一株高產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件（

1、一株高產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件* 基金項目：廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心建設(shè)項目（GCZX-B1103），廣東省教育部產(chǎn)學研結(jié)合項目（2012B091000040），廣東輕工職業(yè)技術(shù)學院自然科學啟動基金項目（KJ201307），廣東輕工職業(yè)技術(shù)學院自然科學啟動基金項目（KJ201203）。第一作者簡介：林玩莊（1994.11-），女，研究方向為生物技術(shù)。林玩莊，林淑娜，陳汶聰，劉榮蓮，黃可佳，黃丹敏，謝桂仁，陳宇豹，鄧毛程，王瑤，李靜廣東輕工職業(yè)技術(shù)學院，廣州，510300摘要：為了提高水產(chǎn)行業(yè)蛋白質(zhì)資源的綜合利用率，從南海海域大型魚類的腸道中篩選蛋白酶高產(chǎn)菌株。采用平板透明圈法和

2、搖瓶發(fā)酵法進行篩選，獲得一株蛋白酶高產(chǎn)菌株P(guān)E11。通過菌體形態(tài)觀察、生理生化實驗和16S rDNA鑒定，菌株P(guān)E11被鑒定為解淀粉芽孢桿菌 (Bacillus amyloliquefaciens)。通過搖瓶發(fā)酵試驗，優(yōu)選出可溶性淀粉和牛肉膏分別為最佳的碳源和氮源，并確定菌株P(guān)E11產(chǎn)蛋白酶的最佳條件為：溫度30 °C、初始pH7.0、轉(zhuǎn)速200 rpm和時間36 h。在最佳的產(chǎn)酶條件下，發(fā)酵液中的蛋白酶活力可達376 U/mL。關(guān)鍵詞：蛋白酶；高產(chǎn)；篩選；產(chǎn)酶條件Study on screening and enzyme-producing conditions of a high

3、 protease producing strainLING Wan-zhuang, LING Shu-Na, CHEN Wen-cong, LIU Rong-lian, HUANG Ke-jia, HUANG Dan-min, XIE Gui-ren, CHEN Yu-bao, DENG Mao-cheng, WANG Yao, LI Jing(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300)Abstract：In order to improve the comprehensive utilization rate of pro

4、tein resources from aquatic industry, strains having the ability to produce protease were isolated and screened from the gastrointestinal tract of large fish of South China Sea. Using flat transparent circle and shake flask fermentation test, a high producing protease strain PE11 was obtained. The s

5、train PE11 was identified as Bacillus amyloliquefaciens through the systematic investigations of morphology, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences analysis. By means of shake flask fermentation tests, the optimal carbon resource and nitrogen resource for strain PE11 we

6、re soluble starch and beef extract, respectively. In addition, the best conditions for protease-producing were determined as temperature of 30 °C, initial pH of 7.0 and rotation speed of 200 rpm. At the optimal condition, the highest protease activity of fermentation broth reached 376 U/mL.Key

7、words：protease；high producing；screening；enzyme-producing condition引言 近年來，我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖量和加工量一直居世界首位1-2。但是，在捕撈和加工過程中，低值水產(chǎn)品往往占總產(chǎn)量的30%50%3-4。如果這些低值水產(chǎn)品得不到高值化利用，將造成大量蛋白質(zhì)資源的浪費。隨著人們對低值水產(chǎn)品綜合利用的重視，蛋白酶及其高產(chǎn)菌種的應(yīng)用日益增加。為了直接利用高產(chǎn)蛋白酶菌種對低值水產(chǎn)品進行開發(fā)高值化產(chǎn)品，本實驗主要篩選蛋白酶高產(chǎn)菌種，以及初步研究所得菌種的產(chǎn)酶條件。1 材料與方法1.1 篩選材料與試劑 篩選材料：南海海域大型魚類的腸道組織；酪氨酸：

8、分析純，市售；Folin試劑及其它試劑：分析純，市售。1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基：葡萄糖 40 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母膏 5 g/L，Na2HPO4 2 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH7.0。分離平板培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g/L，酵母膏 5 g/L，脫脂奶粉 10 g/L，NaCl 1 g/L，瓊脂 10 g/L，pH7.0。斜面培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母膏 5 g/L，瓊脂 10 g/L，pH7.0。種子培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母膏 5 g/L，KH2PO4 2 g

9、/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH7.0?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 40 g/L，蛋白胨 5 g/L，K2HPO4 1.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH7.0。1.3 富集培養(yǎng)與平板初篩 用組織搗碎器將魚類腸道組織搗碎，取10 g接入200 mL的富集培養(yǎng)基中，于28 °C、200 rpm的條件下培養(yǎng)16 h。然后，將培養(yǎng)液進行梯度稀釋，涂布于分離平板培養(yǎng)基上，于28 °C培養(yǎng)48 h，挑取具有透明圈的菌落，接入斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，置于4 °C冰箱內(nèi)保藏，備用。1.4 搖瓶發(fā)酵篩選 將平板初篩所得各菌株的

10、斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，于26 °C、150 rpm的條件下培養(yǎng)12 h。然后，按10%的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于28 °C、200 rpm的條件下培養(yǎng)36 h。測定發(fā)酵液中的蛋白酶活力，篩選出高產(chǎn)菌株。1.5 高產(chǎn)菌株的鑒定 采用普通光學顯微鏡和掃描電鏡對菌體形態(tài)進行觀察，按Bergys Manual of Determinative for Bacteriology的方法對高產(chǎn)菌株的生理生化特征進行分析5，參考文獻介紹的16S rDNA鑒定方法對高產(chǎn)菌株進行分子生物學鑒定6-7。1.6 碳源和氮源對產(chǎn)酶的影響 改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源和氮源，分別以葡萄糖、蔗糖、

11、乳糖和可溶性淀粉為唯一碳源，分別以蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硫酸銨、尿素為唯一氮源，經(jīng)36 h搖瓶發(fā)酵，測定發(fā)酵液中的蛋白酶活力，根據(jù)結(jié)果選擇最佳的碳源和氮源。1.7 環(huán)境條件對產(chǎn)酶的影響 采用最佳的碳源和氮源配置發(fā)酵培養(yǎng)基，分別在不同的溫度、初始pH和搖瓶轉(zhuǎn)速下進行產(chǎn)酶發(fā)酵，測定各種環(huán)境條件下的蛋白酶活力，確定最佳的搖瓶發(fā)酵條件。1.8 產(chǎn)酶曲線的分析 在最佳的搖瓶發(fā)酵條件下進行產(chǎn)酶發(fā)酵，每隔6 h測定發(fā)酵液中蛋白酶活性，根據(jù)蛋白酶活力變化情況，確定最佳的產(chǎn)酶時間。1.9 蛋白酶活力的測定 采用GB/T 23527-2009中的Folin法測定發(fā)酵液中的蛋白酶活力8。樣品測定時，調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH

12、至7.5，于4°C、10000 rpm下離心去除菌體，以pH7.5的磷酸鹽緩沖液對上清液進行適當稀釋，取 1 mL稀釋液，加入1 mL酪蛋白溶液(10.0 g/L)，于40 °C水浴中反應(yīng)10 min，再加入1 mL三氯乙酸溶液(65.4 g/L)終止反應(yīng)，經(jīng)過濾，取1 mL濾液，加入5 mL碳酸鈉溶液(42.4 g/L)和1 mL Folin試劑，混勻，置于40 °C水浴中顯色反應(yīng)20 min，于680 nm波長下測定吸光值。在樣品測定前，先配制一系列標準濃度的酪氨酸溶液，取1 mL標準溶液，按上述方法進行顯色反應(yīng)，于680 nm波長下測定吸光值，以酪氨酸濃度為

13、橫坐標、吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線的回歸方程，計算樣品反應(yīng)液中的酪氨酸生成量，從而確定樣品的蛋白酶活力。蛋白酶活力的定義為：在pH7.5和40 °C的條件下，1 min水解酪蛋白生成1 µg酪氨酸為1個活力單位(U)。2 結(jié)果與討論2.1 酪氨酸的標準曲線 酪氨酸的標準曲線如圖1所示。其線性回歸方程為：y=0.0109 x + 0.0048，相關(guān)系數(shù)R2為0.9997。圖1 酪氨酸標準曲線Fig.1 Standard cure of tyrosine2.2 蛋白酶高產(chǎn)菌株的篩選 通過對富集培養(yǎng)液進行平板分離，共挑取32株在菌落周圍具有透明圈的菌株。采用搖瓶發(fā)

14、酵方法對各菌株進行復(fù)篩，其中蛋白酶活力較高的8株菌株的發(fā)酵結(jié)果如圖2所示。從圖2可看出，菌株P(guān)E11發(fā)酵液中的蛋白酶活力最高，故被選為進一步研究的菌株。圖2 8株菌的搖瓶發(fā)酵篩選結(jié)果Fig.2 Screen result of 8 strains with shake flask fermentation test2.3 菌種PE11的鑒定 在普通顯微鏡下，菌種PE11的革蘭氏染色陽性。其掃描電鏡(×10,000)的攝像如圖3所示，菌體呈桿狀，大小約為(2.64.7) µm × (0.5 0.6) µm。通過生理生化試驗，結(jié)果如表1所示。通過形態(tài)特征和生

15、理生化特征的分析，可初步判斷菌種PE11為芽孢桿菌屬。對菌種PE11的16S rDNA進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、測序，獲得1512 bp的序列，經(jīng)過在NCBI中對其同源性進行檢索，發(fā)現(xiàn)菌種PE11與解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的許多菌種的同源性達99%。其中，菌種PE11與Bacillus amyloliquefaciens V3 (登錄號:KJ123715.1)的親緣關(guān)系最近。采用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌種PE11的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所示。經(jīng)過16S rDNA分子生物學的分析，菌種PE11被進一步鑒定為解淀粉芽孢桿菌

16、。圖3 菌種PE11的掃描電鏡照片(×10,000)Fig. 3 SEM photographs of cell morphology of strain PE11 (×10,000)表1 生理生化試驗結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain PE11試驗項目反應(yīng)結(jié)果芽孢染色氧化酶接觸酶淀粉水解明膠液化酪素水解甲基紅試驗V-P試驗形成吲哚葡萄糖發(fā)酵檸檬酸利用硝酸鹽還原+-+注：“+”表示陽性，“-”表示陰性。圖4 菌種PE11的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The sequence phylo

17、genetic analysis of strain PE112.4 碳源和氮源對產(chǎn)蛋白酶的影響 分別以不同碳源和氮源配制培養(yǎng)基，發(fā)酵結(jié)果如圖5所示。對于不同碳源，有利于產(chǎn)蛋白酶的順序為：可溶性淀粉乳糖蔗糖葡萄糖 (見圖5A)。張竹慧等研究角蛋白酶產(chǎn)生菌的產(chǎn)酶特性時，同樣發(fā)現(xiàn)淀粉優(yōu)于葡萄糖9。對于能夠利用淀粉等慢速碳源的菌種，慢速碳源的代謝可能更加有利于酶的合成。從圖5B可以看出，有機氮源對蛋白酶產(chǎn)生的促進作用強于無機氮源，這可能與有機氮源含有誘導(dǎo)作用的肽鏈有關(guān)。在所用的氮源中，牛肉膏和蛋白胨的促進作用較為明顯，其中牛肉膏的促進效果最佳。實驗結(jié)果與文獻中一株枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的氮源篩選結(jié)果相

18、似10。圖5 碳源和氮源對產(chǎn)蛋白酶的影響（A：碳源；B：氮源）Fig.5 Effect of different carbon resource and nitrogen resource on yield of protease (A: carbon resource; B: nitrogen resource)2.5 環(huán)境條件對產(chǎn)蛋白酶的影響 以可溶性淀粉和牛肉膏配制培養(yǎng)基，分別在不同的溫度、初始pH和搖瓶轉(zhuǎn)速下進行發(fā)酵，產(chǎn)蛋白酶結(jié)果如圖6所示。溫度對菌種PE11的產(chǎn)蛋白酶有明顯的影響(見圖6A)，在30 °C下發(fā)酵的蛋白酶活力最高。從圖6B中可看出，初始pH過高或過低均不利于產(chǎn)

19、酶，在pH為7.07.5范圍內(nèi)的產(chǎn)酶效果較好，其中在初始pH為7.0下發(fā)酵的蛋白酶活力最高。從文獻報道來看，合成蛋白酶的發(fā)酵是好氧發(fā)酵11-12，因而搖瓶轉(zhuǎn)速可間接影響蛋白酶的合成。從圖6C中可看出，在搖瓶轉(zhuǎn)速50200 rpm的范圍內(nèi)，過低的搖瓶轉(zhuǎn)速不能滿足菌種對溶氧的需求，產(chǎn)酶效果隨轉(zhuǎn)速增加而呈上升的趨勢，200 rpm時的蛋白酶活力達到最高。當搖瓶轉(zhuǎn)速增加至一定程度后，繼續(xù)增加轉(zhuǎn)速并不一定能夠增大溶氧，菌體反而因激烈振蕩受到一定傷害，這可能是250 rpm時的蛋白酶活力略有下降的原因。因此，搖瓶發(fā)酵的最佳環(huán)境條件可確定為：溫度30 °C、初始pH7.0和轉(zhuǎn)速200 rpm。圖6

20、 環(huán)境條件對產(chǎn)蛋白酶的影響A：溫度；B：初始pH；C：轉(zhuǎn)速Fig. 6 Effect of fermentation conditions on yield of proteaseA: temperature; B: initial pH; C: rotation speed2.6 最佳條件下的產(chǎn)酶曲線 在最佳發(fā)酵條件下，菌種PE11的產(chǎn)蛋白酶時間曲線如圖7所示。從圖7可看出，當發(fā)酵時間為36 h，發(fā)酵液中蛋白酶活力達到最高，此時的蛋白酶活力為376 U/mL。此后，蛋白酶活力隨發(fā)酵時間延長而呈下降趨勢。因此，在本實驗條件下，最佳的產(chǎn)蛋白酶時間為36 h。經(jīng)查閱我國相關(guān)文獻，在蛋白酶活力的測定

21、方法和酶的活性單位定義的相同情況下，細菌發(fā)酵液中的最高蛋白酶活力大多居于100200 U/mL之間13-14，少數(shù)居于300400 U/mL之間15?，F(xiàn)對于上述文獻的報道，菌種PE11具有較強的蛋白酶產(chǎn)生能力。圖7 菌株P(guān)E11的產(chǎn)酶時間曲線Fig. 7 Time course of protease-producing of strain PE113 結(jié)論 以南海海域大型魚類的腸道組織為篩選材料，本實驗篩選獲得一株蛋白酶高產(chǎn)菌種PE11。通過菌體形態(tài)觀察、生理生化實驗和16S rDNA鑒定，菌株P(guān)E11被鑒定為解淀粉芽孢桿菌。通過篩選菌株P(guān)E11產(chǎn)蛋白酶的碳源和氮源，優(yōu)選可溶性淀粉和牛肉膏分

22、別為最佳的碳源和氮源。通過考察環(huán)境條件對菌株P(guān)E11產(chǎn)蛋白酶的影響，以及分析產(chǎn)酶時間曲線，確定了菌株P(guān)E11產(chǎn)蛋白酶的最佳條件為：溫度30 °C、初始pH7.0、轉(zhuǎn)速200 rpm和時間36 h。在最佳的產(chǎn)酶條件下，發(fā)酵液中的蛋白酶活力可達376 U/mL。菌種PE1具有較強的生產(chǎn)應(yīng)用的潛力，但仍需進一步提高其產(chǎn)酶量，以及研究所產(chǎn)蛋白酶的酶學性質(zhì)。參考文獻:1 韓麗娜. 中國水產(chǎn)品出口競爭力及發(fā)展策略研究J. 世界農(nóng)業(yè), 2014, 423(7): 78-81. 2 金火喜, 張治國, 郜海燕. 生物技術(shù)在水產(chǎn)品養(yǎng)殖、加工和保鮮中的應(yīng)用J. 生物技術(shù)進展, 2013, 3(6): 3

23、89-392. 3 俞麗娜, 邵興鋒. 蛋白酶在水產(chǎn)品加工中的應(yīng)用研究進展J. 生物技術(shù)進展, 2014, 4(1): 17-21. 4 李靜, 王瑤, 鄧毛程, 等. 羅非魚下腳料酶解制備呈味肽的研究J. 中國調(diào)味品, 2013, 38(12): 51-57. 5 Holt SG, Kriey NR, Sneath PHA, Staley JT, Williams ST, 1998. Bergys Manual of Determinative for Bacteriology. Williams and Wilkins, New York.6 劉旭輝, 楊亞晉, 蔡軍, 等. 豆粕發(fā)酵用高產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌的篩選及鑒定J. 飼料工業(yè), 2014, 35(8): 54-58. 7 Deng, M. C., Li J., Liang F. R., et al. 2014. Isolation