免疫熒光技術(shù)常見(jiàn)問(wèn)題及分析

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上免疫熒光技術(shù)常見(jiàn)問(wèn)題及分析免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique )又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。主要是利用熒光標(biāo)記的抗體與待測(cè)抗原間反應(yīng)進(jìn)行抗原或者半抗原物質(zhì)定位的技術(shù)。本文總結(jié)了免疫熒光技術(shù)常見(jiàn)的問(wèn)題及解析。1、問(wèn)：近期要做免疫熒光雙標(biāo)，不知哪位有免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)的詳細(xì)步驟及其注意事項(xiàng)?參考見(jiàn)解：我正在做冰凍組織切片的免疫熒光雙染。我的經(jīng)驗(yàn)是：(1)選取一抗時(shí)要來(lái)源于兩種不同的動(dòng)物，我用的是來(lái)源于rabbit和rat的抗體，二抗則是不同熒光信號(hào)標(biāo)記的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(綠)和

2、donkey anti-rat-Tex-Red(紅)。(2)我的做法是兩種一抗同時(shí)孵育，然后兩種二抗同時(shí)孵育。抗體濃度、孵育時(shí)間要仔細(xì)摸索，我感覺(jué)一抗4度孵育過(guò)夜比較好，背景比較清晰。(3)我的陽(yáng)性對(duì)照用的是陽(yáng)性組織切片，陰性對(duì)照則分別是家兔和大鼠的IgG，熒光標(biāo)記物對(duì)照是PBS+熒光標(biāo)記物。(4)封閉血清與二抗來(lái)源動(dòng)物一致，我用的是10%的正常donkey血清。(5)其余步驟同一般免疫熒光單標(biāo)操作。2、問(wèn)：用免疫熒光方法做組織切片和培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的蛋白，兩者操作過(guò)程有哪些不同?參考見(jiàn)解：只是固定方法不同。細(xì)胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一樣的。3、問(wèn)：本人擬做Brdu標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)

3、胞免疫熒光，二抗為FITC標(biāo)記，想請(qǐng)教各位大俠：(1)抗體分裝和熒光顯微鏡觀察時(shí)是否一定要在暗室中進(jìn)行?(2)封片時(shí)是否用甘油緩沖液即可，還是用甘油和0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氫鹽緩沖液等量混合封片?(3)免疫酶染色中的3%過(guò)氧化氫及2N鹽酸是否還需要用?參考見(jiàn)解：(1)你的二抗是用FITC標(biāo)記的，為避免熒光分解，分裝及熒光顯微鏡觀察時(shí)均要避光;(2)封片最好用甘油加0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氫鹽緩沖液，后者能使玻片透明;(3)關(guān)于免疫酶染色，如果是用過(guò)氧化物酶做標(biāo)記，就必須用3%H2O2以去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;2N鹽酸需要使用，目的是使DNA變性，讓Brd

4、u抗體能夠充分地與已經(jīng)摻入的Brdu結(jié)合。4、問(wèn)：做間接法免疫熒光染色，如何設(shè)置對(duì)照?參考見(jiàn)解：最好是同一視野在未用熒光激發(fā)下進(jìn)行對(duì)照，看是否非特異性染色。(1)空白對(duì)照：如果你做的是石蠟切片免疫組化，這個(gè)對(duì)照必須有，目的是看自發(fā)熒光，脫蠟后直接在熒光顯微鏡下觀察。(2)陰性對(duì)照：標(biāo)本直接滴加二抗，呈陰性反應(yīng)。(3)抗原對(duì)照：標(biāo)本加同種動(dòng)物的未免疫血清，以PBS沖洗后，在加抗免疫球蛋白熒光抗體。因未免疫動(dòng)物的血清中無(wú)特異性抗體，應(yīng)呈陰性反應(yīng)。5、問(wèn)：我做乳腺組織的免疫熒光染色，結(jié)果用激光共聚焦顯微鏡看很好：有陽(yáng)性信號(hào)，陰性對(duì)照組也沒(méi)有熒光，但是拿到熒光顯微鏡下看，我的陰性對(duì)照組一片綠，像非特異性染色，到底哪個(gè)結(jié)果才是真實(shí)的呢?參考見(jiàn)解：激光共聚焦顯微鏡的分辨率比普通熒光顯微鏡要高的多，出現(xiàn)上述現(xiàn)象首先要排除熒光顯微鏡的問(wèn)題，如是不是紫外燈泡壽命到期了或者別的原因，熒光顯微鏡沒(méi)有問(wèn)題，那就以共聚焦顯微鏡的結(jié)果為主。免疫標(biāo)記法可分為以下幾類：熒光免疫法、放射免疫法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、偶聯(lián)生物素親和素系統(tǒng)的酶免法、時(shí)間分辨熒光免疫分析、解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)?/p>