CCK原理優(yōu)勢(shì)步驟

1、檢測(cè)原理： ? Cell Counting Kit 簡(jiǎn)稱(chēng) CCK試劑盒，是一種基于 WST-8（化學(xué)名： 2-(2- 甲氧基-4- 硝苯基 )-3-(4-硝苯基 )-5-(2,4-二磺基苯 )-2H- 四唑單鈉鹽）的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒。 WST-8 屬于 MTT的升級(jí)產(chǎn)品，工作原理為：在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線(xiàn)粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物（ formazan ）。顏色的深淺與細(xì)胞的增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。使用酶標(biāo)儀在 450mM波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。 CCK法應(yīng)用非常廣泛，如藥物篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性

2、測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)以及生物因子的活性檢測(cè)等。CCK方法的優(yōu)勢(shì)： ? 表 1 CCK法與其他細(xì)胞增殖/ 毒性檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)比較檢測(cè)方法MTT法XTT法WST-1法CCK法甲臜產(chǎn)物的水差（需加有機(jī)溶劑溶解好好好溶性再檢測(cè)）產(chǎn)品性狀粉末2 瓶溶液溶液1 瓶溶液使用方法配成溶液后使用現(xiàn)配現(xiàn)用即開(kāi)即用即開(kāi)即用檢測(cè)靈敏度高很高很高高檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)較短較短最短檢測(cè)波長(zhǎng)560-600nm420-480nm420-480nm430-490nm很低，細(xì)胞形很低，細(xì)胞形很低，細(xì)胞形細(xì)胞毒性高，細(xì)胞形態(tài)完全消失態(tài)不變態(tài)不變態(tài)不變?cè)噭┓€(wěn)定性一般較差一般很好批量樣品檢測(cè)可以非常適合非常適合非常適合便捷程度一般便捷便捷非常便

3、捷 酚紅和血清對(duì)CCK法的檢測(cè)不會(huì)造成干擾； 細(xì)胞毒性非常低， 因此加入 WST-8顯色后， 可以在不同時(shí)間反復(fù)用酶標(biāo)儀讀數(shù)從而找到最佳測(cè)定時(shí)間。CCK法的操作步驟（更多內(nèi)容請(qǐng)見(jiàn)說(shuō)明書(shū)）：實(shí)驗(yàn)一：細(xì)胞活性檢測(cè)1、在 96 孔板中接種細(xì)胞懸液 （ 100 L/ 孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（ 37 ,5%CO2）。2、向每孔加入10 L CCK溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)）。3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4 小時(shí)。4、用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。5、若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10 L 0.1M 的 HCL溶液或者 1%w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板

4、避光保存在室溫條件下。24 小時(shí)內(nèi)測(cè)定， 吸光度不會(huì)發(fā)生變化。實(shí)驗(yàn)二：細(xì)胞增殖- 毒性檢測(cè)1、在 96 孔板中配置100 L 的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 小時(shí)（ 37，5% CO2）。2、向培養(yǎng)板加入10L 不同濃度的待測(cè)物質(zhì)。3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（例如：6、12、24 或 48 小時(shí)）。4、向每孔加入10 L CCK溶液（注意不要再孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)）。5、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4 小時(shí)。6、用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。7、若暫時(shí)不測(cè)定 OD值，可以向每孔中加入溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。10 L 0.1M 的 HCL溶液或者 1%w/v SDS24 小時(shí)內(nèi)測(cè)定， 吸光度不會(huì)發(fā)生變化。注意：如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話(huà)，可在加 CCK之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。活力計(jì)算：細(xì)胞活力 * （） =A( 加藥 )-A （空白） /A （ 0 加藥） -A （空白） × 100A（加藥）：具有細(xì)胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK溶液而沒(méi)有細(xì)胞的孔的吸光度A（