志賀氏菌檢測(cè)

1、志賀氏菌檢測(cè)1 設(shè)備和材料 除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：1.1恒溫培養(yǎng)箱：36C±C；1.2冰箱：2C5C；1.3 膜過(guò)濾系統(tǒng)；1.4 厭氧培養(yǎng)裝置： 41.5C± 1C；1.5 電子天平：感量 0.1g；1.6顯微鏡：10X100X；1.7 均質(zhì)器；1.8 振蕩器；1.9無(wú)菌吸管：1ml （具0.01ml刻度）、10ml （具0.1ml刻度）或微量移液器及吸 頭；1.10 無(wú)菌均質(zhì)杯或無(wú)菌均質(zhì)袋：容量 500ml；1.11 無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑 90mm；1.12 pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙；1.13 全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。2 培養(yǎng)基和試

2、劑3.1 志賀氏菌增菌肉湯 -新生霉素：見(jiàn)附錄中 1。3.2 麥康凱（ MAC ）瓊脂：見(jiàn)附錄中 2。3.3 木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽（ XLD ）瓊脂：見(jiàn)附錄中 3。3.4三糖鐵（TSI）瓊脂：見(jiàn)附錄中4。3.5 營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面：見(jiàn)附錄中 5。3.6 半固體瓊脂：見(jiàn)附錄中 6。3.7 葡萄糖銨培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄中 7。3.8 尿素瓊脂：見(jiàn)附錄中 8。3.9 B -半乳糖苷酶培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄中9。3.10 氨基酸脫羧酶試驗(yàn)培 養(yǎng)基： 見(jiàn)附錄中 10。3.11 糖發(fā)酵管：見(jiàn)附錄中 11。3.12西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄中12。3.13粘液酸鹽培 養(yǎng)基: 見(jiàn)附錄中13。3.14蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑：見(jiàn)附錄

3、中14。3.15志賀氏菌屬診斷血清。3.16生化鑒定試劑盒。4操作步驟4.1增菌以無(wú)菌操作取檢樣25g （ml），加入裝有滅菌225ml志賀氏菌增菌肉湯的均質(zhì) 杯，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以8000r/min10000r/min均質(zhì)；或加入裝有225ml志賀 氏菌增菌肉湯的均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器連續(xù)均質(zhì)1min2min，液體樣品振蕩 混勻即可。于415C±1C，厭氧培養(yǎng)16h20h。4.2分離取增菌后的志賀氏增菌液分別劃線接種于XLD瓊脂平板和MAC瓊脂平板或 志賀氏菌顯色培養(yǎng)基平板上，于36C± 1C培養(yǎng)20h24h，觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng) 的菌落形態(tài)。宋內(nèi)氏志賀氏菌的單個(gè)菌落直

4、徑大于其他志賀氏菌。若出現(xiàn)的菌落不典型或菌落較小不易觀察，則繼續(xù)培養(yǎng)至 48h再進(jìn)行觀察。志賀氏菌在不同選 擇性瓊脂平板上的菌落特征見(jiàn)表1。表1志賀氏菌在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板志賀氏菌的菌落特征MAC瓊脂無(wú)色至淺粉紅色，半透明、光滑、濕潤(rùn)、圓形、邊緣整齊或戈不齊XLD瓊脂粉紅色至無(wú)色，半透明、光滑、濕潤(rùn)、圓形、邊緣整齊或不、齊4.3初步生化試驗(yàn)自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個(gè)以上典型或可疑菌落，分別接種TSI、半 固體和營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面各一管，置36C± 1C培養(yǎng)20h24h，分別觀察結(jié)果。凡是三糖鐵瓊脂中斜面產(chǎn)堿、底層產(chǎn)酸（發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵乳糖，蔗糖）、 不產(chǎn)氣（

5、福氏志賀氏菌6型可產(chǎn)生少量氣體）、不產(chǎn)硫化氫、半固體管中無(wú)動(dòng)力 的菌株，挑取其中已培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上生長(zhǎng)的菌苔，進(jìn)行生化試驗(yàn)和血清學(xué)分型。4.4生化試驗(yàn)及附加生化試驗(yàn)441生化試驗(yàn)用431中已培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上生長(zhǎng)的菌苔，進(jìn)行生化試驗(yàn)，即B-半乳糖苷酶、尿素、賴氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶以及水楊苷和七葉苷的分解試驗(yàn)。 除宋內(nèi)氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌13型的鳥(niǎo)氨酸陽(yáng)性；宋內(nèi)氏菌和痢疾志賀氏菌 1型，鮑氏志賀氏菌13型的B -半乳糖苷酶為陽(yáng)性以外，其余生化試驗(yàn)志賀氏菌屬 的培養(yǎng)物均為陰性結(jié)果。另外由于福氏志賀氏菌 6型的生化特性和痢疾志賀氏菌 或鮑氏志賀氏菌相似，必要時(shí)還需加做靛基質(zhì)、甘露醇、棉

6、子糖、甘油試驗(yàn)，也 可做革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗(yàn)， 應(yīng)為氧化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌。 生化反 應(yīng)不符合的菌株，即使能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集， 仍不得判定為志賀 氏菌屬。志賀氏菌屬生化特性見(jiàn)表2。表2志賀氏菌屬四個(gè)群的生化特征生化反應(yīng)A群：痢疾志賀氏菌B群：福氏志賀氏菌C群:鮑氏志賀氏菌D群：宋內(nèi)氏志賀氏菌3 -半乳糖苷酶_ a一a+尿素一一一一賴氨酸脫羧酶一一一一鳥(niǎo)氨酸脫羧酶一一b+水樣苷一一一一七葉苷一一一一靛基質(zhì)/+(+)一 /+一甘露醇一+c+棉子糖一+一+甘油(+)一(+)d注：+表示陽(yáng)性；一表示陰性；一 /+表示多數(shù)陰性；+/ 一表示多數(shù)陽(yáng)性；(+)表示遲緩陽(yáng)性；d表示有不

7、同生化型。a痢疾志賀1型和鮑氏13型為陽(yáng)性。b鮑氏13型為鳥(niǎo)氨酸陽(yáng)性。c福氏4型和6型常見(jiàn)甘露醇陰性變種。附加生化實(shí)驗(yàn)由于某些不活潑的大腸埃希氏菌(anaerogenic E.col)、A-D (Alkalescens-Disparbiotypes堿性-異型）菌的部分生化特征與志賀氏菌相似，并能與某種志賀氏 菌分型血清發(fā)生凝集；因此前面生化實(shí)驗(yàn)符合志賀氏菌屬生化特性的培養(yǎng)物還需 另加葡萄糖胺、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗(yàn)（36 C培養(yǎng)24h48h）。志賀氏菌屬和不活潑大腸埃希氏菌、A-D菌的生化特性區(qū)別見(jiàn)表3。表3志賀氏菌屬和不活潑大腸埃希氏菌、A-D菌的生化特性區(qū)別生化反應(yīng)A群：痢疾志賀氏菌

8、B群：福氏志賀氏菌C群：鮑氏志賀氏菌D群：宋內(nèi)氏志賀氏菌大腸埃希氏菌A-D菌葡萄糖胺一一一一+西蒙氏檸檬酸鹽一一一一dd粘液酸鹽一一一d+d注1: +表示陽(yáng)性；一表示陰性；d表示有不冋生化型。注2:在葡萄糖銨、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗(yàn)三項(xiàng)反應(yīng)中志賀氏菌一般為陰性，而不活潑的 大腸埃希氏菌、A-D （堿性-異型）菌至少有一項(xiàng)反應(yīng)為陽(yáng)性。如選擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)，可根據(jù) 432的初步 判斷結(jié)果，用431中已培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上生長(zhǎng)的菌苔， 使用生化鑒定試劑盒 或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。4.5血清學(xué)鑒定抗原的準(zhǔn)備志賀氏菌屬?zèng)]有動(dòng)力，所以沒(méi)有鞭毛抗原。志賀氏菌屬主要

9、有菌體（0）抗原。菌體0抗原又可分為型和群的特異性抗原。一般采用1.2%1.5%瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗(yàn)用的抗原。注1: 一些志賀氏菌如果因?yàn)镵抗原的存在而不出現(xiàn)凝集反應(yīng)時(shí)，可挑取菌 苔于1ml生理鹽水做成濃菌液，100C煮沸15min60mi n去除K抗原后再檢查。注2: D群志賀氏菌既可能是光滑型菌株也可能是粗糙型菌株，與其他志賀氏菌群抗原不存在交叉反應(yīng)。與腸桿菌科不同，宋內(nèi)氏志賀氏菌粗糙型菌株不一 定會(huì)自凝。宋內(nèi)氏志賀氏菌沒(méi)有 K抗原。凝集反應(yīng)在玻片上劃出2個(gè)約1cm x 2cm的區(qū)域，挑取一環(huán)待測(cè)菌，各放1/2環(huán)于玻片 上的每一區(qū)域上部，在其中一個(gè)區(qū)域下部加 1滴抗血清，在另一區(qū)域下

10、部加入1 滴生理鹽水， 作為對(duì)照。 再用無(wú)菌的接種環(huán)或針?lè)謩e將兩個(gè)區(qū)域內(nèi)的菌落研成乳 狀液。將玻片傾斜搖動(dòng)混合1min,并對(duì)著黑色背景進(jìn)行觀察，如果抗血清中出現(xiàn) 凝結(jié)成塊的顆粒，而且生理鹽水中沒(méi)有發(fā)生自凝現(xiàn)象，那么凝集反應(yīng)為陽(yáng)性。 如 果生理鹽水中出現(xiàn)凝集，視作為自凝。 這時(shí)，應(yīng)挑取同一培養(yǎng)基上的其他菌落繼 續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)。如果待測(cè)菌的生化特征符合志賀氏菌屬生化特征， 而其血清學(xué)試驗(yàn)為陰性的 話，則按 4.5.1 注1 進(jìn)行試驗(yàn)。附錄 培養(yǎng)基和試劑1 志賀氏菌增菌湯 -新生霉素（ Shigella broth）1.1 志賀氏菌增菌肉湯1.1.1 成分胰蛋白胨20.0g葡萄糖1.0g磷酸氫二鉀2.0

11、g磷酸二氫鉀2.0g氯化鈉5.0g吐溫801.5ml蒸餾水1000mlpH7.0±0.21.1.2 制法將以上成分混合加熱溶解，冷卻至25C左右校正pH，分裝適當(dāng)?shù)娜萜鳎?21C 滅菌15min，取出后冷卻至50 C55C，加入除菌過(guò)濾的新生霉素溶液（0.5卩 g/ml），分裝225ml備用。注：如不立即使用，在2C8C條件下可儲(chǔ)存一個(gè)月。1.2 新生霉素溶液1.2.1 成分新生霉素25.0mg蒸餾水1000ml1.2.2 制法將新生霉素溶解于蒸餾水中，用0.22卩m過(guò)濾膜除菌，如不立即使用，在2C8C 條件下可儲(chǔ)存一個(gè)月。1.3臨用時(shí)每225ml志賀氏菌增菌肉湯（1.1）加入5ml

12、新生霉素溶液（1.2），混勻2 麥康凱（ MAC ）瓊脂2.1 成分蛋白胨20.0g乳糖10.0g資料收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站刪除只供學(xué)習(xí)與交流3號(hào)膽鹽1.5g氯化鈉5.0g中性紅0.03g結(jié)晶紫0.001g瓊脂15.0g蒸餾水1000mlpH7.2±0.22.2 制法將以上成分混合加熱溶解，冷卻至25C左右校正pH，分裝，121C高壓滅菌 15min。冷卻至45C50C,傾注平板。注：如不立即使用，在2C8C條件下可儲(chǔ)存二周。3 木糖賴氨酸脫氧膽鹽（ XLD ）瓊脂3.1 成分酵母膏3.0gL-賴氨酸5.0g木糖3.75g乳糖7.5g蔗糖7.5g脫氧膽酸鈉1.0g氯化鈉5.0

13、g硫代硫酸鈉6.8g檸檬酸鐵銨0.8g酚紅0.08g瓊脂15.0g蒸餾水1000mlpH7.4±0.23.2 制法除酚紅和瓊脂外，將其他成分加入400ml蒸餾水中，煮沸溶解，校正pH。另 將瓊脂加入600ml蒸餾水中，煮沸溶解。將上述兩溶液混合均勻后，再加入指示劑，待冷至50C55C傾注平皿。注：本培養(yǎng)基不需要高壓滅菌，在制備過(guò)程中不宜過(guò)分加熱，避免降低其選 擇性，貯于室溫暗處。本培養(yǎng)基宜于當(dāng)天制備，第二天使用。使用前必須去除平 板表面上的水珠，在37C55C溫度下，瓊脂面向下、平板蓋亦向下烘干。另外 如配置好的培養(yǎng)基不立即使用，在2C8 C條件下可儲(chǔ)存二周。4三塘鐵（TSI）瓊脂4

14、.1 成分蛋白胨20.0g牛肉浸膏5.0g乳糖10.0g蔗糖10.0g葡萄糖1.0g硫酸亞鐵銨（NH4）2Fe（SO4） 6H2O 0.2g 氯化鈉5.0g硫代硫酸鈉0.2g酚紅0.025g瓊脂12.0g蒸餾水1000mlpH7.4±0.24.2 制法除酚紅和瓊脂外，將其他成分加于400ml蒸餾水中，攪拌均勻，靜置約10min, 加熱使完全溶化，冷卻至25E左右校正pH至7.4±0.2。另將瓊脂加于600ml蒸餾 水中，靜置約10mi n，加熱使完全溶化。將兩溶液混合均勻，加入 5%酚紅水溶液 5ml，混勻，分裝小號(hào)試管，每管約3ml。于121C滅菌15min，制成高層斜面

15、。 冷卻后呈桔紅色。如不立即使用，在 2C8C條件下可儲(chǔ)存一個(gè)月。5 營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面5.1 成分蛋白胨10.0g牛肉膏3.0g氯化鈉5.0g瓊脂15.0g蒸餾水1000mlpH7.0± 0.25.2 制法將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi)，加入 15%氫氧化鈉溶液約2ml，冷 卻至25C左右校正pH至7.0土 0.2。加入瓊脂，加熱煮沸，使瓊脂溶化。分裝小號(hào) 試管，每管約3ml。于121 °C滅菌15min，制成斜面。注：如不立即使用，在2C8C條件下可儲(chǔ)存二周。6 半固體瓊脂6.1 成分蛋白胨1.0g牛肉膏0.3g氯化鈉0.5g瓊脂0.3g0.7g蒸餾水100mlpH7.4

16、± 0.26.2 制法按以上成分配好，加熱溶解，校正 pH，分裝小試管，121C滅菌15min，直立凝固備用。7 葡萄糖胺培養(yǎng)基7.1 成分氯化鈉5.0g硫酸鎂(MgSO4 7H2O)0.2g磷酸二氫銨1.0g磷酸氫二鉀1.0g葡萄彈2.0g瓊脂20.0g0.2%溴麝香草酚藍(lán)水溶液40.0ml蒸餾水1000mlpH6.8±0.27.2 制法 先將鹽類和糖溶解于水內(nèi)，校正 pH ，再加入瓊脂加熱溶解，然后加入指示劑?；旌暇鶆蚝蠓盅b試管，121C高壓滅菌15min。制成斜面?zhèn)溆谩? 尿素瓊脂8.1 成分蛋白胨1.0g氯化鈉5.0g葡萄糖1.0g磷酸二氫鉀2.0g0.4%酚紅溶液

17、3.0ml瓊脂20.0g20%尿素溶液100.0ml蒸餾水1000mlpH將上述成分加入蒸餾水中，8.2 制法7.2 ±0.2煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝小試管，121C高壓滅菌15min。除酚紅和尿素外的其他成分加熱溶解，冷卻至 25C左右校正pH，加入酚紅 指示劑，混勻，于121C滅菌15min。冷至約55 C，加入用0.22卩m過(guò)濾膜除菌后 的20%尿素水溶液100ml，混勻，以無(wú)菌操作分裝滅菌試管，每管約 3ml4ml， 制成斜面后放冰箱備用。8.3 試驗(yàn)方法挑取瓊脂培養(yǎng)物接種，在36C±C培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。尿素酶陽(yáng)性者由于產(chǎn)堿而 使培養(yǎng)基變?yōu)榧t色。9 B -半乳糖

18、苷酶培養(yǎng)基9.1液體法（ONPG法）9.1.1 成分60.0mg鄰硝基苯B -D-半乳糖苷（ONPG）0.01mol/L 磷酸鈉緩沖液( pH7.5±0.2) 10.0ml1%蛋白胨水( pH7.5±0.2)30.0ml9.1.2 制法將ONPG溶于緩沖液內(nèi)，加入蛋白胨水，以過(guò)濾法除菌，分裝于10mmx 75mm 試管內(nèi)，每管0.5ml，用橡皮塞塞緊。9.1.3 試驗(yàn)方法自瓊脂斜面挑取培養(yǎng)物一滿環(huán)接種，于36C ± C培養(yǎng)1h3h和24h觀察結(jié)果。 如B -D-半乳糖苷酶產(chǎn)生，則于1h3h變黃色，如無(wú)此酶則24h不變色。9.2平板法(X-Gal法)9.2.1 成分

19、蛋白胨20.0g氯化鈉3.0g5-溴4氯-3-吲哚-B -D-半乳糖苷(X-Gal)200.0mg瓊脂15.0g蒸餾水1000mlpH7.2±0.29.2.2 制法將各成分加熱煮沸于1L水中，冷卻至25C左右校正pH, 115C高壓滅菌10min。傾注平板避光冷藏備用。9.2.3 試驗(yàn)方法挑取瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于平板， 劃線和點(diǎn)種均可，于36C± 1C培養(yǎng)18h 24h觀察結(jié)果。如果B -D-半乳糖苷酶產(chǎn)生，則平板上培養(yǎng)物顏色變藍(lán)色，如無(wú)此 酶則培養(yǎng)物為無(wú)色或不透明色，培養(yǎng) 48h72h后有部分轉(zhuǎn)為淡粉紅色。10 氨基酸脫羧酶試驗(yàn)培 養(yǎng)基10.1 成分蛋白胨5.0g酵母浸膏

20、3.0g葡萄糖1.0g1.6%溴甲酚紫 -乙醇溶液1.0mlL型或DL型賴氨酸和鳥(niǎo)氨酸0.5g/100ml或1.0g/100ml蒸餾水1000mlpH6.8±0.210.2 制法除氨基酸以外的成分加熱溶解后，分裝每瓶 100ml，分別加入賴氨酸和鳥(niǎo)氨 酸。L-氨基酸按0.5%加入，DL-氨基酸按1%加入，再校正pH至6.8土 0.2。對(duì)照培 養(yǎng)基不加氨基酸。分裝于滅菌的小試管內(nèi)，每管0.5ml，上面滴加一層石蠟油，115°C高壓滅菌10mi n。10.3 試驗(yàn)方法從瓊脂斜面上挑取培養(yǎng)物接種，于36C± 1C培養(yǎng)18h24h,觀察結(jié)果。氨 基酸脫羧酶陽(yáng)性者由于產(chǎn)堿，

21、培養(yǎng)基應(yīng)呈紫色。 陰性者無(wú)堿性產(chǎn)物， 但因葡萄糖 產(chǎn)酸而使培養(yǎng)基變?yōu)辄S色。陰性對(duì)照管應(yīng)為黃色，空白對(duì)照管為紫色。11 糖發(fā)酵管11.1 成分牛肉膏5.0g蛋白胨10.0g氯化鈉3.0g磷酸氫二鈉(Na2HPO4 12H2O)2.0g0.2%溴麝香草酚藍(lán)溶液12.0ml蒸餾水1000mlpH7.4± 0.211.2 制法葡萄糖發(fā)酵管按上述成分配好后， 按0.5%加入葡萄糖，25C左右校正pH， 分裝于有一個(gè)倒置小管的小試管內(nèi)，121C高壓滅菌15min。其他各種糖發(fā)酵管可按上述成分配好后 ，分裝每瓶100ml，121C高壓滅菌 15min。另將各種糖類分別配好10%溶液，同時(shí)高壓滅菌。

22、將5ml糖溶液加入于 100ml培養(yǎng)基內(nèi)，以無(wú)菌操作分裝小試管。注：蔗糖不純 ,加熱后會(huì)自行水解者，應(yīng)采用過(guò)濾法除菌。11.3 試驗(yàn)方法從瓊脂斜面上挑取小量培養(yǎng)物接種，于36 C± C培養(yǎng)，一般2d3d。遲緩反應(yīng)需觀察 14d 30d。12 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基12.1 成分氯化鈉5.0g硫酸鎂(MgS04 7H2O)0.2g磷酸二氫銨1.0g磷酸氫二鉀1.0g檸檬酸鈉5.0g瓊脂20g0.2%溴麝香草酚藍(lán)溶液40.0ml蒸餾水1000mlpH6.8±0.212.2 制法先將鹽類溶解于水內(nèi)，調(diào)至pH，加入瓊脂，加熱溶化。然后加入指示劑，混合均勻后分裝試管，121 °C火菌15 min。制成斜面?zhèn)溆谩?2.3 試驗(yàn)方法挑取少量瓊脂培養(yǎng)物接種，于F 36C± 1C培養(yǎng)4d，每天觀察結(jié)果。陽(yáng)性者斜面上有菌落生長(zhǎng)，培養(yǎng)基從綠色轉(zhuǎn)為藍(lán)色。13 粘液酸鹽培養(yǎng)基13.1 測(cè)試肉湯13.1.1 成分酪蛋白胨1