛋白（溶于水或稀酸，可用稀氨水沉淀）、精蛋白（溶于水或稀酸，不溶于氨水）和硬蛋白（只能溶于強酸）。2

12、.結(jié)合蛋白 由蛋白質(zhì)和非蛋白成分組成，后者稱為輔基。根據(jù)輔基的不同，可將結(jié)合蛋白分為以下7類：核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血紅素蛋白、黃素蛋白和金屬蛋白。 3.按蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能分類 （1）催化功能 生物體內(nèi)的酶都是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的，沒有酶，生物體內(nèi)的各種化學(xué)反應(yīng)就無法正常進行。 （2）結(jié)構(gòu)功能 蛋白質(zhì)可以作為生物體的結(jié)構(gòu)成分。高等動物的膠原蛋白是主要的細胞外結(jié)構(gòu)蛋白，占蛋白總量的1/4；細胞膜、線粒體、葉綠體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等膜系統(tǒng)都是由蛋白質(zhì)與脂類組成的；動物的毛發(fā)和指甲都是由角蛋白構(gòu)成的。 （3）運輸功能 脊椎動物的血紅蛋白和無脊椎動物的血藍蛋白起著運輸氧氣的作用；血液中的載脂蛋白可運輸脂肪

13、，轉(zhuǎn)鐵蛋白可轉(zhuǎn)運鐵；一些脂溶性激素的運輸也需要蛋白，如甲狀腺素要與甲狀腺素結(jié)合球蛋白結(jié)合才能在血液中運輸。 （4）貯存功能 某些蛋白質(zhì)的作用是貯存氨基酸作為生物體的養(yǎng)料和胚胎或幼兒生長發(fā)育的原料。此類蛋白質(zhì)包括蛋類中的卵清蛋白、奶類中的酪蛋白和小麥種子中的麥醇溶蛋白等。肝臟中的鐵蛋白可將血液中多余的鐵儲存起來，供缺鐵時使用。 （5）運動功能 肌肉中的肌球蛋白和肌動蛋白是運動系統(tǒng)的必要成分，它們構(gòu)象的改變引起肌肉的收縮，帶動機體運動。細菌中的鞭毛蛋白有類似的作用，它的收縮引起鞭毛的擺動，從而使細菌在水中游動。 （6）防御功能 高等動物的免疫反應(yīng)是機體的一種防御機能，它主要也是通過蛋白質(zhì)（抗體）來

14、實現(xiàn)的。凝血與纖溶系統(tǒng)的蛋白因子、溶菌酶、干擾素等，也擔(dān)負著防御和保護功能。 （7）調(diào)節(jié)功能 某些激素、一切激素受體和許多其他調(diào)節(jié)因子都是蛋白質(zhì)。 （8）感覺功能 生物體對信息的識別與傳遞過程也離不開蛋白質(zhì)。例如，感受味道需要味覺蛋白，視覺信息的傳遞要有視紫紅質(zhì)參與。視桿細胞中的視紫紅質(zhì)，只需1個光子即可被激發(fā)，產(chǎn)生視覺。 （9）遺傳調(diào)控功能 遺傳信息的儲存和表達都與蛋白質(zhì)有關(guān)。DNA在在染色體中是纏繞在蛋白質(zhì)（組蛋白）上的。有些蛋白質(zhì)，如阻遏蛋白，與特定基因的表達有關(guān)。半乳糖苷酶基因的表達受到一種阻遏蛋白的抑制，當(dāng)需要合成半乳糖苷酶時經(jīng)過去阻遏作用才能表達。 （10）其他功能 某些生物能合成

15、有毒的蛋白質(zhì)，用以攻擊或自衛(wèi)。白喉毒素可抑制真核生物的蛋白質(zhì)合成。蛋白質(zhì)的分類如表4-1,4-2,4-3所示（p158)。(二)蛋白質(zhì)的形狀和大小 按蛋白質(zhì)的形狀和溶解度可將蛋白質(zhì)分為：纖維狀蛋白質(zhì)、球狀蛋白質(zhì)和膜蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量差別很大。（肌聯(lián)蛋白）( (三) )蛋白質(zhì)構(gòu)象和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織層次 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可分為不同的結(jié)構(gòu)層次： 1.一級結(jié)構(gòu)：多肽鏈的氨基酸序列。 2.二級結(jié)構(gòu)：多肽鏈借助氫鍵形成的有規(guī)則的局部結(jié)構(gòu)，如螺旋、折疊等。 3.三級結(jié)構(gòu)：球狀蛋白質(zhì)在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，借助次級鍵形成的相對獨立的完整結(jié)構(gòu)。 4.四級結(jié)構(gòu)：具有三級結(jié)構(gòu)的組成單位（亞基）之間的聚合方式。

16、( (四) )蛋白質(zhì)功能的多樣性 蛋白質(zhì)序列的多樣性(P160)決定了其功能的多樣性。 如：20種氨基酸形成的二十肽（每種氨基酸只用1次）可以形成的異構(gòu)體為： 2020！=2=2 10101818 又如：相對分子質(zhì)量為34000的蛋白質(zhì)含12種氨基酸，假定在肽鏈的任一位置， 12種氨基酸出現(xiàn)的概率相等，則34000/120=283 1212283283 = 10 = 10305305 1.催化：大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)。 2.調(diào)節(jié)：如激素和反式作用因子。 3.轉(zhuǎn)運：如血紅蛋白、血清蛋白、載酯蛋白、膜轉(zhuǎn)運蛋白等。 4.貯存：如種子蛋白和卵清蛋白。 5.運動：如肌肉、微管蛋白等。 6.結(jié)構(gòu)成分：如角蛋白、

17、膠原蛋白等。 7.支架作用：如錨定蛋白、連接蛋白等。 8.防御和進攻：如抗體、毒蛋白等。 9.特殊功能：如甜蛋白、膠質(zhì)蛋白等。 二、肽（一）肽和肽鍵的結(jié)構(gòu) 肽鍵的C和N均為sp2雜化，有部分雙鍵的性質(zhì)，相關(guān)的6個原子處于共平面，稱作肽平面，肽平面內(nèi)兩個C多處于反式構(gòu)型。 （二）肽的物理和化學(xué)性質(zhì)肽的等電點計算需先分別判斷各解離基團的帶電荷情況，再統(tǒng)計凈電荷的量（P166表4-6）。 肽的化學(xué)反應(yīng)與氨基酸類似，同時，由于肽鍵的存在,肽可以進行雙縮脲反應(yīng)。NHCOCH2NHCOCHNHCOCH3CHCHOHCH2OHCHHNCNHCHCNHCH2CCOCHNHHOCH2NHNHCHCHCH3CH2

18、CH3COOOOCH2CH2SOOH鵝膏覃堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)（三）天然存在的活性肽主要有：肽類激素、肽類抗生素和肽類毒素。有關(guān)內(nèi)容將在后續(xù)章節(jié)介紹。環(huán)狀八肽，真核生物環(huán)狀八肽，真核生物RNARNA合成的抑制劑合成的抑制劑+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-Met-腦啡肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Leu-腦啡肽CysTyrILeGlnAsnCysProLeuGlyNH2SS牛催產(chǎn)素CysTyrGlnAsnCysProSSPheArgGlyNH2牛加壓素*均為9肽，僅2個氨基酸有差別，生理功能差別極大。L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-ValL

19、-OrnL-OrnL-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu短桿菌肽短桿菌肽S(S(環(huán)十肽環(huán)十肽) )由細菌分泌的多肽，含有由細菌分泌的多肽，含有D-D-氨基酸和一些不常氨基酸和一些不常見氨基酸，如鳥氨酸（見氨基酸，如鳥氨酸（Ornithine, Ornithine, 縮寫為縮寫為 OrnOrn）。）。 三、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定(一)蛋白質(zhì)測序的策略 1.確定蛋白質(zhì)的純度在97%以上。2.測定多肽鏈的數(shù)目。3.拆分多肽鏈。4.分析每一條多肽鏈的氨基酸組成。5.鑒定多肽鏈的N末端和C末端氨基酸殘基。6.用兩種以上方法裂解多肽鏈成較小的肽段。7.測定各肽段的氨基酸序列。8.拼接各肽段成完整的多

20、肽鏈。9.確定二硫鍵的位置。O2NFNO2+ H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸(二)N-末端和C-末端氨基酸殘基的鑒定1.N-末端的測定（1）二硝基氟苯(DNFB )法 (Sanger法):2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性條件下水解，得到黃色DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進行鑒定。N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2H

21、NCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸 （2）丹磺酰氯法:在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的優(yōu)點是丹磺酰-氨基酸有很強的熒光吸收，檢測靈敏度可以達到110-9mol,比DNFB法靈敏100倍。 （3）異硫氰酸苯酯(PITC)法: N末端氨基酸生成相應(yīng)的PTH（苯乙內(nèi)酰硫脲）AA，并脫離肽鏈，可連續(xù)測定N末端氨基酸，廣泛應(yīng)用于肽鏈的的氨基酸序列測定 。 （4）氨肽酶法：氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個水解肽鏈，釋放氨基酸。根據(jù)不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按

22、反應(yīng)時間和氨基酸殘基釋放量作動力學(xué)曲線，可以確定蛋白質(zhì)的N-末端殘基。2.C-末端的測定 （1）還原法。C末端氨基酸可用硼氫化鋰還原生成相應(yīng)的氨基醇。肽鏈水解后，再用層析法鑒定。 （2）肼解法。多肽與肼在無水條件下加熱，可以斷裂所有的肽鍵，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的酰肼化合物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離，C末端氨基酸可用紙層析鑒定。但精氨酸會變成鳥氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破壞。 H2NCHCROHNCHCROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCHCRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼

23、C-端氨基酸 （3）羧肽酶法。將蛋白質(zhì)在pH 8.0, 30與羧肽酶一起保溫，按一定時間間隔取樣，用紙層析測定釋放出來的氨基酸，根據(jù)氨基酸的量與時間的關(guān)系，就可以知道C末端氨基酸的排列順序。目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y；A和B來自胰臟；C來自柑桔葉；Y來自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸殘基；B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵。通常將二者混合使用。羧肽酶Y可作用于任何氨基酸，因而，除用來測定C末端氨基酸外，還可以用來測定氨基酸的排列順序。（三）二硫橋的斷裂 巰基化合物還原法過甲酸氧化法（四）氨基酸組成的分析 一般用酸水解，得到氨基酸混

24、合物，再分離測定氨基酸。目前用氨基酸自動分析儀，24小時即可完成。 蛋白質(zhì)的氨基酸組成，一般用每分子蛋白質(zhì)中所含的氨基酸分子數(shù)表示。不同種類的蛋白質(zhì)，其氨基酸組成相差很大。（五（五) )多肽鏈的多肽鏈的部分裂解和肽部分裂解和肽段混合物的分段混合物的分離純化離純化肽段的分離純化可用層析法或電泳法可以用酶水解法或化學(xué)水解法將蛋白質(zhì)水解成肽段 溴化氰斷裂法羥胺斷裂法：斷裂Asn-Gly之間的肽鍵，但專一性不強，也可以斷裂Asn-Leu和Asn-Ala之間的鍵. 1.Edman化學(xué)降解法: 用此原理已制成蛋白質(zhì)序列分析儀。若每次循環(huán)的準確度為99%，經(jīng)60次循環(huán)，準確度為：0.990.996060=0

25、.54=0.54(六)肽段氨基酸序列的測定 2.降解法：可用氨肽酶和羧肽酶，只能測出末端的幾個氨基酸。羧肽酶Y可作用于任何氨基酸，有可能以此為基礎(chǔ)開發(fā)出新的氨基酸的順序測定儀。 3.根據(jù)核苷酸序列推定法：分離mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄測定cDNA的核苷酸序列, 再用遺傳密碼推定氨基酸序列。 4.質(zhì)譜法：可分析微量的肽鏈，短肽在第一臺質(zhì)譜儀中經(jīng)電噴射電離，按荷質(zhì)比分離，依次在經(jīng)碰撞池被裂解成離子碎片，在第二臺質(zhì)譜儀中測出各個離子碎片的譜線，推算出短肽的氨基酸序列。在蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用廣泛，但不能區(qū)分亮氨酸和異亮氨酸。(七)肽段在多肽鏈中次序的決定肽段(八)二硫橋位置的確定用對角線電泳法(九)蛋白質(zhì)測序舉例

26、（胰島素的序列測定） （十）蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫 1.歐洲生物信息中心研究所和瑞士生物信息研究所共同管理的SWISS-PROT有10多萬條肽鏈的信息； 2.美國國家生物醫(yī)學(xué)基金會主持的PIR有近30萬條肽鏈的信息，但多數(shù)由核酸信息翻譯而來，有些未經(jīng)嚴格檢驗。 3.美國政府支持的Gen Bank和歐洲的 EMBL有大量的基因序列信息，從其閱讀框可以得到蛋白質(zhì)序列的不少信息。四、蛋白質(zhì)的氨基酸序列與生物功能（一）同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進化細胞色素C的物種差異（二）同源蛋白質(zhì)具有共同的進化起源1.血紅素蛋白與肌紅蛋白3.一些功能差異很大的蛋白質(zhì):如溶菌酶和-乳清蛋白功能差異很大,但有序列同源性。蛋白

27、質(zhì)家族的形成可能有趨同進化和趨異進化兩種機制。 2.絲氨酸蛋白酶類:顯示明顯的序列同源性。（三）血液凝固與氨基酸序列的局部斷裂1.血液凝固中的級聯(lián)過程12中蛋白質(zhì)凝血因子有7種是絲氨酸蛋白酶*與Ca2+結(jié)合促進凝血酶原與血小板膜結(jié)合，起始凝血酶原的激活帶凈負電荷帶凈負電荷五、肽與蛋白質(zhì)的人工合成（一）肽的人工合成氨基和羧基的保護羧基的活化常用的縮合劑是O,O-二環(huán)己基碳二亞(O,O-dicyclohexyl-carbodiimide,DCC)（二）固相肽合成 基本要求1.掌握蛋白質(zhì)的分類和功能多樣性；2.掌握肽的結(jié)構(gòu)特點和基本性質(zhì)；3.熟悉蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定方法；4.掌握蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與生物

28、學(xué)功能的關(guān)系，熟悉有關(guān)的典型例子。5.熟悉蛋白質(zhì)人工合成的基本步驟。作業(yè)題作業(yè)題第194頁第1題；第194頁第2題；第195頁第3題；第195頁第4題；第195頁第8題；1. 第196頁第10題。第第5 5章章 蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)三維結(jié)構(gòu) 一、研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的方法 (一)X射線衍射法基本規(guī)律：X射線穿過原子平面層時，當(dāng)光程差等于波長的倍數(shù)，反射波可以互相疊加形成衍射斑點。如圖5-2所示，光程差等于2dsin,上述規(guī)律可總結(jié)為Bragg方程： 2dsin=n(n=1, 2, 3)(二)研究溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的光譜學(xué)方法 1.紫外差光譜 芳香族氨基酸在極性環(huán)境下吸收峰向短波長移動，稱作籃移，反

29、之會紅移。2.熒光和熒光偏振 變性和非變性蛋白質(zhì)熒光峰和熒光偏振的位置會有特定的變化。3.圓二色性由尼科爾棱鏡產(chǎn)生由電光調(diào)制器產(chǎn)生圓偏振光可看成是相位相差90o的兩個平面偏振光疊加而成，若左、右圓偏振光因被測物的吸收而振幅不同，二者疊加會形成橢圓偏振光。橢圓率=短軸/長軸=tan33cl(適合于小的，=RL，c為摩爾濃度，l為光程，為摩爾吸光系數(shù)）摩爾橢圓率=/cl100=33004.核磁共振(NMR) 二、穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力 （三）疏水作用(熵效應(yīng))（四）鹽鍵（五）二硫鍵（一）氫鍵（二）范德華力定向效應(yīng) 誘導(dǎo)效應(yīng) 分散效應(yīng)三、多肽主鏈折疊的空間限制 （一）酰胺平面與-碳原子的二面角（

30、和）： 規(guī)定鍵兩側(cè)基團為順式排列時為0o，從C沿鍵軸方向觀察，順時針旋轉(zhuǎn)的角度為正值。（二）可允許的和：拉氏構(gòu)象圖(二)可允許的和值：拉氏構(gòu)象圖拉氏構(gòu)象圖 由印度學(xué)者Ramachandran制作四、二級結(jié)構(gòu)：多肽鏈折疊的規(guī)則方式(一)螺旋1.螺旋的結(jié)構(gòu) 多肽鏈中的各個肽平面圍繞同一軸旋轉(zhuǎn)，形成螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋一周，沿軸上升的距離即螺距為0.54nm,含3.6個氨基酸殘基；兩個氨基酸之間的距離為0.15nm; 肽鏈內(nèi)形成氫鍵，氫鍵的取向幾乎與軸平行，每一個氨基酸殘基的酰胺基團的-NH基與其后第四個氨基酸殘基酰胺基團的-CO基形成氫鍵。 蛋白質(zhì)分子為右手-螺旋。*3.613螺旋2.螺旋的偶極矩和帽化3.螺旋的手性4.影響螺旋形成的因素：R基太小使鍵角自由度過大，帶同種電荷的R基相互靠近，碳原子上有分支均不利于形成螺旋，含脯氨酸的肽段不能形成螺旋。5.其他類型的螺旋4.416螺旋 (二)折