親和層析介質使用說明書

1、GST親和層析介質使用說明書一、   簡介 GST親和層析介質（GST Agarose）是專門設計用于純化谷胱甘肽S-轉移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽轉移酶以及與谷胱甘肽有親和作用蛋白的分離介質，一步分離就可得到高純度的GST融合目標蛋白，純化條件溫和，可以保證蛋白的活性。 本產(chǎn)品是自主設計合成的GST瓊脂糖凝膠，具有優(yōu)良的物理和化學穩(wěn)定性，使用壽命長，操作方便，批次重復性好，易于放大，是研發(fā)與生產(chǎn)的理想選擇。二、   性能參數(shù)特點基團密度高，載量大基質6%的交聯(lián)瓊脂糖凝膠吸附載量15mg GST融合蛋白（55kDa）/ml介質平均粒徑100m最大

2、流速300cm/hpH范圍310，在位清洗時pH范圍可到211使用溫度常溫保存溫度+48保存液體20%乙醇化學穩(wěn)定性室溫下可在0.1M檸檬酸(pH 4.0)，0.1 M NaOH，70%乙醇或6M鹽酸胍中耐受2h，蛋白結合能力不受影響三、   適用范圍 分離谷胱甘肽S-轉移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽轉移酶以及與谷胱甘肽有親和作用的蛋白。四、   操作說明1.  緩沖液配制       緩沖液A（平衡緩沖液）：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaC

3、l，2.7mM KCl，調節(jié)pH值至8.0。       緩沖液B（洗脫緩沖液）：10mM Glutathione（還原型），50mM Tris-HCl，調節(jié)pH值至8.0。因Glutathione易氧   化，需現(xiàn)用現(xiàn)配。（注：各種溶液配制完畢后，最好進行脫氣處理，0.45 m濾膜過濾備用)。2.  樣品預處理：按每克濕重菌體/25ml平衡緩沖液的比例充分懸浮離心收集的菌體；600w功率，每循環(huán)超聲3s，冷卻3s，循環(huán)99×3次,破碎菌體；4、15000rpm離心15m，收集上清液，或用0.4

4、5m濾膜過濾。3.   裝柱：       聚苯乙烯層析柱1)  將層析柱固定在鐵架臺或層析架上，封閉層析柱下端出口，向柱內充入純水，排開層析柱內空氣，先將墊片完全浸沒于水面下方，在保持水平的狀態(tài)下，小心推向底部，避免墊片下方滯留氣泡。2)  打開層析柱下端出口，排出柱中純水；在液面低至距墊片11.5cm高度時封閉下端出口，用移液槍按需要量吸取介質，或用玻璃棒緊靠柱子內壁引流，將介質加入到層析柱中；靜置30min，讓介質自然沉降。3)  從上端管

5、口將另一墊片緩慢推至介質沉降平面，使介質表面保持水平狀態(tài)，注意避免墊片與介質接觸面滯留氣泡（如對實驗結果要求不嚴，也可不放入上墊片，以提高流速）。4)  在使用一段時間后，如果層析柱流速減慢，可先用小鑷子沿邊緣將墊片推翻，夾出墊片，倒出介質，清洗或更換新的墊片后，按2）、3）所述     玻璃層析柱1)  將層析柱洗凈后垂直固定到鐵架臺上；向柱中加入蒸餾水，排開柱子中的空氣，在蒸餾水排盡以前，關閉柱子出口，在柱內保留58cm高度的蒸餾水。 2)  先將介質混勻，用移液槍按需要量吸取介質，或用玻璃

6、棒緊靠柱子內壁引流，將介質加入到層析柱中；靜置30min，讓介質自然沉降。3)  從上端管口將轉換桿出液端緩慢推至介質沉降平面，使介質表面保持水平狀態(tài)，注意避免轉換桿與介質接觸面間滯留氣泡。4)  在使用一段時間后，如果流速減慢，可先卸下上轉換桿，將介質倒出，再取出下轉換接頭中濾網(wǎng)，清洗或更換后重新裝柱。4.  過柱：1)  用10倍介質體積緩沖液A過柱，平衡介質；2)  上樣；3)   用510倍介質體積緩沖液A過柱，洗去層析柱中剩余上樣液并重新平衡介質；4)  

7、 用510倍介質體積緩沖液B洗脫，收集洗脫液； 5)   用510倍介質體積緩沖液A重新平衡介質。注：純化過程流速不宜過快，對于1ml介質，流速保持在0.5ml/min為宜。5.  介質清洗 如果在使用一段時間后，介質因表面沉積過多雜質導致蛋白結合能力下降，需對介質進行清洗。步驟如下：1)  沉淀或變性物質的清洗：用2倍介質體積6 M鹽酸胍清洗，然后用5倍介質體積緩沖液A平衡介質。2)  疏水締合物質的清洗：用34倍介質體積70%乙醇 (或2倍介質體積去垢劑，如 1% Triton X-100) 清洗介質；然后用5倍介質體積

8、緩沖液A平衡介質。6. 介質再生每次層析前，為達到最佳純化效果，需對介質進行再生，步驟如下：1)  2倍介質體積高pH緩沖液（0.1M Tris-HCl, 0.5M NaCl, pH8.5）和低pH緩沖液（0.1M sodium acetate, 0.5M NaCl, pH4.5）交替洗脫三次。2) 10倍介質體積緩沖液A平衡介質。7.   SDS-PAGE檢測： 1)   不同濃度SDS-PAGE分離膠分離范圍 分離膠濃度分離范圍6%50150kD8%3090kD10%2080kD12%1260kD&#

9、160; 15%1040kD2)   SDS-PAGE操作流程 A.    每個膠孔最適蛋白上樣量為510g。 B.    將含510g蛋白的樣品溶液與loading buffer混勻，90孵育5min，取出后5000rpm離心1 min。C.    上樣，15mA、30mA恒流或80V、120V恒壓電泳。8.介質保存48條件下，介質可長期保存于20%乙醇中。五、   GST Agarose分離GST融合蛋白實例 &

10、#160;       層析介質：GST 1ml；對照GST介質（國際領先品牌）1ml         樣品：表達可溶性GST-tag融合thioredoxin的大腸桿菌BL21裂解液         結合緩沖液：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，pH 8.0     

11、    洗脫緩沖液：10 mM Glutathione（還原型）, 50 mM Tris-HCl, pH8.0         流速：GST 1ml，0.5ml/min；對照GST介質1ml，0.5ml/min實驗結果：色譜分析結果見圖1，色譜各組分的SDS-PAGE結果見圖2。圖1 GST Agarose分離GST融合蛋白色譜圖1.低分子量Marker；2.上樣液；3.GST-流穿液；4.GST-洗脫液；5.對照-流穿液；6.對照-洗脫液 1   

12、60;2    3    4    5    6圖2  純化后SDS-PAGE圖 六、GST親和層析介質使用注意事項1.  GST融合蛋白與還原型谷胱甘肽的結合比較緩慢，為獲得最大結合量，需要保證足夠的作用時間，因而在上樣時要維持較低流速。在樣品中加入510mM DTT可以增加介質對目標蛋白的吸附。對于按常規(guī)步驟操作吸附效果不好的樣品，可以先把介質和樣品混合，輕輕振搖24h，再裝柱，用平衡緩沖液進行重新平衡、洗脫等操作。2.  不同的G

13、ST融合蛋白取得最佳純化效果所需還原型谷胱甘肽濃度、洗脫體積和洗脫時間可能有所不同。必要時需對流穿液、洗脫液進行SDS-PAGE以及Western雜交分析，以確定最佳純化條件。3.GST融合蛋白以包涵體形式存在時不能與介質結合，必須先進行變性、復性、透析處理后才能用介質進行純化。純化效果取決于復性效率。4.純化后出現(xiàn)雜帶的常見原因1)  目標蛋白斷裂或酶解解決方案：向緩沖液A和緩沖液B中加入1mM PMSF抑制蛋白酶活性，或0.1TritonX-100或0.1Tween-20等穩(wěn)定劑。2)  GST融合蛋白不完全表達GST融合蛋白有時候只表達到GST部分就終止，GST標簽蛋白連同完全表達的融合蛋白均能與介質結合并被洗脫下來，因而洗脫液中出現(xiàn)26KD左右的雜帶。解決方案：嘗試用不同濃度的還原型谷胱甘肽洗脫；優(yōu)化表達條件，降低GST融合蛋白不完全表達量；改變外源基因在載體中插入的酶切位點，重新構建表達載體；在不改變外源基因兩端酶切位點的情況下，更換通用載體。5.如后續(xù)實驗需要除去洗脫液中還原型谷胱甘肽，可采用