點樣微陣列的制備

1、點樣微陣列的制備點樣微陣列的制備過程包含了一系列簡單的移液和點樣操作，其中許多變量和因素會影響最終制備的點樣微陣列芯片的質(zhì)量。點樣針的選擇和安裝，點樣緩沖液的組成和點樣過程的質(zhì)量控制等是這一過程的關(guān)鍵步驟。研究點樣微陣列制備方法的最終目的是盡可能的減小和控制樣點間的差異，以獲得樣點性質(zhì)均一的微陣列芯片。本節(jié)內(nèi)容主要介紹與微陣列點樣有關(guān)的設(shè)備、試劑和方法，影響接觸點樣效果的各種變量和因素，以及如何對點樣過程進(jìn)行質(zhì)量控制以獲得高質(zhì)量的點樣微陣列芯片。一、 前言微陣列技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步帶動了生物分析領(lǐng)域一場重大的變革。最初在基因組學(xué)研究中開始得到應(yīng)用的DNA微陣列基因表達(dá)分析技術(shù)，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展成為以蛋白

2、質(zhì)、細(xì)胞、生物膜和小分子等為材料的多種類型的微陣列。能使用較少量的試樣來實現(xiàn)高通量分析這一顯著特性，大大地促進(jìn)了微陣列技術(shù)的發(fā)展。相應(yīng)地，能夠適應(yīng)各種不同用途的具體要求而將上述各種材料排列在特定的支持物上的微陣列制備技術(shù)也日益發(fā)展成熟。一般地，各種微陣列制備技術(shù)首先應(yīng)該對制備陣列所使用材料的穩(wěn)定性沒有負(fù)面影響，能夠在陣列制備過程中保持其生化特性上的穩(wěn)定；其次，陣列制備技術(shù)在將陣列材料從容器中轉(zhuǎn)移到制備陣列的表面時，要具有高精度的移液特性，以保證陣列上不同樣點之間的均勻性和一致性，并盡可能地減小偏差。當(dāng)前各種微陣列的制備有兩種主流方式：一種方式是依賴于攜帶有陣列材料的點樣針與陣列支持物表面接觸點

3、樣，將材料轉(zhuǎn)移到陣列中；另一種方式則是將陣列材料噴射到陣列支持物表面。前者由于在技術(shù)上相對簡單，容易實現(xiàn)，目前已經(jīng)有多種商品化的點樣儀可供選擇，并且與之配套的點樣針也是種類繁多，有著各自獨特的優(yōu)點和缺點，涵蓋了廣泛的應(yīng)用背景。后者實際上是源于現(xiàn)在廣泛使用的噴墨打印機(jī)中所采用的噴印技術(shù)，這種技術(shù)在工作時不需要噴咀和陣列支持物表面發(fā)生接觸，并且可以精確地實現(xiàn)極微量液體的定量轉(zhuǎn)移，因而在越來越多的新型微陣列制備設(shè)備中得到了廣泛的采用。應(yīng)用微點樣針，通過接觸點樣方法來制備點樣微陣列芯片這一技術(shù)在概念上看起來很簡單，然而通過點樣法制備的微陣列芯片的應(yīng)用對生命科學(xué)研究所產(chǎn)生的影響卻是巨大而深遠(yuǎn)的。上世紀(jì)九

4、十年代中期，斯坦福大學(xué)布朗實驗室的Schena等人，將單根分叉型點樣針固定在自制的X-Y-Z機(jī)械手裝置上，在計算機(jī)控制下，將cDNA樣品從96孔板轉(zhuǎn)移到經(jīng)過表面修飾的玻璃載玻片上，這一工作開啟了高密度DNA微陣列制備的先河。隨后，這一技術(shù)受到越來越廣泛的關(guān)注，許多公司開始致力于研究自動化的點樣裝置和各種結(jié)構(gòu)的點樣針，以便能夠以更高密度和更快的速度將納升，甚至是皮升量級的生物材料轉(zhuǎn)移到用于制作微陣列的支持物表面。在這個過程中，研究和開發(fā)人員克服了重重困難，成功地使用實心、中空、和毛細(xì)管點樣針等，將多種不同類型的生物材料互不干擾地轉(zhuǎn)移到陣列支持物上，排列成高密度的陣列，每個樣點的直徑一般在幾十微米

5、到二、三百微米之間?，F(xiàn)在已經(jīng)有許多商用的、和用戶自行定制的點樣設(shè)備可以用于點樣微陣列的制備，在點樣制備的DNA微陣列芯片中，用于點樣到支持物的DNA材料稱作探針，而用于和DNA微陣列芯片雜交的標(biāo)記樣品材料稱為靶。固定DNA探針的支持物表面通常是包被了活性化學(xué)基團(tuán)的玻璃載玻片，或者是各種濾膜等。盡管這里討論的主要是關(guān)于如何將cDNA和寡核苷酸探針通過點樣固定到支持物表面，所涉及到的影響點樣的變量和因素、以及點樣的方法和步驟也適用于蛋白質(zhì)等其他分子和材料的點樣。二、 接觸點樣技術(shù)接觸點樣這一概念反映了在點樣過程中，點樣材料、點樣裝置和點樣支持物三者之間空間上的連續(xù)性。點樣微陣列制備時，所使用的點樣

6、材料是各種核酸、蛋白質(zhì)或細(xì)胞等生物分子，點樣裝置則是各種類型的點樣針，而點樣支持物則是用于微陣列制備的、經(jīng)過表面修飾的載玻片等。它們各自的一些物理和化學(xué)特性決定了三者之間的相互作用，并與周圍的環(huán)境因素如溫度、濕度、以及點樣裝置的運動參數(shù)，如點樣針運動速度和點樣針與支持物的接觸時間等，共同決定了每次點樣過程轉(zhuǎn)移的生物材料的體積和在支持物上形成的樣點的形狀。其中比較關(guān)鍵的特性有點樣材料的粘度和表面張力、點樣陣的制作材料和幾何形狀、以及點樣針和點樣支持物的疏水特性。此外，在高密度的微陣列制備中，由于需要反復(fù)多次將不同的材料分別點樣到微陣列中不同的位置上，因此同一根點樣針在每次更換點樣材料之前要進(jìn)行徹

7、底的清洗，以完全除去點樣針上殘留的現(xiàn)有點樣材料，重新加樣和開始新一輪點樣循環(huán)。點樣針的清潔也是決定所制備微陣列質(zhì)量和實驗結(jié)果可靠性的重要因素，如果每輪點樣之間，同一根點樣針的清潔不充分，就會將點樣針上殘留的、上一輪點樣時使用的點樣材料直接帶入到下一輪所點樣的新樣點中，造成交叉污染，這對隨后使用微陣列進(jìn)行的樣品檢測而言是毀滅性的打擊。接觸點樣中樣點的形成過程點樣開始時，首先是點樣針浸入裝有點樣材料的容器進(jìn)行加樣，這里點樣針的浸入深度和在點樣材料中的停留時間非常重要。如果點樣針浸入過深，會攜帶過多的樣品，這樣使用實心針點樣時形成的樣點尺寸過大，而使用分叉點樣針點樣則會使得最初的數(shù)個樣點尺寸過大。不

8、僅如此，粘附在點樣針表面的過多點樣材料有可能被帶入后續(xù)的點樣過程中，造成交叉污染。在對分叉點樣針或者毛細(xì)管點樣針進(jìn)行加樣操作時，點樣針的浸入時間要足以保證用于儲存點樣材料的狹縫或毛細(xì)管結(jié)構(gòu)被樣品材料完全充滿，并且在開始點樣前要進(jìn)行預(yù)點樣，以避免最初得到的幾個不均勻樣點對所制備點樣微陣列芯片質(zhì)量的影響。接觸點樣的第二個步驟是點樣針與支持物表面的接觸和將點樣材料轉(zhuǎn)移到支持物上，形成樣點，如圖1中所示。這里有一些關(guān)鍵的參數(shù)會影響到點樣時轉(zhuǎn)移樣品材料的體積，以及形成樣點的幾何形態(tài)。首先，點樣針與支持物接觸時的力量，或者說速度是關(guān)鍵性的因素之一，尤其是在使用分叉點樣針或毛細(xì)管點樣針的情形下，因此需要對點

9、樣儀中機(jī)械手裝置的Z軸減速過程進(jìn)行精確控制。一旦點樣針與支持物表面發(fā)生接觸，點樣針本身的直徑、針尖表面的形貌和支持物的表面特性共同決定了點樣針和支持物表面之間縫隙的形狀、毛細(xì)張力的大小、針尖和支持物之間存在的點樣材料的量、被擠出針尖區(qū)域以外那部分點樣材料的量。通常由于毛細(xì)張力的作用，一部分點樣材料溶液被保持在針尖和支持物之間，同時還有部分點樣材料溶液稍微超出針尖的周長范圍以外，這些點樣溶液中最終有多少會留在支持物表面的樣點中取決于點樣針在支持物表面的停留時間、點樣針離開支持物表面時在Z方向上的回縮速度、點樣材料溶液的粘度和表面張力，以及與支持物表面的接觸角。對于接觸角很大的情形，點樣時留在支持

10、物表面的液體先是隨機(jī)地回縮，這一過程中仍然殘留在點樣針下端的液滴被拉細(xì)成液體線，并在所伴隨的液體蒸發(fā)作用下使得針尖和支持物之間的液體線斷裂而完全分離。如果此時針尖下方液滴回縮過快，液體線會發(fā)生不均勻的斷裂，這時飛濺出的液滴會在支持物表面所點樣的樣點周圍留下數(shù)個微小的“衛(wèi)星”樣點，并對陣列中正常點樣的其他樣點產(chǎn)生污染。圖1 接觸點樣過程中點樣材料的轉(zhuǎn)移和樣點形成過程。圖中從左到右，依次顯示了使用250微米實心針，將點樣材料轉(zhuǎn)移到環(huán)氧硅烷修飾的支持物表面的過程，轉(zhuǎn)移液體的量大約為2 nl。從圖中可以看出，點樣針上的液體并沒有被全部轉(zhuǎn)移到支持物的表面，大約有5液滴在點樣針回縮過程中留在針尖表面。假定

11、在點樣過程中，所有環(huán)境因素、表面特性和機(jī)械參數(shù)可以保持一致，那么點樣時所轉(zhuǎn)移點樣材料的量主要取決于點樣材料的成份和濃度，因此這就要求加樣板中點樣材料的濃度和加樣時的浸入深度保持恒定。點樣材料轉(zhuǎn)移到支持物表面以后，最終得到的樣點形態(tài)主要取決于點樣溶液在支持物表面的蒸發(fā)速率、接觸角和其化學(xué)組成。點樣支持物的影響接觸點樣所要求的理想支持物表面應(yīng)該是平整的、并且具有均一性的包被。目前DNA點樣微陣列制備中使用最為廣泛的支持物是表面通過硅烷化反應(yīng)衍生了氨基或醛基的載玻片。玻片的這類硅烷化修飾反應(yīng)已經(jīng)是廣泛使用的技術(shù)，但是如何最終得到大量修飾均一、可重復(fù)性好、性能穩(wěn)定的點樣用玻片支持物仍然是一個挑戰(zhàn)性的工

12、作。為了提高點樣過程中每個樣點中所包含的點樣材料的量，以增強(qiáng)芯片表面的反應(yīng)信號；以及提供一個類似于溶液相反應(yīng)的環(huán)境，以利于發(fā)生在芯片支持物表面的各種生物分子相互作用過程，如核酸雜交、免疫相互作用和配體與受體分子結(jié)合等的進(jìn)行，最近發(fā)展起來的一些技術(shù)通過在玻片支持物表面修飾上一層聚丙烯酰胺、聚乙二醇等材料形成的三維凝膠狀結(jié)構(gòu)薄膜，并在這種表面上制備點樣微陣列芯片。這種三維修飾結(jié)構(gòu)提供了更大的表面積，而且使得剛性的支持物表面也具備了類似尼龍膜的芯吸效應(yīng)（wicking effect）。這些改變對支持物表面性質(zhì)的影響是巨大的，它使得在同樣尺寸的樣點中可以容納更多的點樣材料?？刂栖浖蛿?shù)據(jù)跟蹤軟件控制部

13、分是接觸點樣系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分之一。它們提供了圖形化的工作界面，使得用戶可以設(shè)定、管理、監(jiān)控、記錄和跟蹤點樣操作過程，并對影響點樣過程的關(guān)鍵變量和參數(shù)，諸如微陣列芯片上的樣點間距、點樣針預(yù)點樣樣點數(shù)量、機(jī)械手Z軸運動控制參數(shù)、點樣針加樣和點樣時的停留時間、點樣針清洗和干燥的操作順序等進(jìn)行調(diào)整。更為廣泛的軟件設(shè)定包括了樣品跟蹤功能模塊，使得陣列上的樣點位置可以和加樣板上板孔內(nèi)的樣品之間建立起對應(yīng)關(guān)系。如果將樣品跟蹤軟件與數(shù)據(jù)庫管理軟件進(jìn)行集成，就可以使得實驗者能夠迅速設(shè)計微陣列實驗，并在得到結(jié)果以后反過來對微陣列實驗的設(shè)計和點樣過程進(jìn)行優(yōu)化。在許多點樣儀控制軟件中，還集成了質(zhì)量控制功能模塊，使得

14、用戶可以實施監(jiān)控點樣的質(zhì)量，并及時發(fā)現(xiàn)點樣過程中可能會出現(xiàn)的差錯和進(jìn)行修改。與接觸點樣技術(shù)不同，后面將要介紹的非接觸式點樣技術(shù)，或者更為確切地稱為噴樣技術(shù)，由于不需要噴咀和基底之間直接接觸，因此在點樣過程中，點樣材料、點樣裝置和點樣支持物三者之間在空間上是不連續(xù)的。這種不連續(xù)性帶來的好處是減少了對點樣過程的影響因素，因此與接觸點樣相比，噴樣針每次轉(zhuǎn)移材料的量可以控制得更為精確、重復(fù)性更好，而且在支持物上形成的樣點形態(tài)更加均一。然而，由于這種非接觸式點樣技術(shù)中使用的噴樣針在結(jié)構(gòu)上一般較為復(fù)雜，要使用到螺線管、或是壓電裝置等來驅(qū)動微量液體的分配和轉(zhuǎn)移，因此非接觸式點樣裝置要比接觸點樣裝置在裝置結(jié)構(gòu)

15、上更為復(fù)雜，價格也更為昂貴。三、 點樣設(shè)備和操作點樣微陣列芯片的制備過程如圖2中所示。圖2 微陣列的點樣過程。點樣儀中硬件部分主要包括機(jī)械手控制裝置、點樣頭、點樣臺、在更換點樣針上的點樣材料之前對點樣針進(jìn)行清洗和干燥的裝置、環(huán)境控制部件以及加樣多孔板和點樣支持物玻片的加載和固定裝置。圖3中給出的照片是UC Berkeley的Ngai實驗室自制的點樣儀。此外，點樣儀還必須配備相應(yīng)的控制和操作軟件。圖3 UC Berkeley的Ngai實驗室自制的點樣儀。左圖是整個點樣儀的外觀，右圖是點樣頭的局部放大。機(jī)械手裝置控制整個點樣過程通過簡單的機(jī)械手裝置來實現(xiàn)，通常是三軸的笛卡爾坐標(biāo)系形式。X和Y軸的控

16、制精度要求較低，一般使用長行程的滾珠絲桿或?qū)輻U作為運動軸。當(dāng)然，現(xiàn)在許多點樣儀中也使用了高速、高精度的直線電機(jī)作為運動軸。直線電機(jī)比傳統(tǒng)的絲桿傳動系統(tǒng)要昂貴很多，但是它在速度、加速減速，和運動精度等方面能提供更多的優(yōu)點。點樣儀的垂直軸或Z軸通常使用高精度的導(dǎo)螺桿作為運動軸，但是對行程的需求相當(dāng)?shù)匦?。一般典型的樣點尺寸在100到200個微米。在支持物上點樣所能獲得的樣點密度首先取決于樣點的直徑，同時，點樣儀機(jī)械手裝置的X和Y軸的重復(fù)性和定位精度也會影響到點樣的密度。點樣儀中使用的普通機(jī)械手裝置精度一般在數(shù)十個微米，如果需要制備高密度點樣微陣列芯片或者是長時間連續(xù)運行點樣儀，那么機(jī)械手裝置的精度

17、要在數(shù)個微米，并且具有閉環(huán)運動控制，以減小系統(tǒng)誤差。同時，機(jī)械手裝置Z軸的垂直定位、以及速度和加速與減速控制在接觸點樣中也需要精確控制。點樣臺在點樣儀中，用于點樣的玻片等支持物通常是排放在一個大的平臺上，有時也稱作點樣臺。取決于所設(shè)計的點樣臺一次裝載和點樣玻片的數(shù)量，點樣臺通常與點樣儀機(jī)械手裝置的X或Y軸獨立相連，或者是同時與X和Y軸相連。通常點樣臺一次可以裝載20到300張點樣用的玻片。大型的點樣臺可以提高點樣芯片制備的通量，并且可以更加經(jīng)濟(jì)的利用點樣的DNA探針等材料。隨著點樣臺面積的增大，平臺表面的平整度和點樣過程中可容許的機(jī)械誤差都會下降，這就使得同一批點樣制備的大量點樣微陣列芯片中樣

18、點之間的均一性隨之變差，因此對于具有大型點樣臺的點樣儀而言，更需要對機(jī)械手裝置進(jìn)行精確的調(diào)校和日常維護(hù)。點樣頭點樣頭是點樣儀中最為關(guān)鍵的部件，用于點樣的點樣針就安放在其中，通過點樣頭將點樣針與機(jī)械手裝置的Z軸相連。點樣針通常以“懸垂”的方式裝配在點樣頭中的套管內(nèi)，利用其自身的重力進(jìn)行垂直定位，并有相應(yīng)的機(jī)械限位結(jié)構(gòu)防止滑脫，但是仍然保持點樣針在與支持物表面接觸時可以在垂直方向上自由向上運動。這種設(shè)計的最大優(yōu)點在于可以緩沖點樣針與支持物表面接觸時的沖力，避免點樣針尖端的磨損和對支持物表面的損傷，提高點樣針使用的耐久性，并使得同一根點樣針點樣的樣點具有較好的均一性。裝配點樣針的套管是點樣頭中的關(guān)鍵

19、結(jié)構(gòu)，它應(yīng)當(dāng)具有合適的緊精密度容限，使得點樣針偏離垂直方向的角度盡可能的小，同時要留有足夠的間隙以避免點樣針與套管結(jié)合過緊而無法在套管內(nèi)垂直滑動。Telechem的Stealth點樣針上設(shè)計有一個軸環(huán)，用于防止點樣針在點樣頭中發(fā)生旋轉(zhuǎn)，可以消除點樣針自身旋轉(zhuǎn)帶來的與支持物表面之間的摩擦力，改善點樣的性能。此外，點樣針制作材料的選擇也很重要，應(yīng)該選擇可以防止靜電在針尖和點樣頭上積累的材料，因為在點樣過程中靜電的累積會嚴(yán)重影響到所點樣陣列的質(zhì)量。由于在接觸點樣過程中點樣針必須與點樣支持物表面接觸，因此點樣頭在設(shè)計上必須提供一定的柔性，以防損傷點樣針，或者是點樣支持物的表面。在點樣針完成與點樣支持物

20、表面之間的接觸點樣過程后，點樣針還必須要能夠回復(fù)到其最初的位置。為了達(dá)到這一目的，點樣針的安裝上通常使用壓縮彈簧、重力、或柔性泡沫等可以向點樣針一端施加向下運動力量的材料。點樣針的機(jī)械加工是一個非常精密的過程，并由此得到極細(xì)的點樣針針尖。在包含有多根點樣針的點樣頭中，有時需要對點樣頭中個別點樣針進(jìn)行更換，這時應(yīng)該選擇與原來點樣針相匹配的新點樣針，以減少因點樣針性能差異而導(dǎo)致的點樣陣列質(zhì)量差異。隨著點樣頭中點樣針數(shù)目的增加和點樣臺上裝載玻片數(shù)量的增多，維持點樣頭與點樣臺平面間的平行變得困難，此時不僅要選擇合適的點樣針，還應(yīng)當(dāng)通過機(jī)械的方式對兩者的平行關(guān)系進(jìn)行調(diào)節(jié)，以獲得優(yōu)良的點樣質(zhì)量和延長點樣針

21、的使用壽命。在一些點樣頭中，可以包含4根點樣針，以2×2的陣列排列，或是12根點樣針，以2×6的陣列排列，點樣針之間的中心距為9毫米，這與常用多孔板的孔間距是一致的，適合使用標(biāo)準(zhǔn)的96孔板加樣。在使用384孔板加樣時，常見的點樣頭中一般包含了16、32、48或64根點樣針。點樣頭一般設(shè)計為4×4，4×8或 4×12的點樣針陣列，中心距為4.5毫米，這樣在點樣時就可以使用滿足SBS標(biāo)準(zhǔn)的384孔板來為點樣針進(jìn)行加樣。為了進(jìn)一步提高加樣和點樣的通量，現(xiàn)在也有點樣頭中將點樣針間距設(shè)計為2.25 mm，以便使用1536孔形式的多孔板進(jìn)行加樣。通常點樣頭

22、中采取以上這些排列方式的一個原因是考慮到常用的玻片支持物表面可用與點樣的區(qū)域一般為22×60毫米，其余空白的玻片邊緣區(qū)域要留作貼寫標(biāo)記和在使用時將玻片在雜交室中固定。在使用單根點樣針進(jìn)行點樣時，很容易保持微陣列芯片上所點樣的樣點與加樣多孔板中樣品之間的相對位置。使用多根點樣針同時點樣時，由于點樣頭中點樣針的固定排列方式，以及加樣板和所點樣陣列之間的排列差異，這種直接的對應(yīng)關(guān)系不復(fù)存在，為此需要有樣品追蹤軟件能夠記錄下陣列上各個位置的樣點所對應(yīng)的樣品，這在處理大量樣品時是極其方便和必要的。點樣針清洗系統(tǒng)由于需要在點樣過程中為點樣針更換點樣材料，因此在給點樣針更換材料前的清洗和干燥對于獲

23、得穩(wěn)定的點樣特性和避免不同點樣材料間的交叉污染至關(guān)重要。點樣針的清洗操作可以使用超聲水浴或者是循環(huán)水浴的方式，也可以將兩者結(jié)合使用。點樣針的干燥一般是使用真空裝置從點樣針上抽吸去殘留的的水分。裝配有點樣針的點樣頭是接觸式點樣系統(tǒng)的核心，點樣儀中的其他組成部件和點樣時的環(huán)境因素對點樣針的可靠性和重復(fù)性有著直接影響。對點樣儀各個部件的狀況進(jìn)行監(jiān)控、維護(hù)、校準(zhǔn)和調(diào)節(jié)有助于獲取最佳的點樣性能。環(huán)境控制一旦點樣針完成加樣，這時樣品溶液的蒸發(fā)效應(yīng)就開始對點樣針上暴露于氣液界面的點樣材料產(chǎn)生影響，使得點樣針中點樣材料的體積和濃度不斷變化。實心點樣針對這種蒸發(fā)現(xiàn)象最敏感，但即使是分叉點樣針，其中所包含的點樣材

24、料體積也會由于蒸發(fā)而越來越少，使得在后續(xù)點樣的樣點中所轉(zhuǎn)移點樣材料的量不斷減少。不僅如此，加樣板中點樣材料的蒸發(fā)也必須得到有效控制。一旦加樣板在實驗室環(huán)境下暴露的時間過長，每個板孔中點樣材料的濃度會隨著液體的蒸發(fā)不斷升高，并且由于不同板孔蒸發(fā)速率的差異會引起不同板孔內(nèi)點樣材料濃度的差異。此外，點樣到支持物表面點樣材料的蒸發(fā)速率也會影響到最終形成的樣點形態(tài)。因此，在商品化的點樣儀中，一般都采用密閉的點樣環(huán)境，使得環(huán)境中的相對濕度恒定在55-70。在制備高密度點樣陣列時，最好將加樣板也放置在冷卻的環(huán)境下，以防止大量樣品蒸發(fā)引起的點樣材料間的巨大差異。在使用蛋白質(zhì)作為點樣材料時，還需要控制點樣臺的溫

25、度，以保持點樣到支持物表面的蛋白質(zhì)的活性，防止其變性和促進(jìn)蛋白質(zhì)分子在支持物表面的固定。由于點樣制備的樣點尺寸一般在數(shù)百微米，空氣中懸浮的粒子和灰塵等對微陣列芯片的質(zhì)量會產(chǎn)生很大影響，這些雜質(zhì)或者是沉積在支持物表面的樣點上對表面張力產(chǎn)生影響，直至影響樣點最終形態(tài)，或者是堵塞點樣針的狹縫，破壞其性能，直至無法點樣。此法，這些粘附在支持物表面的污染物往往在可見光范圍內(nèi)有較強(qiáng)的熒光和散射特性，如果在后續(xù)的芯片反應(yīng)和清洗中不能被清除掉，會對芯片的檢測和成像產(chǎn)生很大影響。為點樣儀配備空氣凈化裝置，通過過濾除去空氣中的帶電粒子和懸浮物，以及使用可以抗靜電的材料對于避免上述污染物對點樣儀中的影響是行之有效的

26、，有助于點樣微陣列制備質(zhì)量的改善。四、 點樣針技術(shù)在微陣列技術(shù)發(fā)展的初期，布朗實驗室和其他一些研究人員使用單一的點樣針來制備微陣列。隨著技術(shù)的發(fā)展和研究的需要，迫切需要制備更高密度的微陣列，這就促進(jìn)了能夠同時向陣列支持物中更多的位置上，更快地進(jìn)行點樣的點樣針和機(jī)械手裝置的發(fā)展。下面逐一介紹各種類型的點樣針。實心針實心針是結(jié)構(gòu)上最為簡單的點樣針。單根實心針的外觀為圓柱形，一般使用不銹鋼、鎢或者鈦等金屬材料制備，用于點樣的一個端部被加工成非常精密的針尖。在點樣過程中，實心針每次所轉(zhuǎn)移液體的量和所形成的樣點形狀都有很好的重復(fù)性。只要在每次為點樣針更換新的點樣材料之前，對實心針進(jìn)行正確的清潔，避免與前

27、次點樣時殘留的點樣材料之間發(fā)生相互的交叉污染，就能夠應(yīng)用實心針點樣制備得到理想的微陣列芯片。由于實心針比其他各種類型的點樣針在結(jié)構(gòu)上都要簡單，因此也是最易于清潔的點樣針，并且不像其他點樣針那樣容易發(fā)生殘留探針的污染和點樣針被堵塞等問題。此外，實心針還能夠較好地耐受點樣過程中點樣針運動時引起的沖擊。通常實心針每次加樣后只能點樣一個樣點，需要重新加樣后才能夠繼續(xù)進(jìn)行點樣過程。每次點樣時轉(zhuǎn)移液體的量取決于針尖的尺寸，直徑越大，每次轉(zhuǎn)移液體的量越多，在陣列支持物上形成的樣點直徑也越大，所制備陣列的樣點密度就越低。與所有其他類型的點樣針相比較，使用實心針點樣時對點樣材料的利用效率最高，樣品浪費不會超過1

28、5，而且每次轉(zhuǎn)移液體的量和所形成樣點在形態(tài)上也很均一，樣點尺寸的變異系數(shù)一般不超過2。但是，實心點每次點樣完一個樣點之后需要重新加樣耗費了大量時間，因此該點樣針最大的不足之處在于其點樣的速度較慢，通量不夠高。為了提高使用實心針點樣的速度，相應(yīng)的機(jī)械手裝置中可以使用裝配了多根實心針的點樣頭，這樣就可以使用多根實心針同時進(jìn)行點樣操作。在應(yīng)用多根實心針同時點樣時，點樣頭所包含點樣針陣列中不同點樣針之間的性能差異是決定所制備陣列質(zhì)量的一個關(guān)鍵因素。一般而言，需要挑選直徑和表面性質(zhì)一致性較好的點樣針來裝配同一個點樣頭，以使得在所制備的點樣微陣列中，來自不同點樣針?biāo)c樣得到的樣點具有較好的一致性。不僅如此

29、，隨著點樣針陣列中點樣針數(shù)目的增加，點樣針之間的差異也逐漸變得顯著起來，而且在點樣過程中個別點樣針出錯的風(fēng)險也會升高，因此在實際使用中為每個點樣頭所裝配點樣針的數(shù)目是有一定限制的，要綜合考慮點樣的通量和質(zhì)量，以及更換個別點樣針對整個點樣過程的影響。微加工點樣針陣列Corning公司使用硅材料制造的點樣板是一種高并行性的點樣裝置，它通過腐蝕的方法在硅材料表面得到超過1000個柱狀結(jié)構(gòu)，直徑為100微米，并以陣列的方式排列。這些柱狀結(jié)構(gòu)可以和一個存儲有點樣材料的漏斗狀樣品池的形狀相匹配。操作時，點樣板上的全部微柱同時分別插入漏斗末端與之匹配的各個溝槽開口，并在回縮時攜帶數(shù)皮升點樣材料，隨后的點樣操

30、作將材料從點樣板的微柱上轉(zhuǎn)移到支持物表面。這種并行點樣方式的優(yōu)點是陣列上樣點之間的距離由點樣板上微柱之間的空間定位決定，而不受點樣時機(jī)械手的位移誤差影響，因此樣點定位精度非常好。不僅如此，在使用這種點樣板點樣制備的微陣列中，每次轉(zhuǎn)移點樣材料的體積和所得到的樣點尺寸的變異系數(shù)小于9，點樣材料的浪費不超過15。然而，應(yīng)用這種微加工點樣針陣列需要非常昂貴的專用點樣設(shè)備。在該設(shè)備中制作陣列的點樣支持物（通常是載玻片）被設(shè)計成在點樣板和漏斗狀樣品池之間移動，這樣就使得每輪點樣操作循環(huán)時機(jī)械手的移動距離最短，從而提高了點樣板加樣時的速度和點樣的通量。針和環(huán)Affymetrix公司研制的點樣儀是唯一使用針和

31、環(huán)結(jié)構(gòu)裝置來進(jìn)行點樣的。圖4中給出了針和環(huán)點樣系統(tǒng)的工作原理。在點樣開始時，首先將一個微型環(huán)狀裝置浸入要點樣的材料中，在表面張力作用下，取出環(huán)后點樣材料會在環(huán)內(nèi)形成一層液膜，薄膜的中央?yún)^(qū)域較厚，并逐漸向邊緣減薄。這時將攜帶了液膜的環(huán)移動到點樣支持物中欲點樣位置的上方，然后讓一根實心針穿過液膜中央，這時實心針的端面會從液膜中粘附少量點樣材料，并在高度繼續(xù)下降與點樣支持物表面發(fā)生接觸時將材料轉(zhuǎn)移到支持物的表面。在環(huán)上液膜較厚時，實心針的運動不會導(dǎo)致液膜結(jié)構(gòu)的瓦解，因此環(huán)上的液膜可以作為樣品的臨時儲存庫，反復(fù)進(jìn)行多次點樣而不需要在每次點樣前都使用環(huán)去重新加樣。由于一次加樣后，在進(jìn)行連續(xù)點樣時環(huán)中所儲

32、存點樣材料的量會隨著使用而逐漸減少，液膜的厚度也會相應(yīng)地逐漸變薄，實心針每次穿過液膜后粘附點樣材料的量也在減少，所以每次點樣到支持物上樣品的量也在發(fā)生微小的變化，這就使得在應(yīng)用這種點樣方式制備的微陣列上，樣點形態(tài)與單純使用實心針點樣時相比較，尺寸變異較大，并呈現(xiàn)出逐步減小的趨勢。使用針和環(huán)結(jié)構(gòu)裝置進(jìn)行點樣的最大局限性在于點樣操作易受環(huán)境因素，特別是濕度和溫度的影響，導(dǎo)致環(huán)中儲存點樣材料溶液的蒸發(fā)和環(huán)上液膜穩(wěn)定性的改變。不僅如此，在給環(huán)結(jié)構(gòu)加樣時，盛放樣品的容器中需要有較多的液體，以便使得整個環(huán)結(jié)構(gòu)能完全浸沒其中，這就造成了樣品容器中最終會殘留較大的死體積而不能用于環(huán)的進(jìn)一步加樣，這部分樣品會被

33、浪費掉；在點樣過程中隨著環(huán)中儲存液體的消耗和薄膜厚度的減小，最終會使得薄膜結(jié)構(gòu)發(fā)生瓦解，這時薄膜破碎前殘留的樣品同樣會被浪費掉。這對于樣品數(shù)量很少或者是樣品來源很珍貴的情況而言，針和環(huán)裝置是一種非常不經(jīng)濟(jì)的點樣方式。例如，給環(huán)加樣時，樣品容器中一個典型的加樣體積需要1.5 ml的樣品溶液，點樣時每個樣點上轉(zhuǎn)移的液體為40 pl，這樣在每張載玻片上使用該點樣材料重復(fù)點樣4個樣點時，每次加樣一共可以連續(xù)點樣42張載玻片，實際消耗6.7 nl樣品，最終有約99.5的樣品材料在點樣時被浪費掉。圖4 針和環(huán)點樣系統(tǒng)。該系統(tǒng)由與樣品溶液表面平行的開口環(huán)和一根垂直穿過環(huán)中央的點樣針組成。首先將環(huán)浸入樣品溶液

34、并提起，這時環(huán)內(nèi)粘附上樣品溶液。點樣時，驅(qū)動點樣針穿過環(huán)中央使得針端面上帶上樣品；然后針的位置持續(xù)下降直到其末端懸掛的液滴與支持物表面接觸。最后將針提升，在重力和表面張力的共同作用下，部分樣品轉(zhuǎn)移到支持物表面，完成點樣過程。（Flowers P, Overbeck J, Mace ML Jr, Pagliughi FM, Eggers WJE, Yonkers H, Honkanen P, Montagu J, Rose SD. Development and Performance of a Novel Microarraying System Based on Surface Tensio

35、n Forces. Available: resources/html/coldspring.html）分叉點樣針分叉點樣針，也稱為鵝毛筆針，如圖5中所示。這類點樣針形狀與古老的書寫鵝毛筆類似，只是在尺寸上要小得多。分叉點樣針的末端通過微加工的方法形成一道狹窄的溝槽，寬度15-50微米，每次加樣量在0.1-0.5微升，通過點樣針末端與點樣支持物表面的輕敲，可以連續(xù)點樣數(shù)百個樣點，其中每個樣點中轉(zhuǎn)移的點樣材料為納升到皮升量級，取決于輕敲的力量、狹縫的尺寸、點樣材料的粘度等參數(shù)。這種點樣針的優(yōu)點在于每次給點樣針加樣后可以連續(xù)點樣大量的樣點，而不需要反復(fù)加樣，得到的樣點在形狀一致性上也較好。分叉點樣

36、針在使用時通過點樣針遠(yuǎn)端的彈簧固定在點樣頭中，點樣時點樣針的輕敲動作可能會造成點樣支持物表面脆弱的化學(xué)修飾層、乃至點樣支持物表面的損傷，或者是點樣針本身或點樣支持物表面某些反應(yīng)性結(jié)合基團(tuán)被去除，導(dǎo)致各個樣點之間點樣材料的非均一性沉積和點樣材料與支持物之間結(jié)合強(qiáng)度的差異。對點樣針更嚴(yán)重的損傷來自于點樣針在點樣頭中的不正確安裝，使得點樣針在垂直方向上的定位出現(xiàn)偏差，這時的點樣操作會使得點樣針和支持物表面損傷和無法繼續(xù)點樣，如果點樣針的針體彎曲嚴(yán)重，還會影響到其附近的其他點樣針正常工作。為此，一些接觸點樣用的點樣針在其安裝末端設(shè)計有定位裝置，以輔助在點樣頭中的安裝。圖5 分叉點樣針。一些分叉點樣針末

37、端的溝槽形狀可以通過一側(cè)向的螺釘進(jìn)行調(diào)節(jié)。點樣時針尖需要輕敲支持物表面，使液體轉(zhuǎn)移到支持物上，這也使得針的耐久性下降。日立公司在其SPBIOTM Microarray Station中使用了一種具有特殊結(jié)構(gòu)的點樣針。這種點樣針末端的中央?yún)^(qū)域有一個截面為X型的溝槽，向內(nèi)凹陷并深入到針體內(nèi)部作為樣品池。由于X型溝槽是密閉在針體內(nèi)的，因此可以很好地防止樣品溶液的蒸發(fā)，點樣制備的樣點形狀也得到了很好的控制。使用這種點樣針每次點樣時分配的樣品材料體積和所得到樣點的形狀尺寸的變異系數(shù)為17%，并且點樣材料的浪費不超過20。Stealth點樣針由TeleChem公司開發(fā)的Stealth點樣技術(shù)，使用平頭的、

38、具有固定體積樣品池的高精度點樣針進(jìn)行接觸點樣。這種Stealth點樣針在結(jié)構(gòu)上與分叉點樣針很接近，是迄今為止使用最為廣泛的點樣針。該公司研發(fā)了一系列不同規(guī)格的Stealth點樣針，通過微加工工藝和拋光工藝制造，分別具有不同的針頭尺寸和樣品池體積，使得用戶可以根據(jù)需要選擇特定的陣列樣點尺寸和樣品池體積，見圖6中。點樣時，每次轉(zhuǎn)移的點樣材料體積和樣點尺寸的變異系數(shù)大約為12（12根針點樣的結(jié)果）。雖然這種具有樣品池結(jié)構(gòu)的點樣針在一次加樣后可以連續(xù)點樣多達(dá)160個以上的樣點，但是仍有大量（大于70）點樣材料被浪費掉，而且為了保證能給點樣針正確加樣，加樣板中必須裝有過量的點樣材料。在正式開始點樣前，這

39、種點樣針要求進(jìn)行預(yù)點樣，以去除針頭上粘附的過多點樣材料，同時避免起初數(shù)個均一性不好的樣點對所制備陣列芯片質(zhì)量的影響，這種現(xiàn)象有時也稱為“最初樣點效應(yīng)（first spot effects）”。此外，點樣時的環(huán)境濕度，以及點樣材料本身的濃度等參數(shù)對點樣材料的轉(zhuǎn)移都有影響。使用Stealth點樣針制備的陣列，樣點之間點樣材料含量的變化較大。圖6 Stealth點樣針。A 點樣針外觀；B 點樣針局部放大； C 圖中上部給出了3種不同型號的點樣針，型號依次為SMP3，SMP3B和SMP3XB，每次加樣可以分別吸取0.25 µl, 0.60 µl 和 1.25 µl點樣材料

40、，圖中標(biāo)尺為200 µm。圖中下方是每種點樣針每次加樣后可以點樣的樣點大小和數(shù)量，所用的點樣材料為濃度500 fmol/µl的Cy3標(biāo)記的寡核苷酸探針溶液，溶解于1X Micro Spotting Solution (MSS)點樣液，點樣支持物為SuperAldehyde玻片，點樣溫度18°C，濕度為50%，樣點間距150 µm，點樣儀為PixSys 5500型。點樣后使用ScanArray Express (PerkinElmer)掃描儀進(jìn)行掃描。圖中從左到右依次是：SMP3 可點樣200個直徑110 µm 樣點，SMP3B可點樣510 個直

41、徑120 µm的樣點，和SMP3XB可點樣780個直徑130 µm的樣點，圖中標(biāo)尺為450 µm。毛細(xì)管點樣針在接觸點樣技術(shù)研究的早期，Genometrix公司研制了一種毛細(xì)管點樣針。這種點樣針由內(nèi)徑極細(xì)的毛細(xì)管構(gòu)成，毛細(xì)管的遠(yuǎn)端與裝載點樣材料的多孔板中的板孔直接相連通，每次點樣時轉(zhuǎn)移點樣材料的體積為納升量級。由于使用多孔板作為樣品池，這種設(shè)計緩解了分叉點樣針中所存在的樣品溶液蒸發(fā)問題。然而在加樣和點樣過程中，點樣針的密閉毛細(xì)管結(jié)構(gòu)對毛細(xì)管內(nèi)氣泡的形成非常敏感。氣泡的存在會導(dǎo)致操作過程中對毛細(xì)管內(nèi)液體的流體靜壓力控制變得困難，這直接影響到給點樣針加樣和點樣過程，造

42、成在點樣中陣列支持物上樣點沒有被點上的“空點”現(xiàn)象，或者是向一個樣點上轉(zhuǎn)移過多的點樣材料，造成樣點變大，并有可能擴(kuò)展到鄰近的樣點。另一種類似的毛細(xì)管點樣針由Vysis公司研制，用于為該公司的Genosensor System儀器制備DNA芯片。該毛細(xì)管點樣針使用了內(nèi)徑為25-75微米的、短的不銹鋼針，在點樣針的一側(cè)末端帶有一個塑料的樣品池，用于貯存點樣用的DNA材料，毛細(xì)管與高精度的氣壓系統(tǒng)相連接。點樣時毛細(xì)管快速下降，停留在距離點樣支持物表面20到50微米的高度上，此時由于慣性作用毛細(xì)管內(nèi)液體在點樣針的尖端形成液滴，體積約為300皮升。盡管點樣針與點樣支持物之間不發(fā)生直接接觸，這時一個施加在

43、毛細(xì)管上的、持續(xù)時間在毫秒數(shù)量級的氣壓脈沖將該液滴擠出到點樣支持物表面，實現(xiàn)點樣操作。這種點樣針的優(yōu)點在于點樣時不需要點樣針直接接觸點樣支持物，因而不會造成對點樣支持物表面的損傷。與點樣針相連通的樣品池也提供了足夠的點樣材料，一次加樣后可以使用相同材料點樣足夠多的樣點，并且可以有效防止點樣材料的蒸發(fā)，允許在各輪點樣的間隔期對點樣針進(jìn)行保存。然而，這種點樣針的一個缺點是由于每次只能使用一根該毛細(xì)管點樣針進(jìn)行點樣，并且在更換點樣針后需要對針頭的定位進(jìn)行精確的重新校準(zhǔn)，因而只適合于制備包含數(shù)百個樣點的較小陣列。微加工毛細(xì)管點樣針和鵝毛筆針通過微加工技術(shù)，可以制備內(nèi)徑更小的毛細(xì)管點樣針，這時通過表面張

44、力的差異使得點樣材料在微毛細(xì)管內(nèi)移動。這種微加工毛細(xì)管點樣針可以點樣直徑16±3微米的樣點，這一尺寸要比常用的點樣針小一個數(shù)量級。Oxford Laser研制的MicroSpot點樣針采用金屬鎢為材料，通過激光切割在針體上制作寬度為5微米的狹縫，每次加樣的體積為55納升，點樣時轉(zhuǎn)移的樣品材料體積為50皮升?？梢詫⑦@種點樣針制作成以陣列方式排列的，包含10K個針尖的點樣工具，應(yīng)用這種工具在一張標(biāo)準(zhǔn)的載玻片上可以點樣100000個樣點。Parallel Synthesis Technologies使用硅材料，通過微加工技術(shù)，制作了一種分叉點樣針，見圖7。由于硅比金屬的硬度高，因此硅材料制

45、作的點樣針更加耐磨，有很高的點樣精度和重復(fù)性。圖7 使用微加工技術(shù)制作的分叉點樣針。上圖，陣列針尖的掃描電鏡照片，針尖區(qū)域大約為200´ 200 mm；下圖，包含有48根微加工點樣針的點樣頭。高并行度光纖狀毛細(xì)管點樣工具GenoSpectra研發(fā)了一種新型的點樣技術(shù)，稱為FiberPrint，可以將液體樣品以很高的并行度轉(zhuǎn)移到平整的支持物表面。一臺全自動的FiberPrint系統(tǒng)，可以在載玻片上點樣10368種可以獨立尋址的DNA樣品材料，每個樣點可以重復(fù)3次，這樣在一張玻片上可以點樣30000多個樣點。如圖8該系統(tǒng)中采用了一種特殊的點樣頭，其中包含10000多根光纖狀的毛細(xì)管，這些

46、毛細(xì)管集束在一起，形成一個平整的點樣頭表面。用于點樣的DNA或蛋白質(zhì)等生物材料臨時存放在多孔板中，并放置在加壓艙內(nèi)。點樣頭的一端較大，可以和存放樣品的多孔板上板孔相匹配；另一端被拉制成細(xì)圓錐形，用于點樣。加樣過程通過加壓艙與艙外環(huán)境的壓力差，使得點樣材料從多孔板的板孔進(jìn)入到點樣頭中的毛細(xì)管內(nèi)。點樣時每個樣點上轉(zhuǎn)移的材料量約為400皮升，而且就整個點樣頭中所有毛細(xì)管而言，變異系數(shù)在9左右。圖8 FiberPrint點樣系統(tǒng)示意圖。一次性點樣針VP-Scientific研制了一種使用聚丙烯為材料的、一次性使用的預(yù)成形點樣針陣列，陣列中包含的點樣針數(shù)目為96、384或1536，每根點樣針點樣時轉(zhuǎn)移的

47、樣品材料體積為120-135納升，變異系數(shù)為8-12%?？梢酝ㄟ^適配器將這種點樣針陣列安裝到多種點樣儀設(shè)備的點樣頭上，每次加樣時可以將存放樣品材料的多孔板中所有樣品一次性地加樣到點樣針陣列的每根點樣針上。由于不需要清洗點樣針以備反復(fù)使用，因此消除了為點樣針更換點樣材料時先前殘留的材料可能會被帶入新一輪點樣過程而造成交叉污染的問題。不僅如此，該公司可以提供適合于多種不同型號點樣儀的點樣針陣列適配器，這就提高了這種預(yù)成形點樣針陣列在使用上的通用性。蘸水筆納米圖案制備技術(shù)蘸水筆納米圖案制備技術(shù)（dip-pen nanolithography，DPN）技術(shù)是基于掃描探針顯微術(shù)的表面納米結(jié)構(gòu)制備技術(shù)，其

48、基本原理簡圖9。它利用原子力顯微鏡的針尖將生物分子轉(zhuǎn)移到支持物表面，并排列成納米尺度的特定圖案結(jié)構(gòu)。它和下面要介紹的微接觸印刷技術(shù)都是當(dāng)前制作納米微陣列芯片的重要技術(shù)手段。圖9蘸水筆納米圖案制備技術(shù)示意圖。微接觸印刷技術(shù)微接觸印刷（microcontact printing, mCP）技術(shù)是利用具有微納米圖案的、較軟的高分子材料作為印章，把附著于其上的目標(biāo)物質(zhì)轉(zhuǎn)移到支持物上，從而得到與印章上微納米圖案類似的目標(biāo)結(jié)構(gòu)。除了上面介紹的各種類型點樣針以外，目前還有許多研究正致力于新型材料或設(shè)計的點樣針的開發(fā)，所有這些努力，必將促進(jìn)點樣針技術(shù)的發(fā)展和點樣微陣列芯片制備技術(shù)的日臻成熟。五、 點樣過程的質(zhì)

49、量控制點樣儀系統(tǒng)的優(yōu)化新的點樣儀在開始使用前，整個系統(tǒng)必須進(jìn)行正確的調(diào)整，以獲取最佳點樣結(jié)果。首先在安裝新的點樣儀設(shè)備時，要使用氣泡式水平儀檢查安放機(jī)械手裝置的系統(tǒng)板的水平度，并通過調(diào)節(jié)點樣儀支撐腳的高度、或者是在支撐腳下面添加必要墊片的方式進(jìn)行校準(zhǔn)。在完成對整個機(jī)械手裝置系統(tǒng)板的水平調(diào)節(jié)后，緊接著要調(diào)整水平的是點樣臺，如果有必要，仍然需要通過添加墊片的方式進(jìn)行調(diào)節(jié)。下面，需要對機(jī)械手裝置中X和Y軸的共面性進(jìn)行調(diào)整。最好使用帶底座的千分表，分別與待測試的X或Y軸相連接，如圖10中所示?？梢允紫日{(diào)節(jié)底座的位置，使得千分表固定在機(jī)械手一個運動軸上與點樣臺接觸后，指示的讀數(shù)在500微米附近；然后關(guān)閉

50、點樣儀的電源，手工推動該運動軸使得千分表沿著點樣臺或是其他平面移動，通過觀察千分表的讀數(shù)發(fā)現(xiàn)可能存在的機(jī)械手X或Y軸的水平誤差。這一步驟要分別在X和Y軸的不同位置上進(jìn)行多次重復(fù)測量，直至覆蓋X和Y軸在點樣臺上的全部行程范圍，這時千分表所指示的讀數(shù)必須滿足隨機(jī)偏差最小和最大偏差不超過500微米。如果實際測量結(jié)果達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)，必須對機(jī)械手X或Y軸進(jìn)行調(diào)整，或添加墊片。當(dāng)然，這里給出的數(shù)值都是典型值，針對不同的點樣儀系統(tǒng)，需要根據(jù)實際情況進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。比如，機(jī)械手X或Y軸的行程越短，這一偏差值應(yīng)該越小。同時，所容許的測量偏差值也受到測量時的參考平面，如點樣臺自身水平度的影響。圖10使用千分表檢查機(jī)械

51、手裝置中X和Y軸的共面性。上述工作完成后，接著需要調(diào)整的是點樣頭的安裝，調(diào)整的方式也類似。這時，需要將千分表座固定在點樣臺上，分別移動機(jī)械手X或Y軸的同時對點樣頭底部的邊沿進(jìn)行測量。由于點樣頭的長度要比X或Y軸短得多，因此所容許的偏差應(yīng)該不超過100微米。如果這一標(biāo)準(zhǔn)不滿足，必須對點樣頭進(jìn)行調(diào)整或者是加墊片。在完成對點樣儀系統(tǒng)的機(jī)械調(diào)整和校驗后，有時需要將點樣臺表面起伏的情況全部測量和記錄下來，這樣在正式開始點樣時，就可以利用預(yù)先測量得到的點樣臺表面高度偏差值，對點樣儀Z軸的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。這一工作可以通過手工的方式來完成，這時只要通過點樣儀的控制軟件逐步移動點樣頭，并記錄下X和Y軸坐標(biāo)，以及該

52、位置所對應(yīng)的千分表讀數(shù)；或者也可以通過點樣儀上裝配的合適位置傳感器和對應(yīng)軟件來自動完成。如果為點樣儀安裝新的點樣頭，必須對點樣儀系統(tǒng)進(jìn)行重新調(diào)整和校準(zhǔn)，使得點樣、加樣、點樣針的清潔和干燥位置適合于調(diào)整后的點樣頭。點樣時，點樣頭在高度設(shè)定上應(yīng)該使得所有點樣針的尖端與支持物表面接觸，并在Z軸方向上有一個小的過行程，以確保在點樣過程中所有點樣針均可以和支持物表面接觸而不會發(fā)生“空點”的現(xiàn)象。大多數(shù)點樣儀中，過行程一般設(shè)定為25-100微米。如果已經(jīng)對點樣臺的表面高度起伏進(jìn)行測量并保存了這些數(shù)據(jù)，那么只要對一個位置上的過行程進(jìn)行設(shè)定就可以了。加樣位置的調(diào)整要使得用于加樣的多孔板的中心位置與點樣針對應(yīng)，

53、點樣針深入多孔板的深度應(yīng)該設(shè)定在距離多孔板底部100微米，這樣既可以避免點樣針接觸多孔板底部發(fā)生損傷，又能夠充分利用點樣材料。點樣針清洗位置的調(diào)整應(yīng)該使得點樣針的針尖在清洗池中的浸入位置要比它在加樣板中加樣時的浸入位置深一些，這樣可以保證針尖區(qū)域得到充分的清潔。在一些點樣儀所配置的超聲清洗裝置中，清洗效率依賴于浸入的深度，這時必須根據(jù)經(jīng)驗進(jìn)行合適的調(diào)整以保證針尖的浸入深度最佳。需要注意的是，處在某些浸入深度上時，超聲清洗時針尖會發(fā)生共振現(xiàn)象，應(yīng)該注意避免這類情形的發(fā)生。此外，針尖干燥位置的選擇也應(yīng)該根據(jù)經(jīng)驗來確定，使得清洗后的點樣針在最短時間內(nèi)得到完全的干燥。與點樣過程有關(guān)問題不正常的點樣過程

54、常常表現(xiàn)為樣點尺寸變化較大、偏離點樣針標(biāo)稱的直徑，和出現(xiàn)“漏點”。造成這些現(xiàn)象的原因可能來自四個方面，即機(jī)械手裝置、點樣針、點樣材料，以及點樣的環(huán)境因素。機(jī)械手裝置與機(jī)械手裝置有關(guān)的錯誤通常是可重復(fù)性的，在點樣儀的工作中會反復(fù)出現(xiàn)。例如，在點樣臺的同一位置上，偏離點樣針標(biāo)稱直徑的樣點重復(fù)出現(xiàn)，這時可能就需要對該位置處點樣針的高度進(jìn)行調(diào)整。如果點樣頭一側(cè)所點樣的樣點尺寸與另一側(cè)相比總是變化較大，這時就可能需要對點樣頭的水平度進(jìn)行調(diào)節(jié)。有時由于點樣針干燥裝置的機(jī)械位置出現(xiàn)誤差，會使得點樣頭中少數(shù)或個別點樣針上仍有水跡殘留，這些點樣針對應(yīng)的支持物表面會產(chǎn)生“漏點”現(xiàn)象。如果在更換點樣材料的各輪點樣操

55、作之間，點樣針的干燥程度不同，這會導(dǎo)致隨機(jī)性的“漏點”現(xiàn)象。點樣針點樣針問題也通常也表現(xiàn)為系統(tǒng)性的偏差，例如點樣頭中特定位置上點樣針的點樣行為總是不正常。查找這種類型錯誤時，一個有效的方法是更換點樣針的位置重新將點樣針在點樣頭中排列，然后確定錯誤總是與點樣頭上特定的位置對應(yīng)，還是總是伴隨某根特定的點樣針。在點樣頭中，有時會發(fā)生點樣針粘滯在固定套管中而無法自由活動的情況，這時在點樣操作完成后點樣針無法返回到初始的位置上，帶來的影響是在下次點樣時點樣針可能無法與支持物表面發(fā)生接觸，或是點樣針無法繼續(xù)加樣，或是點樣針的清洗和干燥不正常。對點樣針及它在點樣頭中對應(yīng)的安裝位置進(jìn)行清潔通常可以解決這一問題

56、。點樣時隸屬于某根特定點樣針的樣點尺寸發(fā)生變化，常常是由于該點樣針的磨損所引起的，這在金屬材料制作的點樣針中是較為常見的問題。如果點樣針的尖端在使用中被磨平，那么常常引起樣點尺寸的增大；如果毛細(xì)管點樣針的開口被堵塞，則會使得點樣的樣點尺寸變小。陶瓷或者硅材料制作的點樣針由于材料的質(zhì)地較硬，因此不容易受到這類問題的影響。如果點樣針被疏水性材料，如點樣儀中潤滑機(jī)械部件的硅潤滑劑污染，那么通常會造成該點樣針完全停止點樣。點樣材料點樣得到的樣點尺寸與加樣板中點樣材料在濃度和體積上的一致性，以及選擇合適點樣緩沖液之間有著密切的關(guān)系。當(dāng)加樣板某些孔中點樣材料的濃度過低時，點樣得到的樣點會有較大的變化。使用

57、來自同一塊加樣板中的點樣材料進(jìn)行重復(fù)點樣時，很容易發(fā)現(xiàn)這類問題。同時，對裝載點樣材料的多孔板也要進(jìn)行挑選，選取那些平整的多孔板，以確保點樣頭上所有點樣針都能夠得到正確加樣。點樣用的支持物可以使用自制的、或者是購買的商品，但是都必須要具有均一性的包被，以獲得最佳的點樣特性?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的DNA材料，如鯡魚精DNA進(jìn)行點樣來評價支持物包被是否符合點樣的要求。包被質(zhì)量較差的支持物表面，其上點樣得到的樣點通常表現(xiàn)為大小與標(biāo)稱值不符，并且這些例外樣點的出現(xiàn)是隨機(jī)性的，與點樣針位置、特定點樣材料，或者是機(jī)械手裝置移動的特定位置無關(guān)。一般而言，支持物表面所修飾的包被有一定的使用時間限制，不要使用超過保存期的

58、支持物點樣。在使用聚賴氨酸包被的玻片作為支持物時，點樣用的DNA一般懸浮于3´SSC（sod ium chloride and sodium citrate，氯化鈉和檸檬酸鈉）緩沖液中。但是，許多研究人員也使用50的二甲亞砜緩沖液，因為有報道這種緩沖液可以使DNA變性，從而有利于芯片上的分子雜交反應(yīng)，并且這種緩沖液的蒸發(fā)速率要比SSC低，因而在點樣時可以將點樣材料長時間保存在開口的多孔板中，從而適合于點樣過程時間較長的場合。此外，許多商品化的點樣支持物同時也提供了專用的點樣緩沖液。點樣環(huán)境正如前面提到的那樣，點樣時的溫度和濕度對所制備點樣微陣列芯片的質(zhì)量有很大影響。較高的環(huán)境溫度和較低的濕度將使得點樣材料在點樣針上發(fā)生過早的干燥，從而使得樣點的質(zhì)量逐漸變差。點樣過程的質(zhì)控方法關(guān)于點樣微陣列芯片制備過程中質(zhì)量