LSP1基因多態(tài)性與膀胱癌的關(guān)聯(lián)分析及LSP1在膀胱癌中的表達(dá)及意義

1、LSP1基因多態(tài)性與膀胱癌的關(guān)聯(lián)分析及LSP1在膀胱癌中的表達(dá)及意義第一部分 :LSP1 基因多態(tài)性 rs907611 與膀胱癌的相關(guān)性分析目的: 研究白細(xì)胞特異性蛋白 1(Leukocyte-specific protein 1,LSP1)單核苷酸多態(tài)性rs907611 與天津地區(qū)漢族人群膀胱尿路上皮癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。方法: 收集2012 年 5 月至 2014 年 6 月在天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院初次確診的535 例膀胱尿路上皮癌患者的血液及649 例對(duì)照組人群 ( 與病例組年齡、性別相匹配的正常體檢人群 ) 的血液進(jìn)行研究 , 提取全血基因組DNA,應(yīng)用 PCR-LDR方法進(jìn)行基因分型。首

2、先檢驗(yàn)分型結(jié)果是否遵循HWE平衡定律 , 然后采用多因素非條件logistic回歸檢驗(yàn)來(lái)分析 rs907611 基因型與天津漢族人群膀胱癌易感性、分期、分級(jí)、吸煙及進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性 ; 應(yīng)用 Kaplan-Meier曲線和 COX回歸模型來(lái)分析rs907611基因型與膀胱癌短期復(fù)發(fā)的相關(guān)性。結(jié)果 : 分型結(jié)果符合 HWE平衡定律 (p>0.05)。LSP1 rs907611 存在三種基因型 : 野生型 (G/G) 、突變雜合子 (G/A) 及突變純合子 (A/A) 。以野生型 (G/G) 基因型為對(duì)照 , 突變純合子 (A/A) 人群膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯提高(p=0.036,OR=

3、1.786,95%CI 1.038-3.072),突變型 (G/A+A/A) 人群中膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)也有輕微升高 (p=0.049,OR=1.264,95%CI 1.001-1.596);與 G等位基因相比 ,A 等位基因與膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在明顯的相關(guān)性(p=0.019,OR=1.264,95%CI1.038-1.538)。分層分析結(jié)果顯示rs907611 與膀胱癌分期分級(jí)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)沒(méi)有明顯的相關(guān)性。另外 , 結(jié)果顯示 rs907611 對(duì)吸煙人群膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)沒(méi)有影響。結(jié)合隨訪數(shù)據(jù)進(jìn)行分析 , 沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這 rs907611 與非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的短期復(fù)發(fā)存在相關(guān)性。結(jié)論 :LSP1 基因

4、 rs907611 位點(diǎn)基因突變可顯著增加天津地區(qū)漢族人群膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn) , 尤其與低級(jí)別、非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的發(fā)生關(guān)系密切。這一基因并不會(huì)影響吸煙患者膀胱癌的發(fā)病率, 也與天津地區(qū)漢族人群膀胱癌的短期復(fù)發(fā)沒(méi)有顯著地相關(guān)性。 第二部分 : 膀胱癌易感位點(diǎn)LSP1rs907611 的功能分析目的 :通過(guò)研究 rs907611 多態(tài)性位點(diǎn)周?chē)虻谋磉_(dá)量與rs907611 基因型的相關(guān)性來(lái)篩選單核苷酸多態(tài)性rs907611 的靶基因 , 從而進(jìn)一步探討 rs907611 增加膀胱癌易感性的作用機(jī)制。方法 : 在 UCSC Genome Browser中檢索 rs907611 位點(diǎn)兩側(cè)各 250k

5、bp 范圍內(nèi)的基因 ( 包括 DNA、microRNA和 lincRNA) 。從我實(shí)驗(yàn)室膀胱癌標(biāo)本庫(kù)中隨機(jī)選擇與 rs907611 的三種基因型相對(duì)應(yīng)的患者的膀胱癌及癌旁組織標(biāo)本共24 對(duì), 其中G/G基因型 10 對(duì)、 G/A 及 A/A 基因型各 7 對(duì), 提取組織 RNA,應(yīng)用實(shí)時(shí)定量 Q-PCR的方法檢測(cè)相應(yīng)基因的表達(dá)情況。結(jié)果: 在 rs907611 兩側(cè) 500kbp 范圍內(nèi)共存在21 個(gè)基因 , 其中 DNA包括 KRTAP5-3、KRTAP5-4、KRTAP5-5、KRTAP5-6、IFITM10、SYT8、TNNI2、LSP1、CTSD、TNNT3、HOTS和 MRPL23;

6、microRNA包括 MIR4298、MIR7847和 MIR675;lincRNA 包括 MRPL23-AS1、FAM99A、FAM99B、 H19、Linc01219 及Linc01150 。Q-PCR結(jié)果顯示以上所有基因的表達(dá)量與rs907611 的基因型均沒(méi)有明顯的相關(guān)性 (p>0.05);但是我們發(fā)現(xiàn)癌組織中LSP1及 MIR7847的表達(dá)量明顯低于癌旁組織 (p<0.05),癌組織中 H19和 MIR675的表達(dá)量明顯高于癌旁組織(p<0.05)。結(jié)論 : 在 LSP1基因多態(tài)性 rs907611 位點(diǎn)周?chē)?500kbp 范圍內(nèi)沒(méi)有rs90

7、7611 的靶基因 ;LSP1 及 MIR7847在癌組織中明顯低表達(dá) , 而 H19和 MIR675在膀胱癌組織中明顯高表達(dá)。第三部分:LSP1 在膀胱癌中的表達(dá)及意義目的: 研究 LSP1在膀胱癌中的表達(dá)水平 , 并初步探討 LSP1對(duì)膀胱癌細(xì)胞的影響。方法 : 應(yīng)用免疫組化和 western-blot 技術(shù)檢測(cè)膀胱癌組織及癌旁正常膀胱黏膜 LSP1的表達(dá)情況。構(gòu)建 LSP1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒 , 轉(zhuǎn)染 T24膀胱癌細(xì)胞 , 應(yīng)用 Q-PCR、Western-blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果 , 應(yīng)用 MTT、流式細(xì)胞術(shù)、劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè) LSP1對(duì)膀胱癌細(xì)胞的增殖、 凋亡、遷移及侵襲的影響。 結(jié)果 : 免疫組化和Western-blot結(jié)果顯示 LSP1在膀胱癌組織中明顯低表達(dá)。我們成功構(gòu)建 pcDNA3.1(+)/LSP1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒并順利轉(zhuǎn)染T24 膀胱癌細(xì)胞 ;MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染 LSP1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后 T24 細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制 ; 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示出 T24 細(xì)胞中 LSP1過(guò)表達(dá)后細(xì)胞凋亡明顯增加 ; 劃