Angiopep-修飾聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒對(duì)腦膠質(zhì)瘤靶向遞藥研究_

1、Angiopep-2修飾聚乙二醇 -聚己內(nèi)酯納米粒對(duì)腦膠質(zhì)瘤靶向遞藥研究辛洪亮，沙先誼，方曉玲 * (復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203)摘要：目的 構(gòu)建 Angiopep-2 修飾的紫杉醇 (PTX)聚乙二醇-聚己內(nèi)酯 (PEG-PCL) 腦膠質(zhì)瘤遞藥系統(tǒng) (ANG-NP/PTX) ，評(píng)價(jià) ANG-NP/PTX 靶向血腦屏障 (BBB) 和膠 質(zhì)瘤細(xì)胞的雙級(jí)靶向效應(yīng)。 方法 通過(guò)對(duì) U87 MG 細(xì)胞毒、細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期 評(píng)價(jià) ANG-NP/PTX 的腫瘤靶向性；通過(guò)體外 BBB 模型轉(zhuǎn)運(yùn)評(píng)價(jià)其 BBB 滲透能 力；通過(guò) BCEC-U87 MG 共培養(yǎng)模型評(píng)價(jià)其雙級(jí)靶向效應(yīng)。 結(jié)果 與未經(jīng)

2、修飾的 NP/PTX相比， ANG-NP/PTX 顯著增加了 PTX對(duì)U87 MG細(xì)胞毒性，促進(jìn)細(xì)胞 凋亡和增強(qiáng)對(duì) G2/M 細(xì)胞的捕獲能力；提高了體外 BBB 滲透率；顯示對(duì)體外腦 膠質(zhì)瘤的靶向性。結(jié)論 ANG-NP/PTX 可以作為抗腦膠質(zhì)瘤的雙級(jí)靶向遞藥系統(tǒng)。關(guān)鍵詞 Angiopep-2；納米粒；紫杉醇；膠質(zhì)瘤；血腦屏障；雙級(jí)靶向Angiopep-2 Conjugated Poly(ethylene glycolp)-oly( -caprolactone) Nanoparticles as a Drug Delivery System Targeted GiomaXIN Hong-lia

3、ng, SHA Xian-yi, FANG Xiao-ling* (School of Pharmacy Fudan University, Shanghai, 210203)ABSTRACT: ODJECTIVE To develop a drug delivery system targeted glioma based on paclitaxel (PTX) loaded Angiopep-2 conjugated poly(ethylene glycol)- poly( -caprolactone) nanoparticles (ANG-NP/PTX) and evaluated th

4、e dual-targeting effect. METHODS Evaluations were performed on cell viability, apoptosis and cell cycle of U87 MG cell, the penetration of BBB model in vitro and the dual-targeting effect on BCEC-U87 MG co-cultured in vitro. RESULT Compared with NP/PTX, ANG-NP/PTX showed the stronger inhibitory effe

5、ct and apoptosis to U87 MG, significant capture competence of U87 MG cell, significant transport ability across the BBB model and an evident effect of targeting the glioma in vitro CONCLUTION ANG-NP/PTX could be used as a dual-targeting drug delivery system to against glioma.KEY WORDS Angiopep-2; na

6、noparticles; paclitaxel; glioma; BBB; drual-targeting 作者簡(jiǎn)介：辛洪亮，男，博士研究生 * 通訊作者：方曉玲，女，教授，博士生導(dǎo)師 Tel: (021)51980071 E-mail: xlfang神經(jīng)膠質(zhì)瘤 (Glioma) 是一種最常見(jiàn)的顱內(nèi)高度惡性腫瘤，占腦部腫瘤的發(fā)病 數(shù)的 40%以上 1。由于膠質(zhì)瘤呈惡性浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，且多生長(zhǎng)在腦的重要結(jié)構(gòu)，不 僅手術(shù)難以全切，而且術(shù)后易復(fù)發(fā) 2。因此化療是繼膠質(zhì)瘤手術(shù)切除之后的諸多 治療環(huán)節(jié)中至關(guān)重要的一環(huán)。但是由于腦血流量為全身血流量的1/5，同時(shí)存在腦部血腦屏障 (BBB) ，腫瘤多藥耐藥等因

7、素， 目前腦膠質(zhì)瘤的化療效果很不理想。 因此，研究腦膠質(zhì)瘤的靶向治療方法顯得尤為重要。Angiopep-2 (24KDa) 是由 19 個(gè)氨基酸分子組成的新型多肽，它可通過(guò) BBB 上表達(dá)的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白 (LRP) 受體介導(dǎo)內(nèi)吞進(jìn)入腦組織，在腦實(shí)質(zhì) 的分布容積是轉(zhuǎn)鐵蛋白 (Transferrin)的 2.5 倍3 。此外， Angiopep-2 修飾的納米遞 藥系統(tǒng)通過(guò) LRP 介導(dǎo)顯著增加腦部的蓄積 4-5。研究表明，人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞都表 達(dá) LRP 受體6 ，這提示 LRP 可能成為腦膠質(zhì)瘤靶向遞藥的一個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。 因此，本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì) Angiopep-2 介導(dǎo)的藥物腦膠質(zhì)

8、瘤靶向性研究。紫杉醇 (Paclitaxel，PTX)是從紅豆杉科紅豆屬 (Taxus)植物中提取分離得到的一 種抗腫瘤藥物，對(duì)卵巢癌和乳腺癌療效顯著。研究發(fā)現(xiàn)， PTX 在體外能有效地 抑制惡性腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng) 7 ，但不能顯著提高惡性腦膠質(zhì)瘤病人生存期 8 ，主要由 于 PTX 在血漿中很快被清除， BBB 滲透能力差，腫瘤部位吸收過(guò)低以及多藥耐 藥的產(chǎn)生。為此，本課題以紫杉醇為模型藥物，選擇生物相容性好，無(wú)毒、可生 物降解的甲氧基聚乙二醇 -聚己內(nèi)酯 (MePEG-PCL)和馬來(lái)酰亞胺 -聚乙二醇 -聚己 內(nèi)酯(Male-PEG-PCL)為載體材料構(gòu)建納米粒 (NP/PTX) ，NP 表面暴

9、露的馬來(lái)酰亞 胺基團(tuán)與 Angiopepe-2上的巰基連接形成靶向納米粒 (ANG-NP/PTX) 。一方面 PEG 化長(zhǎng)循環(huán)納米?？梢匝娱L(zhǎng) PTX 在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，通過(guò)膠質(zhì)瘤 EPR 效應(yīng)富集于 腫瘤部位；另一方 ANG-NP/PTX 可以通過(guò) BBB 和膠質(zhì)瘤細(xì)胞上高表達(dá)的 LRP 受體介導(dǎo)增加 BBB 滲透能力和膠質(zhì)瘤細(xì)胞靶向能力，從理論上構(gòu)建腦膠質(zhì)瘤雙 級(jí)靶向遞藥系統(tǒng)。1. 儀器與材料1.1 儀器粒徑與電位分析儀 (model 380XLS, NicompTM, Santa Barbara, CA, USA)； 透射電鏡 (Joel JEM-1230, Japan) ，TECAN S

10、afire2 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 (Switzerland)； 流式細(xì)胞儀 (FACSCalibur, BD, USA) ， UV-2401PC 型紫外可光分光光度計(jì)(Shimadzu，Japan)；超濾管 (MW 3000, Millipore) ；低溫高速冷凍離心機(jī) TJ-25 (Beckman)。1.2 材料與試劑甲氧基聚乙二醇 (MPEG2000)、馬來(lái)酰亞胺聚乙二醇 (Male-PEG3500)、碘化丙啶 (PI)、 RNA 酶、 Hoechst 33342 購(gòu)自(Sigma, USA) ； MPEG-PCL(12000Da)、 Male-PEG-PCL(14000Da)根據(jù)文獻(xiàn) 9自行合

11、成；Angiopep-2 由上海吉瑪公司合成； BCA 蛋白定量試劑盒、 Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 (江蘇碧云天生物技 術(shù)公司)；青鏈霉素、 DMEM 、FBS均購(gòu)于 Gibico 公司；乙腈(色譜純)；其他試 劑均為分析純。2. 試驗(yàn)方法2.1 ANG-NP/PTX 的制備與表征2.1.1 NP/PTX 的制備采用 乳化 /溶劑 蒸發(fā)法制備納米粒 ：將 18 mg MePEG-PCL 、 2 mg Male-PEG-PCL和2 mg PTX 溶解于 1 mL二氯甲烷，加入2 mL1%膽酸鈉水溶液， 冰浴下 200 W，60 s間斷超聲形成水包油 (O/W)乳劑。分散到

12、 28 mL 0.5% 膽酸 鈉水溶液并磁力攪拌 5 min。40旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷， 12000 rpm 4離心 60 min 后棄上清液即得 NP/PTX 。2.1.2 ANG- NP/PTX 的制備將上述制備的 NP/PTX 用 2 mL HEPES 液(pH 7.0)吹 打分 散， 按照 Male-PEG-PCL 與 Angiopep-2 摩爾比為 1: 3 加入計(jì)算量的 Angiopep-2，室溫下充 氮?dú)?、避光孵?10 h 。 12000 rpm 4離 心 60 min 后棄 去上 清液 即得 ANG-NP/PTX 。2.1.3 ANG- NP/PTX 形態(tài)、粒徑分布和 Zet

13、a 電位采用粒度/Zeta 電位測(cè)定儀，測(cè)定納米粒的粒徑和電位。 2%磷鉬酸負(fù)染后透 射電鏡對(duì)形態(tài)進(jìn)行觀察。2.1.3 PTX載藥量(DL %)與包封率(ER %)的測(cè)定采用超濾法 10 測(cè)定 PTX 載藥量與包封率，取下層液體 HPLC 方法測(cè)定 PTX濃度，計(jì)算公式如下：DL%Weight of PTX in nanopartic lesWeight of the feeding polymer and PTX100%ER% WeWigehitghotfoPf TthXeinfeendainnogpaPrtTicXles 100%(1)(2)2.2 PTX 體外釋放取 1 ml 納米粒溶液

14、加入到截留分子量為 1.4 萬(wàn)的預(yù)溶脹透析袋內(nèi)， 扎緊袋口， 投入 37恒溫， 100 rpm 39 mL1M 水楊酸鈉溶液中。定時(shí)從釋放介質(zhì)中取出 0.2 mL，同時(shí)補(bǔ)加等量 37空白釋放介質(zhì)。 樣品 PTX 濃度 HPLC 方法測(cè)定， 計(jì)算累 積釋放百分率 F(t)(%) 。2.3 細(xì)胞毒作用將人神經(jīng)母膠質(zhì)瘤細(xì)胞株 (U87 MG)細(xì)胞以 1×104 cells/pore接種到 96 孔板 中，培養(yǎng) 24 h后，加入不同濃度的 PTX制劑，培養(yǎng) 72 h。用 MTT 測(cè)定細(xì)胞生 存率。并求算 IC50 值。2.4 LRP 受體阻斷實(shí)驗(yàn)以 200g/mL 游離 Angiopep-2

15、 和 Aprotinin 為 LRP 受體阻斷劑， 考察它們對(duì) PTX 在細(xì)胞內(nèi)蓄積的影響。將 U87 MG 以 2×105 cells/pore 接種到 24孔板中，培養(yǎng) 24 h 后，棄培液并 用PBS洗滌兩遍，在有或無(wú)阻斷劑存在時(shí)， 給予 PTX濃度為 10g/mL的納米粒 溶液， 37孵育 4 h后，快速棄培液，用預(yù)冷 PBS洗滌細(xì)胞 3遍，將細(xì)胞刮出， 平均分成兩份，一份用以測(cè)定 PTX 含量，另一份用 BCA 法測(cè)定蛋白含量，將每 孔的 PTX 含量除以相應(yīng)孔的蛋白含量，用以消除每孔細(xì)胞數(shù)量帶來(lái)的誤差。 2.5 細(xì)胞凋亡定性觀察：將 U87 MG 按 5×105

16、 cells/pore密度接種于 6 孔板，培養(yǎng) 24 h后 PBS洗滌 2遍，分別加入 PTX濃度為 0.1 g/mL 的 PTX制劑， 37孵育 24 h， 以空白 DMEM 培液的 U87 MG 細(xì)胞作為陰性對(duì)照組。 孵育結(jié)束后，用預(yù)冷的 PBS 漂洗 3遍，加入適量 4 %多聚甲醛室溫固定 15 min。預(yù)冷 PBS洗滌 3遍后加 10 g/mL Hoechst 33342細(xì)胞核染色孵育 15 min，用預(yù)冷的 PBS洗滌 3遍，立即在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化定量檢測(cè) ：37孵育 24 h 后(其它同上 )，按 Annexin V-FITC 試劑盒染色操 作后，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞

17、儀檢測(cè)。2.6 細(xì)胞周期將 U87 MG 按 5×105 cells/pore密度接種于 6 孔板，培養(yǎng) 24 h后 PBS洗滌 2 遍，分別加入 PTX 濃度為 0.1 g/mL 的 PTX 制劑，37孵育 24 h，以空白 DMEM 培液的 U87 MG 細(xì)胞作為陰性對(duì)照組。孵育結(jié)束后，按照 PI 細(xì)胞周期試劑盒染 色操作，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。2.7 體外 BBB 轉(zhuǎn)運(yùn)將大鼠腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞 BCEC按 3×104 cells/pore接種于 Transwell 細(xì)胞 培養(yǎng)池中，置于 24孔板中常規(guī)培養(yǎng) 6 天，隔天換液。用 Millcell -ERS測(cè)定 BBB

18、 模型的跨膜電阻 (TEER)，選取 TEER 大于 200.cm2 的細(xì)胞池進(jìn)行下面試驗(yàn) 11。吸去細(xì)胞池中培液，用 PBS漂洗兩次，加入含 PTX10 g/mL三種 PTX 制劑 溶液。置于 37水浴搖床，定時(shí)將細(xì)胞池轉(zhuǎn)移到另一含有無(wú)血清 DMEM 24 孔 板中。試驗(yàn)過(guò)程中監(jiān)測(cè) TEER。試驗(yàn)結(jié)束后，將所有 24 孔板中的培液吸出、凍 干。凍干品復(fù)溶后 HPLC 測(cè)定 PTX 濃度。 PTX 轉(zhuǎn)運(yùn)百分率 =(W n/W) ×100%。其 中 Wn為第 n小時(shí)滲透量， W 為初始量。通過(guò) ANG-NP/PTX 與 200 g/mL Angiopep-2 和 Aprotinin 共

19、同孵育進(jìn)行 LRP 受體阻斷轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。2.8 體外 BCEC-U87 MG 共培養(yǎng)模型評(píng)價(jià) 12-13按照 2.7 方法構(gòu)建體外 BCEC 單層細(xì)胞 BBB 模型。將 U87 MG 細(xì)胞以 1×104cells/pore密度接種到另一 24 孔板中，常規(guī)培養(yǎng) 24 小時(shí)。把已形成 BBB 模 型的 Transwell 細(xì)胞池轉(zhuǎn)移到 U87 MG 孔中， BCEC-U87 MG 兩種細(xì)胞共培養(yǎng) 24 小時(shí)。 Transwell 中加入含 PTX10 g/mL三種 PTX 制劑， 37孵育 8 h，移去 Transwell，U87 MG 細(xì)胞繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)到 72 小時(shí)。以 Transwe

20、ll 內(nèi)不含任何藥物 的孔作為陰性對(duì)照，用 MTT 法測(cè)定細(xì)胞活力。通過(guò) ANG-NP/PTX 與 200 g/mL Angiopep-2 和 Aprotinin 共同孵育進(jìn)行 LRP 受體阻斷試驗(yàn)。3. 結(jié)果3.1 ANG-NP/PTX 粒形態(tài)、粒徑分布、 Zeta 電位、載藥量及包封率Fig.1 TEM images of NP/PTX (A) and ANG-NP/PTX (B).The scale bar represents 200 nm.圖 -1. NP/PTX 和 ANG-NP/PTX 透射電鏡圖，標(biāo)尺為 200 nmANG-NP/PTX 平均粒徑為 82.6± 3.1

21、 nm，Angiopep-2 修飾使粒徑略有增大， 透射電鏡觀察納米粒形態(tài)呈圓球狀， 大小比較均勻， 且粒度大小與動(dòng)態(tài)光散射法 測(cè)定的數(shù)據(jù)基本一致，見(jiàn) Fig.1。如 Table1所示， NP/PTX 以及 ANG-NP/PTX 的 電位分別為 -3.08 mV 和-3.28 mV，電位無(wú)顯著改變。另外， Angiopep-2 表面 修飾對(duì) DL % 和 ER % 有一定程度的降低， 這可能與 Angiopep-2 和 NP/PTX 孵育 過(guò)程 PTX 釋放有關(guān)。表 1. PTX 納米粒理化表征Table 1The physicochemical characterization of PTX

22、-loaded nanoparticles (n = 3)FormulationParticle size (nm) potentia (lmV)DL%ER%NP/PTX65.4±2.6-3.08±0.948.2 ±0.6%90.4 ±2.3%ANG-NP/PTX82.6±3.1-3.28±0.757.1±0.3%86.5 ±1.4%3.3 PTX 體外釋放Fig.2. Release profiles of NP/PTX and ANG-NP/PTX in 1 M sodium salicylate medium

23、 at 37 (n = 3). 圖-2. NP/PTX 與 ANG-NP/PTX 在 37， 1M 水楊酸鈉介質(zhì)中體外釋放曲線( n=3)如 Fig.2 所示，NP/PTX 與 ANG-NP/PTX 在 12 h 的累積釋放量分別為 49.2 % 和 50.1 %(P > 0.05)，96 h累積釋放量分別為 77.2 %和 79.1 %(P > 0.05)，可見(jiàn)兩 種納米粒都呈現(xiàn)兩相釋放行為，前 12 快速釋放，后面基本呈零級(jí)釋放，釋藥行 為相似。結(jié)果表明，對(duì)于 ANG-NP/PTX ，Angiopep-2 的表面修飾并沒(méi)有影響 PTX 的釋放行為。3.4 細(xì)胞毒作用Taxol,

24、 NP/PTX 和 ANG-NP/PTX 三種制劑對(duì) U87 MG 體外細(xì)胞毒如 Fig.3 所 示，3種 PTX 制劑的 IC 50值為 225 ng/mL、248 ng/mL 和 66 ng/mL ，結(jié)果表明， Angiopep-2 修飾的納米粒顯著增大了 PTX 對(duì) U87 MG 的細(xì)胞毒作用 (p<0.01)。這 可能與 ANG-NP/PTX 通過(guò) U87 MG 表面表達(dá)的 LRP 受體介導(dǎo)增加了 PTX 入胞 攝取量有關(guān)。Fig.3. In vitro cytotoxicity of various formulations of PTX against U87 MG cell

25、s (n = 3).圖-3 不同 PTX 制劑對(duì) U87 MG 體外細(xì)胞毒 (n = 3)3.5 LRP 受體競(jìng)爭(zhēng)阻斷實(shí)驗(yàn)對(duì)于 LRP 受體表達(dá)豐富的 U87 MG 細(xì)胞，ANG-NP/PTX 的 PTX 攝取量顯著 高于 NP/PTX(P < 0.01)，說(shuō)明此時(shí)存在 LRP 受體介導(dǎo)的主動(dòng)靶向作用。在 200 g/mL游離 Angiopep-2 和 Aprotinin 存在條件下， ANG-NP/PTX 攝取均顯著 減少(P < 0.01)，表明游離 Angiopep-2 和 Aprotinin 對(duì)LRP 受體存在一定競(jìng)爭(zhēng)性 結(jié)合作用，但跟 NP/PTX 相比，并沒(méi)有完全抑制住

26、，說(shuō)明除了 LRP 介導(dǎo)內(nèi)吞方 式外還可能存在其他的機(jī)制。Fig.4 PTX cellular uptake of NP/PTX and ANG-NP/PTX nanoparticles in the presence of 200 g/mL free Angiopep-2 or Aprotinin in U87 MG cells (n =3).圖 -4 NP/PTX, ANG-NP/PTX 及其在 200g/mL Angiopep-2 和 Aprotinin 條件下 U87 MG 細(xì)胞攝取 (n =3)3.6 細(xì)胞凋亡如 Fig.5 所示，陰性對(duì)照組細(xì)胞經(jīng) Hoechst 33342后，細(xì)胞

27、核規(guī)則圓整，表明 細(xì)胞凋亡沒(méi)有發(fā)生； Taxol, NP/PTX 組處理后的細(xì)胞核形態(tài)與陰性對(duì)照組相比細(xì) 胞呈褶皺狀或呈折縫樣，即處于細(xì)胞凋亡期；而 ANG-NP/PTX 處理后的細(xì)胞， 部分細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、 邊緣化， 且有一些細(xì)胞核裂解為碎塊， 產(chǎn)生凋亡 小體，即已有部分細(xì)胞處于細(xì)胞凋亡的晚期。 流式定量凋亡結(jié)果如 Table 2所示， 經(jīng) Taxol 和 NP/PTX 處理后， 處于凋亡早期和晚期的細(xì)胞相似； 經(jīng) ANG-NP/PTX 處理后，處于凋亡早期和晚期的細(xì)胞顯著多于Taxol和 NP/PTX 組(P < 0.01)。Fig.5.Induction ofapoptos

28、is on U87 MG cells by variousPTX formulations.magnification (n = 3).圖-5 不同 PTX 制劑誘導(dǎo) U87 MG 凋亡定量與定性圖，熒光照片 ×20 倍Fluorescence micrographs at ×20表-2 Annexin-FITC/PI 法檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡定量結(jié)果Table 2 Induction of apoptosis and necrosis determined by Annexin-FITC/PI assay (n = 3) + + + +Treatment Annexin-FIT

29、C + (%) Annexin-FITC +/PI+ (%)PI+ (%) TotalControl3.48±0.857.23±1.010.82±0.2011.53±1.63Taxol5.46±1.2818.27±2.241.19±0.2924.92±2.69NP/PTX5.55±1.5316.04±1.341.26±0.3222.85±1.51ANG-NP/PTX10.28±2.09 *?23.60±0.14 * ?1.03±0.2734.91

30、±1.37*p 0.01, compared with Taxol; ? p 0.01, compared with NP/PTX*p0.01,與 Taxol 相比，? p0.01,與 NP/PT 相比3.7 細(xì)胞周期如Table3所示，各PTX 制劑組孵育 24 h后，Taxol、NP/PTX和 ANG-NP/PTX 在 U87 MG 細(xì)胞 G2/M 期的分布分別為 28.12 % 、 34.85 %和 55.61%。 NP/PTX 與 Taxol 相比， U87 MG 細(xì)胞的 G2/M 期分布雖有所增加，但無(wú)顯著性差異；但 ANG-NP/PTX 與Taxol相比， U87 MG

31、細(xì)胞的 G2/M 期分布顯著增加 (P < 0.01)； 說(shuō)明 ANG-NP/PTX 對(duì) U87 MG 細(xì)胞在 G2/M 期的捕獲能力顯著高于 NP/PTX 組 (P < 0.01)?？梢?jiàn)，1)PTX包封于 mPEG-PCL納米粒中保持了其抗腫瘤活性； 2) 通過(guò) Angiopep-2修飾的主動(dòng)靶向納米粒作用可使 PTX在U87 MG 細(xì)胞攝取量增 加，從而產(chǎn)生更強(qiáng)的 G2/M 期捕獲能力和細(xì)胞毒作用。表-3 0.1 g/m lPTX 制劑作用 24 h 對(duì) U87 MG 細(xì)胞周期影響 (n = 3) Table 3. Effects of treatment with PTX-b

32、ased formulations (equivalent PTX concentration of 0.1 g/m)l for 24 h on the cell cycle of U87 MG glioblastoma cells (n = 3)Treatment Cell cycle distribution (%)G0/G1SG2/MControl60.29± 1.2831.35±0.828.36±0.79Taxol12.48±2.7059.40±2.8728.12±2.06P-NP/PTX14.93±1.6250.2

33、2±3.3634.85±4.06ANG-NP/PTX18.98±2.2425.41±5.2655.61±3.75* ?*p 0.05, compared with Taxol; ? p0.05, compared with P-NP/PTX*p0.01,與 Taxol 相比，? p0.01,與 NP/PT 相比3.8 體外 BBB 模型轉(zhuǎn)運(yùn)從 Fig.6 中可以看出， ANG-NP/PTX 在 1， 2， 4， 8， 24h 的滲透率比 Taxol 都有顯著提高 (p0.01)，可能是由于 BBB 上的 p-gp外排導(dǎo)致 Taxol 滲透率低。

34、4， 8，24h ANG-NP/PTX 滲透率顯著高于 NP/PTX(p 0.01)，這是因?yàn)?ANG-NP/PTX 在BBB 上高表達(dá)的 LRP受體介導(dǎo)下提高了滲透率。 在200g/mL游離 Angiopep-2 和 Aprotinin LRP 受體競(jìng)爭(zhēng)劑作用下， ANG-NP/PTX 轉(zhuǎn)運(yùn)受到明顯抑制 (Fig.7) 。 可見(jiàn)， LRP受體在 ANG-NP/PTX 轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程起到重要作用。在轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)過(guò)程中，定時(shí)監(jiān)測(cè) BBB 模型的 TEER，未發(fā)現(xiàn) TEER 明顯改變，說(shuō)明試驗(yàn)制劑未對(duì) BBB 緊密連接造成明顯毒性，進(jìn)一步說(shuō)明 PTX 不是通過(guò)細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)。因此， Anigiopep-2 修

35、飾納米粒是 PTX 向腦部遞送的安全有效載體。Fig.6 Transport ration of PTX across the BBB model in vitro after incubation with different PTX formulations at equivalent PTX concentration (10 g/mL) (n=3)* p 0.01, compared with Taxol; # p 0.01, compared with NP/PTX. 圖-6 PTX 濃度為 10g/mL 的各種 PTX 制劑體外 BBB 滲透率 (n=3)p 0.01，與 Taxo

36、l 相比，# p 0.01，與 NP/PTX 相比Fig.7 Transport ration of PTX across the BBB model in vitro after incubation with ANG-NP/PTX in the presence of 200 g/mL free Angiopep-2 or Aprotinin at equivalent PTX concentration (10g/mL) (n=3) * p 0.01, compared with ANG-NP/PTX.圖 -7 PTX 濃度為 10g/mL的 ANG-NP/PTX 及其存在 200g/m

37、L 游離 Angiopep-2 和 Aprotinin 時(shí)體外 BBB 滲透率 (n=3)* p 0.01，與 NP/PTX 相比3.9 體外 BCEC-U87 MG 共培養(yǎng)模型評(píng)價(jià)為了模擬體內(nèi)腦膠質(zhì)瘤的生理屏障， 我們采用 BCEC-U87 MG 共培養(yǎng)模型評(píng) 價(jià) ANG-NP/PTX 的雙級(jí)靶向作用。從Fig.8中可以看出，ANG-NP/PTX 對(duì) U87 MG細(xì)胞抑制率顯著大于 Taxol和NP/PTX (p<0.01) ，這是由于 BCEC和U87 MG 都 表達(dá)LRP受體， ANG-NP/PTX 通過(guò) LRP介導(dǎo)增加了 BBB轉(zhuǎn)運(yùn)和 U87 MG攝取 的雙重靶向結(jié)果。這種雙級(jí)靶

38、向效應(yīng)可以被200g/mL 游離 Angiopep-2 和Aprotinin LRP 受體競(jìng)爭(zhēng)劑顯著抑制 (p<0.01)Fig.8 The dual-targeting effect: cell viability of Taxol, NP/PTX, ANG-NP/PTX, ANG-NP/PTX+Angiopep-2, ANG-NP/PTX+Aprotinin against U87 MG cells following transport across the BBB in vitro (n =3).圖 -8 雙級(jí)靶向效應(yīng)： Taxol, NP/PTX, ANG-NP/PTX, AN

39、G-NP/PTX+Angiopep-2, ANG-NP/PTX+Aprotinin體外 BBB 轉(zhuǎn)運(yùn)后對(duì) U87 MG 細(xì)胞活力影響 (n =3)4. 討論BBB 是中早期及術(shù)后腦膠質(zhì)瘤的化療面臨的第一道生理屏障，因此，跨越 BBB 是腦膠質(zhì)瘤化療成敗的決定性因素?？朔?BBB 有多種策略，目前研究較多 的是內(nèi)源性受體介導(dǎo)內(nèi)吞。 本實(shí)驗(yàn)選取 BBB 和腦膠質(zhì)瘤都高表達(dá)的 LRP 受體為 靶點(diǎn)，以 Angiopep-2 為 LRP 特異性配體，構(gòu)建既可以靶向 BBB 又可以靶向膠 質(zhì)瘤的 ANG-NP/PTX 雙級(jí)靶向遞藥系統(tǒng)。通過(guò)體外細(xì)胞毒、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周 期實(shí)驗(yàn)，證明 ANG-NP/PTX

40、 具有明顯腦膠質(zhì)瘤靶向性；體外 BBB 轉(zhuǎn)運(yùn)說(shuō)明 ANG-NP/PTX 具有 顯 著 BBB 靶 向性； BCEC-U87 MG 共 培養(yǎng) 模型 證明 ANG-NP/PTX 雙級(jí)靶向性。 ANG-NP/PTX 雙級(jí)靶向遞藥系統(tǒng)具有一個(gè)頭基兩種 靶向效應(yīng)的“一頭雙靶”功能，有望改善抗腦膠質(zhì)瘤藥物“入血不入腦，入腦不 入瘤”的情形。本文通過(guò)體外模型評(píng)價(jià) ANG-NP/PTX 雙級(jí)靶向效應(yīng)，動(dòng)物體內(nèi) 膠質(zhì)瘤模型的雙級(jí)靶向試驗(yàn)正在進(jìn)行。REFERENCES1 PARDRIGE W M. Drug targeting to the brain J. Pharmaceut Res 2007, 24(9):

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