肝細(xì)胞癌中卵圓細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá)及意義

1、 作者：顏政 周為 方馳華 作者單位：(1.青海高校附屬醫(yī)院腫瘤外科;2.南方醫(yī)科高校珠江醫(yī)院肝膽外科)【摘要】 目的 探討卵圓細(xì)胞部分表面標(biāo)記在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)狀況和意義。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)SABC法檢測20例肝細(xì)胞癌中CK7、CK19、CK18、CD34、c-kit 抗原的表達(dá)。結(jié)果 14例肝細(xì)胞癌CK7表達(dá)呈陽性，其陽性表達(dá)率為70%(14/20);9例c-kit 的陽性表達(dá)率為45%(9/20);在20例肝細(xì)胞癌癌組織中的CK18全部呈陽性表達(dá)，CK19和CD34全部呈陰性表達(dá)。CK7、c-kit表達(dá)與患者年齡、性別無關(guān)，與腫瘤大小、是否合并肝硬化以及組織學(xué)分級也不相關(guān)(P0.05

2、)。結(jié)論 肝細(xì)胞癌癌組織中存在表達(dá)卵圓細(xì)胞表面標(biāo)記的細(xì)胞，其表達(dá)CK7、c-kit，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記物CD34。其進(jìn)一步提示，肝細(xì)胞癌可能不是起源于肝干細(xì)胞而是來源于過渡性的前體細(xì)胞/祖細(xì)胞，如來源于Hering管的卵圓細(xì)胞。 顏政(1963)，男，漢族，湖南籍，副主任醫(yī)師,博士【關(guān)鍵詞】 卵圓細(xì)胞 表面標(biāo)記 肝細(xì)胞癌 肝臟干細(xì)胞EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF SURFACEMARKERS OF OVAL CELLS IN HEPATIC CELLULAR CARCINOMAYan Zheng1， Zhou Wei1， Fangh Chihua2(1.Depa

3、rtment of Tumor Surgery, Qinghai University Affiliated Hospital;2.Department of General Surgery, Zhujiang Hospital, The Southern Medical University)Abstract Objective To identify the expression of surface markers on oval cells and explore its implications in hepatic cellular carcinoma(HCC). Methods

4、Surface markers of oval cells (CK7, CK18, CK19, CD34 and c-kit) antigen was tested using histochemical method (SABC) in 20 cases with hepatic cellular carcinoma. Results Expression of CK18 was positive in all 20 hepatic cancer samples. Expression of CK19 was not observed in all hepatic cancer sample

5、s except in the sample of epithelial cell of small bile duct and expression of CD34 was not observed in all hepatic cancer samples. CK7 expression was positive in 14 HCC samples (14/20, 70%) and c-kit expression was positive in 9 samples (9/20, 45%). Expression of CK7 and c-kit were not found in 4 s

6、amples of parenchyma cells of normal hepatic tissues. The expression of CK7 and c-kit is not related to the age, gender of patients, neither to compilation of hepatocirrhosis or histological classification (P 0.05). Conclusion In HCC tissues, there are cells that can express surface markers of oval

7、cells. These cells can express CK7 and c-kit, but cannot express CD34, the marker of hematopoietic stem cell. This suggests that HCC may not be originated by hepatic stem cell, but rather by transitional progenitor cell, such as the oval cell originated from Hering duct.Key words Oval cell Surface m

8、arker Hepatic cellular carcinoma Hepatic stem cell 目前，有關(guān)肝細(xì)胞癌的細(xì)胞源商量取得了較大進(jìn)展，已有實驗提示肝內(nèi)卵圓細(xì)胞在致癌因素的作用下可向癌細(xì)胞異常分化，已經(jīng)有不少學(xué)者從肝癌組織中發(fā)現(xiàn)了卵圓細(xì)胞(Oval cell,OVC)的存在1，2。但原發(fā)性肝癌是否來源于肝卵圓細(xì)胞成熟受阻的過程還未有定論，因此沒有肝卵圓細(xì)胞進(jìn)展為原發(fā)性肝癌的直接證據(jù)。肝卵圓細(xì)胞是肝干細(xì)胞的子代，被認(rèn)為是由干細(xì)胞分化而來，具有雙向分化潛能，既可分化為肝細(xì)胞，也可分化為膽管上皮細(xì)胞，具有一過性地表達(dá)肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的特性。因此，卵圓細(xì)胞既部分表達(dá) 肝細(xì)胞型 CK組型CK

9、8和CK18，還表達(dá) 膽管型 CK組型CK7和CK19。很多學(xué)者提出上述特性甚至可以在肝細(xì)胞性肝癌(Hepatic Cellular Carcinoma,HCC)及膽管細(xì)胞性癌(Intrahepatic Cholanglo Carcinoma, ICC)中得到保持。然而，目前對此生疏尚未統(tǒng)一。假設(shè)肝細(xì)胞癌來源于肝臟干細(xì)胞，我們擬利用免疫組織化學(xué)商量方法檢測肝臟干細(xì)胞部分表面標(biāo)記在肝細(xì)胞癌癌組織中的表達(dá)，探究肝細(xì)胞癌卵圓細(xì)胞可能的起源。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 病理組織20例肝細(xì)胞癌組織及4例正常肝臟標(biāo)本均取自南方醫(yī)院外科。肝細(xì)胞癌為主要商量對象，取正常肝組織作正常對比。肝癌組織標(biāo)本

10、均在患者首次手術(shù)時從肝內(nèi)取材(全部病人術(shù)前均未行化療和放療)，主要觀察腫瘤組織和癌旁組織。全部組織用10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，切片(4 m)備用。1.1.2 主要試劑第一抗體是鼠抗人CK7IgG 、CK19 IgG、CK18 IgG、CD34 IgG、c-kit IgG，由北京中山生物公司供應(yīng)，稀釋比例為1:100;正常山羊血清封閉液為武漢博士德生物公司產(chǎn)品。其次抗體免疫組化檢測試劑及顯色劑DAB為北京中山生物公司產(chǎn)品。1.2 實驗方法標(biāo)本常規(guī)脫蠟、水化。PBS洗滌(5 min 2次)，用3 % H2O2 阻斷內(nèi)源性過氧化酶，用微波修復(fù)抗原，PBS洗滌(2min 3次)，滴加羊血清封

11、閉液，室溫下孵育10 min;滴加一抗IgG，37水浴孵育2 h， PBS洗滌(2min 3次)，滴加生物素二抗羊抗鼠IgG，37水浴孵育20min;PBS洗滌(2min 3次)，滴加試劑SABC，37水浴孵育20 min，PBS洗滌(2min 3次)，DAB顯色;蘇木素輕度復(fù)染50s，經(jīng)脫水、透明處理后用中性樹脂封片，待鏡下觀察。用PBS代替一抗作陰性對比，用已知c-kit 和CD34表達(dá)呈陽性的胃腸道間質(zhì)瘤組織作陽性對比，細(xì)胞漿和(或)細(xì)胞膜呈棕黃色為陽性染色。取5個有代表性的高倍鏡視野，觀察100個細(xì)胞并計算陽性細(xì)胞數(shù)，平均陽性細(xì)胞數(shù) 10%為陽性。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS10.0

12、軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理。組間患者的年齡比較應(yīng)用獨立樣本t檢驗;各組間比較接受兩獨立樣本秩和檢驗或Fishers精確概率檢驗;P 0.05為有顯著意義。2 結(jié)果2.1 臨床病理特征20例肝細(xì)胞癌組織均經(jīng)術(shù)后病理確診，其中高分化癌4例，中分化癌12例，低分化癌4例。20例患者中，男性15例，女性5例;合并肝硬化者10例，腫瘤直徑大于3 cm 者12例(表1)。切片經(jīng)蘇木精-伊紅染色后在光鏡下觀察，癌細(xì)胞胞漿呈嗜伊紅性，核深染色大小不等，多見核分裂相。2.2 免疫組化結(jié)果在20例肝細(xì)胞癌組織中CK18表達(dá)均呈陽性，CK18表達(dá)于細(xì)胞漿及細(xì)胞膜，呈棕黃色，CK18表達(dá)陽性細(xì)胞呈彌漫性分布(圖1)。在20例肝

13、細(xì)胞癌組織細(xì)胞中，除了在小膽管上皮表達(dá)CK19外，沒有1例腫瘤細(xì)胞表達(dá)CK19(圖2)。正常肝組織的肝細(xì)胞表達(dá)CK18，膽管上皮表達(dá)CK19。CK7 多表達(dá)于細(xì)胞漿，顏色為棕黃(圖3)。CK7 陽性細(xì)胞呈點狀、片狀分布，或呈彌漫性分布，可以位于癌組織中央?yún)^(qū)域，也可以位于癌結(jié)節(jié)的外緣;還可見到較腫瘤細(xì)胞小，而形態(tài)呈卵圓形的CK7表達(dá)陽性細(xì)胞分布在癌結(jié)節(jié)外，其細(xì)胞核大，胞質(zhì)少，核漿比高 (圖4)。表1顯示，14例肝細(xì)胞癌CK7表達(dá)陽性，表達(dá)率為70%(14/20)，在4例正常肝臟的實質(zhì)細(xì)胞內(nèi)未見CK7表達(dá)，CK7表達(dá)與患者年齡、性別無關(guān)，與腫瘤大小、是否合并肝硬化以及組織學(xué)分級也不相關(guān)(P0.05

14、)，見表2。表120例肝細(xì)胞癌病人臨床病理特征c-kit表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜，陽性染色者為棕黃色細(xì)顆粒狀，陽性細(xì)胞呈散在或片狀分布，在癌結(jié)節(jié)的外圍可見到黃染的小卵圓細(xì)胞(圖5)。9例表達(dá)c-kit，陽性率為45%(9/20);在4 例正常肝組織實質(zhì)細(xì)胞內(nèi)未見c-kit 表達(dá)。此外，c-kit 表達(dá)與患者年齡、性別無關(guān)，與腫瘤大小、是否合并肝硬化以及組織學(xué)分級也不相關(guān)(P0.05)，簡略結(jié)果見表3。在20例肝細(xì)胞癌組織中， 除毛細(xì)血管上皮表達(dá)CD34外，沒有1例腫瘤細(xì)胞表達(dá)CD34。表2肝細(xì)胞癌CK7 免疫組化和臨床病理特征3 商量通常正常肝細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞型表面標(biāo)記CK18、CK83,4，而膽管

15、細(xì)胞表達(dá)膽管型的表面標(biāo)記CK7，CK1935。很多學(xué)者提出上述差別甚至可以在HCC及膽管細(xì)胞性癌ICC中得到保持。因此，CK組型曾被用作肝癌分型的一種標(biāo)志。然而，目前對此還存在爭議，有學(xué)者對HCC進(jìn)行石臘切片和免疫組織染色，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)含有CK19 異常表達(dá)的癌細(xì)胞6。另有學(xué)者認(rèn)為HCC來源于一種能表達(dá) 膽管型 CK的細(xì)胞7，因此認(rèn)為肝細(xì)胞特異性表型在腫瘤發(fā)生過程中并不總是保持不變8。而我們的商量發(fā)現(xiàn)，全部樣本肝細(xì)胞癌組織都表達(dá)CK18，部分表達(dá)CK7，不表達(dá)CK19，部分支持上述觀點，提示肝癌可能來源于一種能表達(dá) 膽管型 CK的細(xì)胞。卵圓細(xì)胞是肝干細(xì)胞的子代，一般認(rèn)為位于小葉膽管和 Hering

16、 管道中，具有雙向分化潛能，既可分化為肝細(xì)胞，也可分化為膽管上皮細(xì)胞9，因此肝臟祖細(xì)胞表達(dá)膽管上皮和肝細(xì)胞標(biāo)記。從個體發(fā)生來看，肝干細(xì)胞分化的不同時期表達(dá)不同的標(biāo)記。在人類妊娠814周，肝內(nèi)具有雙向分化潛能的干細(xì)胞可能為CK14和CK19雙陽性細(xì)胞，隨后向膽管上皮分化者其CK19表達(dá)增強，而CK14表達(dá)消失。孕期第79 周，肝門四周門靜脈大分支周圍消失一些對CK8 、CK18 和CK19的免疫反應(yīng)明顯增強的增殖細(xì)胞，在孕期9周以后進(jìn)化為 膽管極 并逐漸分布于整個肝臟，孕12周時 膽管極 逐漸改建成單個的小葉內(nèi)膽管，孕20 周以后 膽管極 細(xì)胞開頭對CK7 產(chǎn)生免疫反應(yīng)，意味著這群細(xì)胞消失了與正

17、常成人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞相像的一組多肽。后來的商量也證實了同樣的過程10。因此，通過觀察肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞標(biāo)記的共同表達(dá)，我們可以推測HCC起源于肝臟干細(xì)胞或前體細(xì)胞/祖細(xì)胞11,12。在肝卵圓細(xì)胞和造血干細(xì)胞上部分表達(dá)相同的細(xì)胞表面標(biāo)記，在嚙齒類動物有c-kit、CD34以及Thy-1，在人類共同表達(dá)c-kit和CD3413，14。因此有學(xué)者推測，至少部分卵圓細(xì)胞起源于骨髓干細(xì)胞15。肝干細(xì)胞可以通過檢測共同表達(dá)肝細(xì)胞型表面標(biāo)記(CK18或CK8)、膽管細(xì)胞表達(dá)膽管型的表面標(biāo)記(CK19或CK7)以及造血干細(xì)胞表面標(biāo)記(CD34、c-kit)確定1315。c-kit是人類原癌基因，編碼跨膜酪氨酸

18、激酶的受體(CD117)。c-kit主要在肥大細(xì)胞、定向造血干細(xì)胞、肝干細(xì)胞和一些腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。對暴發(fā)性肝衰竭和正常肝組織表達(dá)肝干細(xì)胞因子及其受體(SCF/c-kit)的商量顯示，SCF/c-kit系統(tǒng)的表達(dá)與肝損傷后的修復(fù)有關(guān)，c- kit陽性細(xì)胞可能就是肝內(nèi)特異性干細(xì)胞團(tuán)14。CD34是一種重糖化I型跨膜蛋白，在最早的造血祖細(xì)胞上高水平表達(dá)，當(dāng)成熟的血細(xì)胞失去形成克隆的能力時，表面表達(dá)則減低到檢測不出的水平。CD34在除血竇內(nèi)皮細(xì)胞以外的全部小血管內(nèi)皮細(xì)胞中均表達(dá)，且還可以在組織干細(xì)胞(如肝干細(xì)胞)16，17中表達(dá)。肝干細(xì)胞表達(dá)c-kit和CD34 1416，但是在Hering管細(xì)胞中c

19、-kit陽性的細(xì)胞CD34呈陰性表達(dá)18，其可能是肝細(xì)胞的前體細(xì)胞/祖細(xì)胞。我們通過免疫組化法商量了肝細(xì)胞癌中c-kit和CD34的表達(dá)。在商量中有45%(9/20)的肝細(xì)胞性肝癌表達(dá)c-kit，而CD34則無表達(dá)。c-kit陽性而CD34無一例陽性提示，HCC可能不是起源于肝干細(xì)胞而是來源于過渡性的前體細(xì)胞/祖細(xì)胞，如來源于Hering管的卵圓細(xì)胞。c-kit的表達(dá)與血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移有關(guān)，有可能促進(jìn)新血管的形成;也有可能增加酪氨酸激酶的活性，導(dǎo)致新生血管的形成而促進(jìn)腫瘤的生長19。CK7是膽管型細(xì)胞角蛋白，通常表達(dá)于膽管上皮細(xì)胞，而不表達(dá)于肝細(xì)胞20 ,21，正如本商量所顯示的實驗結(jié)果。但是，在肯定病理生理條件下，細(xì)胞角蛋白可以發(fā)生表達(dá)異常22。我們觀察到70%(14/20)的肝細(xì)胞性肝癌表達(dá)CK7，提示在肝細(xì)胞增殖和癌變過程中，細(xì)胞表型發(fā)生