小分子協(xié)助超高壓脲包法富集亞麻籽油中PUFA

1、第一章緒論1.1課題研究目的與意義亞麻籽油含豐富的不飽和脂肪酸，見表1.1，其中以亞油酸和亞麻酸為主的多不飽和脂肪酸(poly unsaturated fatty acids, PUFA含量高達60%以上。亞油 酸和亞麻酸是人體必需脂肪酸，其在治療皮炎、風濕性關(guān)節(jié)炎、心血管疾病、高 血壓、哮喘、過敏癥和抑制腫瘤生長方面具有一定功效2-5。且二者相互依存，相互聯(lián)系，共同調(diào)節(jié)生物體的生命活動 。因此，亞麻籽油中亞油酸和亞麻酸分 離純化或富集研究尤為重要?，F(xiàn)有研究對PUFA分離采用尿素包合法，這種方法 需在冷凍條件下包合20h以上7,8，設(shè)備簡單、易操作、得到的PUFA純度較高， 但是存在包合時間長

2、、產(chǎn)品收率低、單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid MUFA )與PUFA選擇性差等缺點。本課題擬用超高壓結(jié)晶改進傳統(tǒng)的冷凍包合 法，縮短包合時間、提高分離效率，并通過小分子協(xié)同改進不飽和脂肪酸的分離 選擇性。該研究對于高純度多不飽和脂肪酸的制備具有重要指導(dǎo)意義。表1.1亞麻籽油中主要脂肪酸組成、結(jié)構(gòu)及含量Tab 2.1 The main comp onent contain and structure in flaxseed oil名稱簡寫結(jié)構(gòu)含量(%)棕櫚酸C16: 0CH3（CH2）14COOH3.77.9硬脂酸C18: 0CH3（CH2）16COOH2.

3、06.5油酸C18: 1CH3（CH2）7CH=CH（CH 2）7COOH13.039.0亞油酸C18: 2CH3（CH2）4（CH=CHCH 2）3（CH2）3COOH12.030.0亞麻酸C18: 3CH3CH2 （CH=CHCH 2）3（CH2）6COOH39.062.01.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1 PUFA分離常用方法混合脂肪酸組分分子間存在特殊的氫鍵作用力，汽化溫度較高，屬于低揮發(fā)性、高沸點的熱敏性物質(zhì)，尤其是PUFA各組分間物理性質(zhì)差異較小，飽和脂肪 酸與單不飽和脂肪酸以及單不飽和脂肪酸與多不飽和脂肪酸分離較困難9,10。目前分離純化PUFA的方法有：分子蒸餾法、超臨界流體萃取技

4、術(shù)、脂肪酶濃縮法、 銀離子絡(luò)合法、冷凍結(jié)晶法、尿素包合法。分子蒸餾法分子蒸餾法是在絕對壓強1.33Pa0.0133Pa勺高真空條件下，利用混合脂肪酸各組分揮發(fā)性的不同而使其分離 11。傅紅 12等用多級分子蒸餾法提取深海魚 油中PUFA，通過控制壓力和溫度得到PUFA含量不同的各級魚油產(chǎn)品，其中高 碳鏈不飽和脂肪酸質(zhì)量分數(shù)最高可達 90.96%，且各理化指標均合格；徐世民 13 等用分子蒸餾法富集海狗油中的 PUFA，通過一級分子蒸餾法，控制適宜的溫度 和壓力，得到 EPA、DPA 和 DHA 的質(zhì)量分數(shù)為 54.86%的海狗油產(chǎn)品 ，收率 為92.7%； ZhangP等用分子蒸餾法富集沙棘籽

5、油中的不飽和脂肪酸，通過響應(yīng) 面試驗優(yōu)化得到不飽和脂肪酸含量和得率分別為82.38%、62.59%。分子蒸餾法蒸餾溫度低， 適合分離受熱易發(fā)生氧化的不飽和脂肪酸， 例如深海魚油、 海狗油 等，但此方法有一定的適用局限性，且需要較高的真空度，能耗較大。1.2.1.2 超臨界流體萃取技術(shù) 超臨界流體萃取技術(shù)是通過控制溫度和壓力使得混合脂肪酸各組分在超臨 界流體中溶解度發(fā)生較大變化，從而實現(xiàn)混合脂肪酸的分離。劉小莉 15利用超 臨界 CO2 萃取黑莓籽油，從萃取壓力、分離罐壓力、萃取罐溫度及萃取時間因 素優(yōu)化出最佳工藝條件， 在此條件下， 從黑莓籽油中萃取出的不飽和脂肪酸 （油 酸、亞油酸和亞麻酸）

6、含量為 78.18%，得率為（17.73±0.19）%； Webe嚴采用 超臨界 CO2 流體萃取法分離混合油（玉米油和魚油）中不同飽和程度的混合脂 肪酸乙酯，在優(yōu)化后的工藝條件下， 飽和及單不飽和脂肪酸優(yōu)先反應(yīng)生成甘油酯， 與未發(fā)生反應(yīng)的乙基酯部分實現(xiàn)良好的分離。肖豐坤17等用正交實驗法優(yōu)化超臨界 CO2 萃取工藝，得出滇牡丹籽油中亞 油酸和亞麻酸的含量為 89.34%，萃取率為 27.34%。由于超臨界流體萃取技術(shù)的 萃取劑常選用C02,故此方法可以保護不飽和脂肪酸使其不被氧化，但得率普遍偏低，在一定程度上造成資源的浪費，且不容易分離碳鏈長度相近的脂肪酸。1.2.1.3 脂肪酶濃

7、縮法由于脂肪酶會對混合脂肪酸甘油酯進行選擇性水解， 所以可以用來分離水解 速度不同的混合脂肪酸。蔡秋生18用脂肪酶酯化法精制金槍魚油中 DHA，使其 含量由 24%增加到 72%，用相同的方法進行二次精制，得到 DHA 含量為 91%， 回收率達60%； Haraldsson19】用脂肪酶催化酯化法從魚油中提取 EPA和DHA， 二者總含量由 24%提高至約 50%，回收率分別為 80%和 90%。脂肪酶濃縮法酶 催化效率高，反應(yīng)條件溫和，但反應(yīng)過程中水解、酯化等反應(yīng)環(huán)境復(fù)雜，且可逆 反應(yīng)不宜控制反應(yīng)方向。1.2.1.4 銀離子絡(luò)合法 銀離子可以與不飽和脂肪酸中的雙鍵形成親水性的極性絡(luò)合物，雙

8、鍵越多，結(jié)合力越強， 形成的絡(luò)合物越穩(wěn)定， 而飽和脂肪酸及飽和度低的脂肪酸則留在油 相中，故可以根據(jù)脂肪酸中雙鍵的個數(shù)分離混合脂肪酸。靳革 20等用銀離子絡(luò)合法富集核桃油中的不飽和脂肪酸甲酯，將不飽和脂肪酸含量由72.3%增加到96.3%；司秉坤21等用銀離子絡(luò)合法分離純化亞麻籽中a亞麻酸，a亞麻酸純度為 97.53%，得率不足 10%。此方法的優(yōu)點是分離效果較好，獲得的不飽和脂肪 酸純度較高，但產(chǎn)品產(chǎn)量小、成本高、重金屬回收率低且污染嚴重，不適宜大規(guī) 模生產(chǎn)。1.2.1.5 冷凍結(jié)晶法冷凍結(jié)晶法是根據(jù)在低溫條件下不同的脂肪酸在有機溶劑 （常用丙酮、 乙醇 等）中溶解度不同而實現(xiàn)分離的。冷凍結(jié)

9、晶法工藝簡單、操作過程方便，低溫環(huán) 境下可保護不飽和脂肪酸不被氧化， 但也有文獻報道低溫結(jié)晶法的分離效率較差 22，經(jīng)常與其他方法聯(lián)合使用才能達到較好的分離效果。1.2.1.6 尿素包合法在溫度較低的環(huán)境下， 溶解在有機溶劑中的尿素分子易與飽和或單不飽和脂 肪酸形成較穩(wěn)定的晶體包合物， 而多不飽和脂肪酸由于雙鍵具有一定的空間結(jié)構(gòu)， 彎曲折疊復(fù)雜， 不易被尿素包合， 采用過濾即可將不同的脂肪酸分離。 尿素包合 法的主要影響因素有尿素用量、結(jié)晶溫度、結(jié)晶時間和包合次數(shù)等 23。1.2.2 尿素包合法分離混合脂肪酸研究進展尿素包合法用于脂肪酸的分離效果受結(jié)晶溫度和尿素用量的影響， 結(jié)晶溫度 越低，尿

10、素用量越多，所得產(chǎn)品純度越高，得率越低，故現(xiàn)行尿素包合法一般研 究不同因素對包合效果的影響，并通過優(yōu)化包合工藝來提高產(chǎn)品的純度和得率。紫蘇油中a亞油酸純化時采用的包合溫度-20?C，包合時間為690 min 24; 油茶籽中油酸的制備時采用的尿素包合條件為：4?C保存16h,其油酸純度由80% 提高至 92%，回收率達 83% 25；瘋樹籽油中的飽和與不飽和脂肪酸分離時，尿 素與脂肪酸甲酯（w/w）比為0.75:1，包合溫度10C，包合時間20 h,非包合相 不飽和脂肪酸從 75.88%提高到 95.95%；麻瘋樹籽油中脂肪酸與尿素比例為1:5（w/w），在-10C下包合24 h,非包合物相中

11、亞油酸含量達92.81%,收率僅7.8%26; 劉卓華27用尿素包合法富集金槍魚中的 EPA和DHA時，總濃度達85.02%，收 率為 25.10%；何文兵28用尿素包合法富集燕麥麩中不飽和脂肪酸，脂肪酸 /尿素 /乙醇（w/w/w）為1:3:9, 0C條件下包合12 h,此條件下不飽和脂肪酸含量由原 來的40.66%提高至91.8%,得率為15.6%?？ㄗ延椭谢旌现舅嵩?C下包合 10 h,非包合相中亞油酸含量從原料中 40%提至70.07%,但仍有27.91%油酸未 被包合除去 ,而尿素包合物中除包合 53.70%油酸外，仍有 27.73%亞油酸被非選擇 性包合29。也有研究表明多次包

12、合可提高產(chǎn)品的純度，如月見草油中Y亞麻酸分離的最佳包合條件為-15 ?C, 60 h,包合3次，其y亞麻酸純度可達79%，收 率為 57%30；劉鳳霞31等對尿素包合法的工藝進行優(yōu)化后, 3次包合將月見草油中的亞麻酸純度從 78%提高到 90%以上，且包合 3 次、4 次、5 次的純度并無 顯著性差異；李煒 32等用尿素包合法對梔子油中的亞油酸進行富集，分3 次包合，在不同的溫度條件下分別包合 12h、8h、5h,亞油酸純度由5560%增加到 90.08%。以上研究可以看出脲包法對設(shè)備要求簡單、 易操作，但常需在低溫冷卻條件 下包合，存在包合時間長、產(chǎn)品收率低、單不飽和脂肪酸與 PUFA 選擇

13、性差等缺 點，加之大量尿素和溶劑使用， 造成溶劑回收成本高， 產(chǎn)品中有機溶劑殘留不易 去除，為此， 一些研究者對傳統(tǒng)的包合過程加以改進， 或聯(lián)合其它手段對傳統(tǒng)單 一的尿素包合法進行改性與提高。1.2.3 對傳統(tǒng)脲包法改進措施研究進展1.2.3.1 傳統(tǒng)脲包法過程改進 現(xiàn)尿素包合法分離混合脂肪酸大多是在傳統(tǒng)包合法的基礎(chǔ)上對尿素脂肪酸比例、包合溫度、包合時間等因素進行工藝優(yōu)化，提高其中一種脂肪酸的純度， 也有研究者將冷卻結(jié)晶過程中溫度因素進行詳細的分析，Maria K B 33研究表明尿素包合物晶體形成和不穩(wěn)定的溫度均在尿素熔點附近；Mary 34用兩種不同的主體分子包合相同的客體發(fā)現(xiàn)： 在尿素包

14、合物中， 熵和焓的變化共同影響尿素包 合物的形成和尿素包合物晶體熔化后液體的性質(zhì)；HayeS35研究了冷卻速率對晶體形態(tài)和大小的影響， 結(jié)果表明： 當緩慢降溫和快速降溫時， 兩種尿素包合物晶 體的形態(tài)無差別， 但大小有明顯的區(qū)別， 當非包合相中游離脂肪酸的回收率大于 60%時，飽和與多不飽和脂肪酸的選擇性不受冷卻速率的影響，但當回收率較低 時，緩慢降溫會增加多不飽和脂肪酸的純度。在尿素包合物結(jié)晶規(guī)律的基礎(chǔ)上， 一些學者對尿素包合物結(jié)晶工藝加以改進， 在冷卻工藝方面，Gu等24采用梯度冷卻脲包法來提純紫蘇籽油中PUFA, a-亞麻酸含量由 49%提高到 90%以上；王車禮等 36以攪拌梯度冷卻替

15、代傳統(tǒng)靜置冷 卻分離脂肪酸甲酯，其冷卻結(jié)晶周期由 5 C/18 h縮短至10 C/1 h左右。以上改 進措施在不飽和脂肪酸分離周期上有一定提高。1.2.3.2 其它方式協(xié)同脲包法純化 PUFA通過改進脲包法工藝參數(shù)或工藝步驟，一定程度上可以提高PUFA分離效率, 但采用單一方法較難得到高純度、高得率的 PUFA，而且易受工藝條件的限制使 得在實際應(yīng)用中有一定的局限性，因此可采用其它方法輔助脲包法分離富集 PUFA，以提高PUFA分離效率和分離選擇性，并達到大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的目的。 （ 1 ）超聲波輔助法有學者研究超聲功率和超聲時間對脂肪酸組成和含量的影響， 結(jié)果當超聲溫 度在50 C以下、超聲

16、功率w 900 W、超聲時間小于1 h時，超聲處理對紅花籽 油脂肪酸組成沒有影響，但對脂肪酸含量有較小的影響 37。張正紅38根據(jù)超聲波的空化作用原理，采用超聲尿素包合法富集大慶減壓 餾分油中的正構(gòu)烷烴，研究了活化劑、稀釋溶劑、尿素用量、包合溫度、超聲時 間等因素對正構(gòu)烷烴富集效果的影響，優(yōu)化出最佳工藝條件，超聲包合 20 min 即可將正構(gòu)烷烴的收率提高到 42.51%。簡化了反應(yīng)操作步驟、 縮短了反應(yīng)時間， 但得到的正構(gòu)烷烴產(chǎn)品中也有部分非正構(gòu)烷烴。有研究者首先采用超聲波法提取脂肪酸， 再用脲包法進一步分離純化 PUFA。 例如：韓玉璽 39采用超聲波輔助提取 GLA ，用脲包法純化 GL

17、A 并確定其最佳工 藝條件，考察液料比、超聲時間及超聲功率對 GLA 產(chǎn)量的影響，并采用二次旋 轉(zhuǎn)組合設(shè)計響應(yīng)面分析，得出最優(yōu)提取工藝，得率為899.26 mg/L,后繼續(xù)采用尿素包合法純化 GLA ，用正交實驗優(yōu)化出包合反應(yīng)的最佳條件： 脲脂比 4:1（w/w）、 脂肪酸：乙醇為1:12（w/w）、包合溫度為-25C、包合時間12 h,GLA含量為47.1%; 曲星源 40通過響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取紫菜中脂肪酸的工藝，粗脂肪含量最高 為（7.36± 0.026） %，再利用尿素包合法富集純化 EPA-DHA，通過單因素分析 尿素脂肪酸比例、包合溫度及包合時間對 DHA 富集效果的影

18、響，結(jié)果得出 EPA 和 DHA 的含量分別為 45.27%和 46.19%。（ 2）溶劑結(jié)晶輔助法白希 41把溶劑結(jié)晶法和尿素包合法相結(jié)合富集伽師瓜籽油中的亞油酸，將 亞油酸的純度由原油中的 62.56%提高到 99.53%，產(chǎn)率為 50.86%;安騰奇 42將 溶劑結(jié)晶和尿素包合法聯(lián)用，從 24度精煉棕櫚油水解脂肪酸中分離提純油酸， 溶劑結(jié)晶優(yōu)化后的最佳條件為：無水乙醇/混合脂肪酸（w/w）二2:1, -10 C結(jié)晶10 h;尿素包合的最佳條件為：原料酸/尿素/無水乙醇（w/w/w）比為1:2:10，包合 溫度10 C，包合時間6 h,通過溶劑結(jié)晶和尿素包合法相結(jié)合，油酸的純度43.74%

19、 為 87.56%，總得率為 38.65%。（ 3）超臨界流體萃取輔助法T J Lin 以鯡魚油為研究對象，將超臨界 CO2 萃取法與尿素包合法聯(lián)用，并 采用固定化酶催化反應(yīng)富集其中的 n-3 PUFA,含量為71.2%（其中EPA為29.4%， DHA 為 41.8%），得率為 80 . 1 %43 ;李毅麗44以玉米油為研究對象，利用超臨界 CO2流體萃取精餾技術(shù)，通過單因素試驗后并優(yōu)化，可使亞油酸含量達到69.70%, 在此基礎(chǔ)上結(jié)合尿素包合法繼續(xù)純化亞油酸， 在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行響應(yīng)面 分析得出最優(yōu)工藝：醇尿比（v/w）為5.5、尿脂比（w/w）為6.3、在14C包合14.5 h,

20、 得到亞油酸含量和回收率分別為 97.13%、 45.53%;曲曉宇 45等通過超臨界 CO2 流體萃取法提取東北柞蠶蛹油中的PUFA,并用尿素包合法對蠶蛹油中混合脂肪酸進一步純化，結(jié)果SFE-C02萃取后PUFA （油酸、亞油酸和a亞麻酸）的含量 為22.73%,在脂肪酸/尿素/甲醇（w/w/v）=1:3:10、-10C包合18 h條件下，純度達 到 84.08%，再次包合后純度達 95.70%；（4）低溫協(xié)同超高壓脲包法 潘見46等人研究發(fā)現(xiàn)超高壓脲包技術(shù)可以有效的提取植物油脫臭餾出物中 的脂肪酸、 VE 、角鯊烯等功能性物質(zhì)，且超高壓脲包工藝對脂肪酸損害較小， 與傳統(tǒng)脲包法相比，超高壓脲

21、包法大大的縮短了包合時間（20 hF h）;袁野47等采用低溫協(xié)同超高壓脲包法分離餾出物中飽和脂肪酸，即4C冷藏90 min后再施以 300 Mpa 壓力，產(chǎn)品中不飽和脂肪酸脂肪酸乙酯的含量從37.65%提高到60.01%，同時飽和脂肪酸乙酯總量從 15.22%減少到 2.83%。這也初步說明高壓 脲包法有望提高傳統(tǒng)脲包法的結(jié)晶分離周期。（ 5）羧酸分子輔助法HayeS48總結(jié)尿素可以與一些小分子形成不同螺旋結(jié)構(gòu)的尿素包合復(fù)合物， 例如雙羧酸或過氧化氫；國內(nèi)李奇曾將許多不同種類的陰離子 （如：NO3-、CO32- 及一些單羧酸和雙羧酸等）引入尿素 /硫脲/硒脲制備一系列尿素 /硫脲/硒脲-陰離 子主體晶格包合物 49，這些新復(fù)合主體晶格改變了尿素衍生物作為單一主體分 子的現(xiàn)狀， 改變了包合物中簡單的一維管狀結(jié)構(gòu)。 當在油酸存在下， 維甲酸或辛 伐他汀可順利插入尿素 -油酸晶格中，從而形成維甲酸 -尿素-油酸50或辛伐他汀 - 尿素-油酸51共晶而改善溶解度；酒石酸與尿素可形成有序的二維陰離子