貝類毒素及其貝類毒素檢測的研究

1、導讀：貝類毒素及其貝類毒素檢測的研究，摘要：貝類中毒是由一些浮游藻類合成的多種毒素而引起的，這些藻類是貝類的食物,這些毒素在貝類中蓄積，通過生物測定、物理分析、免疫化學可測定貝類毒素，赤潮毒素對人類造成的危害事件日益增多，貝類毒素屬于海洋天然高分子有機化合物，它的形成與海洋中有毒素藻類赤潮密切相關，經過生物積累和放大轉化為有機毒素，即貝類毒素，因此開展對貝類毒素的研究對人類有重要意義，1貝類毒素貝類（南京財經大學食品科學與工程學院,江蘇南京，210000）摘要：貝類中毒是由一些浮游藻類合成的多種毒素而引起的，這些藻類是貝類的食物,這些毒素在貝類中蓄積。通過生物測定、物理分析、免疫化學可測定貝類

2、毒素。 關鍵詞：貝類；毒素；檢測；藻類；毒理效應；化學分析。Shellfish poison and shellfish toxin detection research(Nanjing University of Finance and Economics Institute of Food Science and Engineering，Nanjing 21000,Nanjing,China) Abstract: shellfish poisoning is by some planktonic algae synthesis of a variety of toxin and cause

3、, these algae is shellfish food, the poison in the shellfish accumulation. Through the bioassay, physical analysis, immune chemical measurement shellfish poison.Keywords: Shellfish; Poison; Detection; Algae, Toxicological effect; Chemical analysis. 20世紀50年代以后，海洋赤潮頻繁，赤潮毒素對人類造成的危害事件日益增多。貝類毒素屬于海洋天然高分子有

4、機化合物，它的形成與海洋中有毒素藻類赤潮密切相關。海洋微藻類是一種單細胞生物，在海洋食物鏈中處于最底層。在有利的環(huán)境下，一些藻類能迅速產生密集細胞濃度，即水華（bloom）。大量的水華會產生微黃色或微紅色的變色，被稱為赤潮。貝類通過濾食有毒微藻（主要是藻黃素），經過生物積累和放大轉化為有機毒素，即貝類毒素。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前我國已有241人死于麻痹性貝毒中毒。因此開展對貝類毒素的研究對人類有重要意義。1貝類毒素 貝類毒素是目前已知最毒的有機化合物，根據(jù)中毒癥狀及毒素傳遞類型，常見的海洋貝類毒素可分四種：麻痹性貝類毒素（PSP）、腹瀉性貝類毒素(DSP)、神經性貝類毒素（NSP）、失憶性貝類毒素

5、（ASP）。1.1麻痹性貝類毒素（PSP）因人食用了含這種毒素的貝類后會引起以外周神經肌肉系統(tǒng)麻痹為初始癥狀的中毒效應 而得名。目前已知貝類毒素中.分布最廣、毒性最強、對人類威脅最嚴重的毒素。這種毒素有 20種以上的天然衍生物。 PSP毒性強，其毒性是眼鏡蛇毒性的 80倍，對人的經口致死量 0.84 0.9mg。在國際條約中已被列為化學武器。目前還沒有針對麻痹性貝類中毒的特效解毒劑，因此人類攝入超過一定限量的 PSP時，其病死率達 100%。PSP最常見的生物是蛤和貽貝。偶爾也出現(xiàn)于布氏海菊蛤、扇貝和牡蠣。貽貝在接觸有毒海藻后可以在數(shù)天或數(shù)小時內獲得很強的毒性。并隨之很快消失毒性。因此，貽貝被

6、用作為預警 PSP指示生物。產生麻痹性貝毒素的赤潮藻類主要是甲藻中的亞歷山大藻屬種類和鏈狀裸甲藻等。通過對 2000種現(xiàn)存種類的雙鞭甲藻的評估，只有 30種會產生PSP。其主要來源包括：三種海產雙鞭甲藻屬. Alexandrium spp 、Pyrodinium spp 、Gymnodinium spp 。四種淡水藍綠藻 : Aphanizomenon flos-aquae 、Anabaena circinalis 、Lyngbya wollei 、Cylindrospermopsis raciborskii.麻痹性貝毒是一類神經肌肉麻痹劑，對人體的作用機理主要是阻斷細胞鈉離子通道。造成神經系

7、統(tǒng)傳輸障礙而產生麻痹作用。因毒素在貝類體內呈結合狀態(tài)，貝類攝入此毒素本身無害，當人食入后，毒素會迅速釋放并呈現(xiàn)毒性作用。類誤食了含有麻痹性毒素的貝類后，中毒癥狀是從嘴唇周圍發(fā)生輕微剌痛和麻木感，發(fā)展到全 身麻痹.并由于呼吸障礙而死亡。輕度嘴唇周圍有剌痛感和麻木感逐步擴大到面部和頸部手指尖和腳趾的針剌感覺，可有頭痛、眩暈和惡心。中度語無倫次，剌痛感發(fā)展至手臂和腿四肢強直和肢體失調，身衰弱和眩暈，輕度呼吸困難，脈搏加快。重度肌肉麻痹，明顯地呼吸困難，窒息感，在沒有呼吸機護理的條件下可能死亡。1.2腹瀉性貝類毒素 (DSP)腹瀉性貝類毒素是海洋中藻類產生的一類脂溶性次生代謝產物，因被人食用后產生以腹

8、瀉為特征的中毒效應而得名。貝類濾食后在其體內性質非常穩(wěn)定，一般的烹調加熱不能使其破壞。人類誤食會產生以腹瀉為主要特征的中毒癥狀，嚴重者可出現(xiàn)黃疸、急性萎縮性肝壞死，長期毒性效應可能導致癌癥。目前尚無特效解毒劑。一般采取對癥處理。盡管目前還沒有因 DSP中毒致死的報道，但由于 DSP中毒癥狀與細菌性胃腸炎類似，極易混淆，使其流行比預想的要嚴重。DSP是由甲藻產生的，屬于鰭藻屬和原甲藻屬?，F(xiàn)已證明產生DSP的藻類主要有 7種鰭藻屬fortii(日本)、acuminata(歐洲)Acuta 、norvegica(斯堪的納維亞)Mitra 、Rotundate、Triposs .4種原甲藻屬：小原甲藻

9、 (P.minimum) 、dinoflagellates Prorocentrum lima、ProrocentrumconcavRm(或P.maculosum)、Prorocentrum redfieldi. DSP的毒性機制主要在于其活性成分軟海綿酸(Okadaic Acid OA)能夠抑制細胞質中磷酸酶的活性，導致蛋白質過磷酸化，從而對生物的多種生理功能造成影響。對人類的毒性主要作用于人體的酶系統(tǒng)，對細胞蛋白磷脂酶有強烈的抑制作用，可以使人腸道發(fā)炎引起腹瀉。其主要癥狀是惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等胃腸道刺激癥狀。1.3神經性貝類毒（NSP）神經性貝類毒素主要是因貝類攝食短裸甲藻后在體內蓄積

10、，人類一旦食用這些染毒貝類便會引起以麻痹為主要特征的食物中毒，或在赤潮區(qū)吸入含有有毒藻類的氣霧，會引起氣喘、 咳嗽、呼吸困難等中毒癥狀而得名。神經性貝類毒素是貝類毒素中唯一的可以通過吸入導致中毒的毒素。經性貝毒是到目前為止危害范圍較小的一類毒素。主要表現(xiàn)為神經中毒的癥狀。 神經性貝類毒素主要來自于短裸甲藻 (Ptychodisus brevis)、劇毒岡比甲藻 (Gambierdiscums toxin-cus)等藻類。神經性貝類毒素屬于高度脂溶性毒素，結構為多環(huán)聚醚化合物，主要為短裸甲藻毒素。神經性貝類毒素的毒理與麻痹性毒素相似，作用于鈉通道，作用位點與石房蛤毒素不同。引起鈉通道維持開放狀態(tài)

11、，從而引起鈉離子內流，造成神經細胞膜去極化。1.4健忘性貝類毒素（ASP）健忘性貝類毒素是一種強烈的神經毒性物質，因可導致記憶功能的長久性損害而得名。中毒者表現(xiàn)出腸道癥狀和神經紊亂，嚴重的有短暫的記憶喪失現(xiàn)象。ASP直到 1987年才被發(fā)現(xiàn)，其引起中毒的成份是軟骨藻酸 (DA)。它是一種強烈的神經毒性非蛋白氨基酸，能導致短期記憶功能長久損害，半數(shù)致死量（LD50）為 10g/kg. 這些藻類主要生長在美國、加拿大、新西蘭等海域。在日本海域的微藻 Chondria armata也可導致健忘性貝類毒素的發(fā)生。軟骨藻酸是谷氨酸鹽的拮抗物，可作用于中樞神經系統(tǒng)紅藻酸受體，導致去極化、鈣的內流以及最終導

12、致細胞的死亡。軟骨藻酸與其它興奮性氨基酸如谷氨酸的協(xié)同作用可使提取物的毒性更強。2 貝類毒素的檢測方法 2.1小白鼠生物檢實驗法2目前世界上81%的國家采用此種方法檢測DSP和PSD，對于NSP和ASP的檢測有的國家也用 該方法。2.1.1麻痹性貝類毒素（PSP）的檢測小白鼠生物實驗法1937年由 Sommer等人建立了 PSP的小白鼠生物試驗法，該方法是目前惟一得到國際公認的AOAC標準生物檢測 PSP的方法。目前大約有 81%的國家采用該方法檢測 PSP。 取100150g組織,勻漿。再取 100g樣品加入 100mL的0.18mol/L的鹽酸，攪拌并調 pH值至 3.0左右加熱微沸 5m

13、in.冷卻至室溫再次調節(jié)pH在2.04.0。不得大于4.5。用酸水定容到 200mL。待上清液沉淀至呈半透明狀態(tài)后或 3 000 r/min離心5 min取上清，小白鼠腹腔注射。根據(jù)死亡時間。判斷毒性大小。結果以“鼠單位”(MU)來表示。 AOAC鼠單位的定義：使一只20g重的小白鼠腹腔注射后15min內死亡的毒素最小劑量即為一個鼠單位.1MU的毒素含量相當于0.18g的STX。該方法在概括樣品毒性方面相當有效.是目前最常用的分析、檢測方法。易掌握，不需要使用專門儀器.但也有較多的限制。如該法不能確定樣品中毒素結構，靈敏度低，其檢出限約40gSTXeq/100g貝肉.該法在標準程序中不同小鼠的

14、品系、批次、損傷程度和大小對毒素的靈敏度有很大的波動性，浪費較多的毒素和需使用活體動物，操作繁瑣等。2.12腹瀉性貝類毒素(DSP)的檢測小白鼠生物實驗法小鼠生物測定法是檢測貝類組織中DSP最普遍、常用的方法。該法是日本健康福利部提出的。是AOAC(美國官方化學師協(xié)會)標準方法。其測量單位是鼠單位(MU)。該方法最低檢出限量是0.05MU/g。換算為 DSP的毒力約為220g/kg。一個鼠單位(MU)是指腹腔注射 0.510mL毒素溶液后，在 24h內致體重1620g小鼠死亡的最小毒素量。在小鼠生物學檢測中，所有的 DSP成分都可能被檢測到，包括那些不引起腹瀉以及對人類毒性未知的毒素。 操作過

15、程為取200g樣品，取其中腸腺或者全部組織，用丙酮勻漿，過濾，減壓濃縮丙酮提取液再以乙醚溶解殘渣。水洗醚層，濃縮存留的脂質提取物，用1%的吐溫60生理鹽水懸浮提取物按小白鼠體重計大約每只20g腹腔注射，24h觀察存活情況，計算毒性。該方法的優(yōu)點是技術容易掌握，不需要使用專門儀器。主要缺陷是操作繁瑣。缺乏特異性(即不能鑒別 DSP毒素的各種成分)。動物死亡時間的判斷受主觀因素以及實驗室動物喂養(yǎng)情況的影響。另外。其它脂類的干擾可能得到錯誤的結果(特別是游離脂肪酸對小鼠毒性影響很大.而且整體提取和肝胰腺提取得到的結果不同。我國的商檢系統(tǒng)即使用的就是此方法。2.13神經性貝類毒素（NSP）的檢測小白鼠

16、生物實驗法取100g樣品先后兩次用300m L丙酮勻漿，過濾，丙酮提取液經56旋轉蒸發(fā)近干，其剩余物用100mL二氯甲烷溶解開移人500mL的分液漏斗中，輕輕搖動，靜置分層。二氯甲烷層經無水硫酸鈉過濾后，洗脫液再經蒸發(fā)干燥后的存留部分即為樣品脂質提取物。用 0.85%生理鹽水含1%吐溫60)將樣品脂質提取物懸浮，制備成相當于含樣品10g/mL濃度的懸浮液用于小白鼠腹腔注射，1mL/只。注射后觀察、記錄死亡時間。若小鼠中位數(shù)死亡時間小于8min稀釋提取液，重新注射。死亡時間大于930min，結果為小于0.1MU/g，死亡時間 8930min。結果按照死亡時間與小鼠單位換算表計。2.14失憶性貝類

17、毒素（ASP）的檢測小白鼠生物實驗法ASP的主要毒素成分是軟骨酸藻(DomoicA cid ,DA)。對DA的小白鼠生物試驗法類似于 PSP的毒性分析。只是時間延長至4h以上。用30%的甲醇溶液提取貝類中的貝毒，水浴加熱煮沸15min。自然冷卻到室溫.調整溶液pH6，3000 r/min離心 10min取上清，小白鼠腹腔注射，觀察存活情況，計算其毒力。1987年該方法首次應用于加拿大貝毒事件中分離出的微量DA的測定。結果顯示該方法對貝類組織中高濃度毒素成分的檢測十分成功。但該方法不適用于作用水平在20ug/g以下的組織情況。2.2 免疫化學法3免疫分析技術分為酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。放

18、射免疫分析（RIA）和血球凝聚等。 最常用的是直接競爭性ELISA（c-ELISA）。原理是：游離的麻痹性貝類毒素與麻痹性貝類毒素酶標記物競爭麻痹性貝類毒素抗體。同時麻痹性貝類毒素抗體與捕捉抗體連接。沒有被結合的酶標記物在洗滌步驟中被除去。結合的酶標記物將無色的發(fā)色劑轉化為藍色的產物。加入反應終止液后顏色由藍色變?yōu)辄S色.通過酶標儀測量吸光度值。樣品中麻痹性貝類毒素含量與吸光度值成反比。檢出限為0.03100g/孔 （0.31000g/ml）。本法對樣品處理要求較低干擾也少。而且快速、簡便、靈敏、特異、經濟。因此這種方法的推廣應用有著廣泛的前景。不足之處是對一些主要的衍生物有交叉反應或者反應不敏

19、感。2.3化學儀器分析2.3.1高效液相色譜（HPLC）檢測法HPLC法是九十年代PSP研究領域較成熟和普遍使用的理化檢測技術。是一種非?？焖俚姆椒?。是唯一能定性、定量檢測出各種毒素組分的技術，被認為可以與小鼠生物測定法互 換。通過堿性氧化作用將毒素分子氧化成有色的或熒光衍生物，再通過熒光或紫外光檢測系統(tǒng)進行分析，能對PSP的成分及毒力進行準確的分析和測定分為過柱氧化法和柱前氧化法。目前一些發(fā)達國家如荷蘭、加拿大等法定使用該法。HPLC法靈敏度和回收率高。專一性強檢出限低，檢出限比小鼠生物檢測法低，靈敏度是小白鼠分析法的 4400倍。達到1gSTX eq./100g，最低檢測值為0.525ng STX eq/100g。在酸性條件下不穩(wěn)定的基團如氨甲?；?，N一磺基在分析的過程中不會解離，縮短了分析時間，通過自動注射技術，能處理更多的樣品，便于進行毒素監(jiān)控，能提供關于毒素的更多信息.能測出每 1個組分的具體含量及毒性的大小。但HPLC法需要根據(jù)小鼠生物測定法進行廣泛的標定，而且該方法存在 PSP分析標準品全球缺乏的普遍問題，每種PSP類似物的毒性種類都是唯一的，很多類似物很容易相互轉化，對樣品中的原始或潛在總毒性作出判斷較困難的，需要昂貴的儀器。2.3.2分光光度法最早用于 PSP分析，原理是將毒素分子吸附到