單克隆抗體制備標準化操作方案

1、第一章: 小鼠免疫第二章: 滋養(yǎng)細胞的制備第三章: 細胞融合第四章: 篩選分泌抗體的雜交瘤細胞 (ELISA法)第五章: 雜交瘤細胞的亞克隆培養(yǎng)第六章: 雜交瘤細胞系的凍存與復蘇第七章：腹水制備第八章：附件第一章 小鼠免疫小鼠免疫是單抗制備的關鍵一環(huán),質控小鼠免疫是制備優(yōu)質單抗的唯一保證。好的免疫效果：血清效價達一萬以上，脾臟粘連且大小是正常鼠的兩倍以上。小鼠的選擇：選擇與所用骨髓瘤細胞同源的Balb/c健康雌性小鼠，鼠齡在812周。為避免小鼠反應不佳或免疫過程中死亡，可同時免疫34只小鼠。免疫原：免疫原的純度一般并不重要。但有時免疫原純度也會造成很大影響，若雜質存在使免疫反應減弱，或篩選方法

2、不能區(qū)分對特意性成分反應的抗體及對雜質反應的抗體，以及有些抗原的免疫原性十分強，即便痕跡量的存在，也會影響對所識別抗原的免疫反應。上述諸情況下使用純化抗原會更有利。 常用的免疫方案：（一） 可溶性抗原初次免疫： 50100g蛋白抗原加等體積福氏完全佐劑乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多點注射，注射體積500l/只小鼠，四周后進行第二次免疫     第二次免疫：50100g（2550ug，為初免劑量一半）蛋白抗原（與初免等量），加等體積福氏不完全佐劑乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多點注射，注射體積500l/只小鼠兩周后采小鼠尾靜脈血離心取血清測效價 （用

3、ELISA方法檢測）效價達一萬以上的小鼠融合前三天取抗原25g（50100ug，與初免劑量相同）加強免疫，尾靜脈注射，注射體積200l/只300ul/只，效價在一萬以下的小鼠繼續(xù)第三次免疫第三次免疫：50g蛋白抗原加等體積福氏不完全佐劑乳化到滴水不化即可做小鼠腹腔注射，注射體積500l/只，小鼠融合前三天取抗原25g加強免疫，注射體積200l/只。（二） 顆粒性（細胞）抗原可用5×1062×107細胞與完全佐劑混合，作皮下或腹腔注射，23周后重復一次，但佐劑改為不完全佐劑，再待23周后用同樣劑量細胞或半量細胞靜脈注射，34天后取脾融合。為挑選免疫反應較好的動物進行融合，第二

4、次免疫后10天左右應從尾部取血，檢查抗體滴度。另外，還有脾內注射法和體外培養(yǎng)法。第二章 飼養(yǎng)細胞的制備體外培養(yǎng)細胞時，一般單個或極少數(shù)分散狀態(tài)細胞是不能存活的（或生長不良）必需加入一定量的其他細胞達一定的密度才能生長得好，加入的細胞稱為飼養(yǎng)細胞。用細胞融合術建立雜交瘤細胞時，飼養(yǎng)細胞的加入是不可缺少的，常用的有正常小鼠腹腔巨噬細胞、脾細胞、胸腺細胞，也有人用經過照射或絲裂霉素處理的纖維母細胞，如3T3或Putler等。一、 實驗材料1.1 RPMI-1640完全培養(yǎng)液：具體配法見實驗方法細胞融合2.3。1.2 HAT培養(yǎng)液或HT培養(yǎng)液：具體配法見實驗方法細胞融合2.4和2.5。1.3 實驗動物

5、： Balb/c或昆明種健康小鼠（雌雄均可）1只，610周齡，體重18 22克，本院動物中心繁殖和飼養(yǎng)。每只小鼠可取得35×106 的滋養(yǎng)細胞，可供鋪6塊板用，應在融合或克隆前12天制備。1.4 離心機一臺，血細胞計數(shù)板，無菌塑料離心管，96孔細胞培養(yǎng)板。小鼠解剖臺板或平皿；無菌眼科剪刀、鑷子各數(shù)把；大鑷子一個；止血鉗兩個。一次性5ml注射器2套。二、實驗方法2.1 將Balb/c小鼠拉頸脫臼處死，浸泡于75%酒精5分鐘，隨即放入超凈工作臺內，腹部朝上放于平皿內或固定于解剖板上。 2.2  用眼科鑷子夾起小鼠腹部皮膚，用剪刀剪一小口，注意切勿剪破腹膜， 以免腹腔液

6、外流。然后用剪刀向上下兩側做鈍性分離，充分暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。2.3  用注射器吸取5ml RPMI-1640基礎培養(yǎng)液，注入小鼠腹腔，注射器停留不動，晃動小鼠或反復抽吸幾次。用原注射器抽回腹腔內液體，注入離心管。如此反復操作34次。2.4  1000rpm離心10min，棄上清。2.5  用2050ml完全培養(yǎng)液重懸細胞，100l/孔滴加到培養(yǎng)板，置培養(yǎng)箱備用。2.6 觀察飼養(yǎng)細胞的生長狀態(tài)，一般生長良好的飼養(yǎng)細胞和巨嗜細胞呈梭形或多角形、細胞透亮、折光性強。第三章 細胞融合細胞融合是人工定向制造新細胞品系的重要手段，

7、也是制造單克隆細胞系的關鍵技術。在保證有良好的親本細胞、穩(wěn)定和良好的培養(yǎng)體系的條件下，細胞融合的成敗和融合率則取決于融合劑和操作技巧。細胞融合的助融劑和助融手段主要有三種；生物學方法：用仙臺病毒或雞新城疫病毒作助融劑。物理學方法：用電融合儀發(fā)出的脈沖電流使相鄰的兩細胞穿孔而融合?；瘜W方法：用聚乙二醇或血卵磷脂作助融劑。PEG作助融劑是比較方便簡單的操作方法，具體方法如下：一、實驗材料1.1 眼科鑷子、剪刀數(shù)把、固定板。1.2 37溫水。1.3 酒精燈、離心管架、離心管、離心機、5-10ml吸管、1ml吸管、滴管、計數(shù)池、平皿數(shù)個。二、實驗試劑2.1 融合劑：50%PEG W=3000PEG30

8、00   1gRPMI1640         1ml8-10磅滅菌2.2 基礎培養(yǎng)液（RPMI1640）RPMI1640 一包 (10.4g)L-G （L-谷氨酰胺） 0.3gHEPES  3.0g碳酸氫鈉 3.0g慶大霉素 一支三蒸水加至 1000ml2.3 1640完全培養(yǎng)液基礎培養(yǎng)液   180ml胎牛血清   20ml2.4  HT培養(yǎng)液（終濃度H為1×10-4M，T為1.6×10-5M）基礎培養(yǎng)液 197

9、.5mlHT濃縮液（100×） 2.5ml胎牛血清   50ml一次融合約配250毫升2.5 HAT培養(yǎng)液（終濃度A為4×10-7M）基礎培養(yǎng)液 197.5mlHAT濃縮液（100×）  2.5ml胎牛血清  50ml2.6  細胞凍存液1640完全培養(yǎng)液    70mlDMSO   10ml胎牛血清   20ml2.7 3%醋酸溶液30%乙酸   10mldH2O     &

10、#160;      90ml三、實驗步驟3.1 脾細胞制備：取加強免疫小鼠一只，眼眶采血后脫臼處死，在75%酒精中消毒后取脾臟，去除結締組織，制備脾細胞懸液，轉移到50ml離心管中，加RPMI1640至30ml，15002000rpm離心5分鐘，棄上清，加RPMI1640至30ml，白細胞稀釋液稀釋20倍，計數(shù)，取1×108個細胞待用。3.2 骨髓瘤細胞制備：取3瓶生長狀態(tài)良好的（活細胞數(shù)>95%）骨髓瘤細胞，將之完全吹下，轉移到50ml離心管中，加RPMI1640至30ml，15002000rpm離心5分鐘，棄上清，加RPMI1640

11、至30ml，RPMI1640稀釋10倍，計數(shù)，取2×107個細胞待用。3.3 細胞混合：脾細胞:骨髓瘤=5：1，混合，15002000rpm離心5分鐘。注意：由于細胞融合是個隨機過程，母細胞比例不一，會影響融合產物；或是兩種母細胞融合而成的雜交細胞，或是一種細胞自身融合產物。多數(shù)實驗者采用骨髓瘤細胞：脾細胞1：5，也有人采取其他比例，如骨髓瘤細胞：脾細胞1：5，甚至是1：1。減少脾細胞用量目的是降低脾細胞自身融合的機率。3.4 細胞融合：將離心上清倒干，把沉淀細胞塊彈成糊狀，置37水浴，在1分鐘內加入1ml融合劑，并攪拌細胞，37水浴放置 45秒，在1分鐘內加入1ml 1640并攪拌

12、細胞 終止融合劑的融合作用，500rpm離心7分鐘，棄上清。2分鐘內加入5ml 1640并攪拌細胞 2分鐘內加入10ml 1640并攪拌細胞2分鐘內加入10ml 1640并攪拌細胞3.5 細胞培養(yǎng)：輕輕將細胞彈勻，緩緩加入HAT培養(yǎng)液至所需體積，將細胞重懸，輕輕地將之混勻，加到預先準備好的飼養(yǎng)細胞板中。 10ml吸管滴加1滴（配8ml/板），排槍滴加80100微升（配10ml/板），37，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)、觀察。3.6 細胞培養(yǎng)、換液：細胞融合后第一天開始，對細胞進行仔細觀察，記錄好細胞的生長狀態(tài)、每孔雜交細胞瘤個數(shù)、塊數(shù)、培養(yǎng)液有無污染、飼養(yǎng)細胞的狀況。培養(yǎng)35天HAT培養(yǎng)液換液一次，10天

13、換HT培養(yǎng)液培養(yǎng)至20天，換1640完全培養(yǎng)液。四HAT選擇培養(yǎng)液的作用在細胞融合時，可以出現(xiàn)：脾細胞與骨髓瘤細胞的融合，脾細胞之間的融合，骨髓瘤之間融合，此外還有大量的未融合細胞。如何除去大量未融合及自身融合的細胞呢？下面簡介HAT液作用。谷氨酰胺（L-Glutamine），尿核苷單磷酸都是正常細胞及腫瘤細胞用來合成DNA的重要成分（主要途徑），但是這條途徑可以被氨基喋呤（Aminopterin）切斷。另外還有一條應急途徑即細胞內的HGPRT（次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉化酶）利用（H）和TK（胸腺嘧啶激酶）利用（T）合成DNA。骨髓瘤細胞株是經過8-偶氮鳥嘌呤篩選出來的，不含HGPRT，因

14、此不能借用應急途徑合成DNA，只能靠主要途徑合成DNA。骨髓瘤細胞在HAT液中，因缺少HGPRT和TK，不能利用H·T合成DNA，主要途徑又被氨基喋呤阻斷，因此細胞死亡。免疫鼠脾細胞，雖含有HGPRT但不適應體外培養(yǎng)，一般十天左右自然滅亡。雜交細胞，在融合時脾細胞的HGPRT被帶入，通過應急途徑利用H·T合成DNA，并繼承骨髓瘤細胞體外繁殖的特性，所以能存活。一般融合后常用含20%胎牛血清培養(yǎng)液，通過篩選，亞克隆選出有關雜交細胞后，則可換成含10%胎牛血清培養(yǎng)液。對已確定的雜交瘤株，則可換成含5%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)。     

15、60;         第四章 篩選分泌抗體的雜交瘤細胞融合后當雜交細胞集落生長到一定大小，培養(yǎng)液開始變黃，便可開始篩選抗體活性。許多方法都可以用來篩選，但應注意到篩選單克隆抗體時的一些特點；首先，培養(yǎng)上清中的抗體含量低于高效抗血清的抗體含量。其次，與普通抗血清不同，單克隆抗體不能多價地識別抗原。所以用來篩選單克隆抗體的方法應照顧到單克隆抗體的特點，而且要準確、迅速和方便。此外應根據(jù)所需要抗體的特點，選擇不同類型的方法。 一般常用的有：免疫熒光、放射免疫（RIA）、組織化學法和酶聯(lián)免疫分析（ELISA）法等。最經常用方法是ELISA法。在收集上

16、清時，應在上次換液后3-4天進行，以便抗體積累。上清可不經稀釋或1：51：10稀釋后再測抗體活性，用稀釋抗體進行篩選時可以篩掉弱陽性的抗體，也可以去掉因高本底所造成的假陽性。融合后第一次篩選出的陽性克隆可能因陰性克隆或其他陽性克隆的過度生長而丟失，故應盡早亞克隆。第一次篩選后也可能沒篩選到陽性抗體，這可能由于分泌陽性抗體的細胞為數(shù)尚少，應重復測定活性2-3次?，F(xiàn)將ELISA法檢測雜交瘤細胞抗體的方法介紹如下：（一） 實驗試劑    1磷酸鹽緩沖液（PBS）（10×濃縮）氯化鈉（NaCl）50g氯化鉀（KCl）1.25g磷酸二氫鉀（KH2PO4）1.25g磷酸氫二鈉

17、（Na 2 HPO4·12H2O）18.1g蒸餾水加至1000ml用1M HCL調pH至7.22. 封閉液正常牛血清10ml1×PBS（不含吐溫）90ml3. 洗滌緩沖液吐溫-20（Tween 20）0.2ml1×PBS1000ml4底物顯色A液醋酸鈉（CH3 COONa）13.6g檸檬酸（C6H8O7·H2O）1.6g雙氧水（H2O2 30%） 0.3ml蒸餾水加至  500ml5底物顯色B液 乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）0.2g檸檬酸（C6H8O7·H2O）0.95g甘油 （C3H8O3）50ml四甲基聯(lián)苯胺（T

18、MB） 0.2g蒸餾水加至    500ml6終止液（2M H2SO4 ）取濃H2SO4  27.62ml，緩緩加入到473ml的蒸餾水中，混勻即可。注意在加入硫酸的過程中，不要加得太快，以免過熱。7抗原包被液（0.1M碳酸鹽緩沖液）pH 9.6碳酸鈉（Na2CO3）1.59g碳酸氫鈉（NaHCO3）2.93g疊氮鈉（NaN3） 0.2g蒸餾水加至 1000ml8辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG（已商品化）。 （二）實驗步驟1抗原包被：純抗原濃度一般為12g/ml，用包被液稀釋后取100l加入聚苯乙烯酶聯(lián)檢測板各孔中，4過夜后，洗液洗滌3次。建議4包被

19、過夜2封閉： 每孔加200l或加滿封閉液，4過夜或37兩小時后，洗滌3次，拍干。置4冰箱保存?zhèn)溆谩?ELISA檢測（1）加待測樣品：檢測融合板時，無菌條件下取細胞上清，50100l/孔加樣到包被好的酶標板中，同時，每板分別選取無細胞生長的兩孔為陰性對照，另選取無細胞生長的兩孔加入陽性血清作為陽性對照；檢測血清或腹水效價時，對血清或腹水做倍比稀釋，100l/孔，以正常小鼠血清為陰性對照，37孵育30min，洗滌3次，拍干。（2）加二抗：根據(jù)酶標二抗的效價選擇稀釋倍數(shù)，100l/孔，37孵育30min，洗滌3次，拍干。（3）顯色：加入A、B液各80l/孔，37顯色15min。（4）終止：加入終止液

20、80l/孔。（5）讀數(shù)： 以450nm單波長測定各孔OD值，以與陰性對照孔OD值的比值（P/N）大于2.1為限，作為判斷為陽性或確定效價的臨界點。 第五章 雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)經檢測的雜交細胞雖然分泌抗體，但它可能是一個雜交細胞，也可能是多個雜交細胞的后代所分泌的抗體，因此必須進行克隆化培養(yǎng)，以獲得得一個既有克隆原性又分泌抗體的雜交瘤細胞株。融合早期的雜交細胞很不穩(wěn)定，易喪失分泌抗體能力，因此盡早克隆化培養(yǎng)（細胞生長約占孔底面積的1/4-1/3）。通常經過2-3次克隆化培養(yǎng)雜交細胞即可穩(wěn)定下來。為防止雜交細胞變異或污染等情況，在克隆化同時要凍結保存以防失種?？寺』囵B(yǎng)方法常用如下三種：（一）

21、 雜交細胞直接接種法將陽性雜交細胞團從培養(yǎng)板孔內吸出，放入裝有0.51.0ml無血清培養(yǎng)液的小皿內，分散細胞后，用毛細吸管吸取單個細胞，種入有飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)板孔內，37CO2溫箱培養(yǎng)。（操作均在潔凈臺內倒置顯微鏡下進行）。（二） 半固體瓊脂培養(yǎng)法將陽性孔雜交細胞分散計數(shù)制成細胞懸液與瓊脂及完全培養(yǎng)液適當量混合接種在培養(yǎng)皿里，37CO2孵箱培養(yǎng)，約57天長成細胞集落，用槍頭吸取分散成懸液，再接種96孔板內培養(yǎng)。（三） 有限稀釋法此法簡便適用廣為采納。（1）準備一塊有飼養(yǎng)細胞生長的96孔板（2.5×104細胞/0.1ml/孔）。（2）將陽性孔雜交細胞計數(shù)制成細胞懸液。（3）把96孔板分為

22、4組，每組24孔，將細胞懸液按倍比法稀釋成4組溶液，即每組每毫升含100、50、25、12.5個細胞，以0.1ml/孔加板培養(yǎng)。（4）約10天左右選擇單克隆孔，檢測抗體，如陽性者，再克隆，直至100%孔分泌抗體。此時選擇抗體陽性強、細胞生長好的克隆，進行擴大培養(yǎng)，建系，保存。 第六章 雜交瘤細胞的凍存與復蘇（一）細胞的凍存-液體氮保存1凍存液配方：二甲基亞砜凍存液（Dimethyl sulfoxide）10.0ml新生牛血清 30.0ml1640培養(yǎng)液60.0ml丙三醇凍存液（Glycerol） 10.0ml新生牛血清 10.0ml1640培養(yǎng)液80.0ml2凍存程序：（1）冷凍管高壓滅菌備用。（2）凍存細胞必須生長良好，活細胞大于90%經2000rpm離心5min，吸去上清。（3）用冷凍液