第四章基因克隆的載體1

1、 基因克隆的載體基因克隆的載體 載體（載體（vectorvector）是由在細(xì)胞中能）是由在細(xì)胞中能夠自主復(fù)制的分子構(gòu)成的一種夠自主復(fù)制的分子構(gòu)成的一種遺傳成分，通過實(shí)驗(yàn)手段可使其它的遺傳成分，通過實(shí)驗(yàn)手段可使其它的片段連接在它的上面，而進(jìn)行片段連接在它的上面，而進(jìn)行復(fù)制，作為基因工程的載體，必須具復(fù)制，作為基因工程的載體，必須具備以下幾個(gè)性能：備以下幾個(gè)性能： 1 1、分子較小，可攜帶比較大的片段。、分子較小，可攜帶比較大的片段。 2 2、能獨(dú)立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。、能獨(dú)立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。 3 3、要有盡可能多種限制酶的切割位點(diǎn)，但每一種限制酶、要

2、有盡可能多種限制酶的切割位點(diǎn)，但每一種限制酶又要最少的切割位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)又要最少的切割位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn) multiple cloning multiple cloning sites sites ，MCSMCS） 。 4 4、有適合的標(biāo)記，易于選擇。、有適合的標(biāo)記，易于選擇。 5 5、有時(shí)還要求載體要能啟動(dòng)外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，、有時(shí)還要求載體要能啟動(dòng)外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并且盡可能是高效的表達(dá)。并且盡可能是高效的表達(dá)。 6 6、從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在、從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實(shí)驗(yàn)室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等等。某些實(shí)驗(yàn)室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制

3、等等。 功功 能能克隆載體克隆載體: : 克隆一個(gè)基因或克隆一個(gè)基因或DNADNA片斷片斷表達(dá)載體表達(dá)載體: : 用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá)用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá)整合載體整合載體: : 把一個(gè)基因插入到染色體組中把一個(gè)基因插入到染色體組中來源：來源： 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 噬菌體載體噬菌體載體 柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒載體 真核細(xì)胞克隆載體真核細(xì)胞克隆載體質(zhì)粒*受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例 E.coli環(huán)狀 8*pUC18/19 , T-載體pGEM- 3z等 噬菌體E.coli線狀9 - 24kbEMBL系列， gt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀 10 kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35

4、- 45kbpJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV BAC (Bacterial Artificial Chromosome)E.coli環(huán)狀300 kbPel oBAC系列PAC (P1-derived Artificial chromosome)E.coli環(huán)狀100 - 2000 kbPCYPAC1YAC (Yeast Artificial chromosome )酵母細(xì)胞線性染色體100 - 2000 kbMAC (Mammalian Artificial Chromosome)哺乳類細(xì)胞線性染色體 1000 kb病毒載體動(dòng)物細(xì)胞環(huán)狀SV40 載體，昆蟲

5、桿狀病毒載體穿梭載體動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒載體的種類和特征載體的種類和特征1.1.質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmidplasmid）載體）載體 質(zhì)粒是一種獨(dú)立于染色體外的小分子環(huán)狀質(zhì)粒是一種獨(dú)立于染色體外的小分子環(huán)狀DNADNA，一，一般大小約般大小約10106 610108 8D D，可自身復(fù)制和表達(dá)，有的質(zhì)粒還帶，可自身復(fù)制和表達(dá)，有的質(zhì)粒還帶有可做為選擇性標(biāo)記的抗藥性基因，所以質(zhì)粒經(jīng)過適當(dāng)有可做為選擇性標(biāo)記的抗藥性基因，所以質(zhì)粒經(jīng)過適當(dāng)改選后便可成為良好的載體。改選后便可成為良好的載體。 作為載體的質(zhì)粒大多是由天然質(zhì)粒經(jīng)人工適當(dāng)改造作為載體的質(zhì)粒大多是由天然質(zhì)粒經(jīng)人工

6、適當(dāng)改造而成的，目前已有多種經(jīng)改造的良好的質(zhì)粒載體。而成的，目前已有多種經(jīng)改造的良好的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmidplasmid） 是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈?zhǔn)谴嬖谟诩?xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNADNA 分子。大小約為分子。大小約為 數(shù)千堿基對。常數(shù)千堿基對。常 有有1 1 3 3個(gè)抗藥個(gè)抗藥 性基因，以利于性基因，以利于 篩選。篩選。質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體1.1. 克隆的質(zhì)粒載體克隆的質(zhì)粒載體 允許外源的允許外源的DNADNA插入，儲(chǔ)存。主要是插入，儲(chǔ)存。主要是DNADNA水平上的操作。水平上的操作。2.2. 基因表達(dá)的質(zhì)粒載體基因表達(dá)的質(zhì)粒載體 允許外源允許外源DNADNA的插

7、入、儲(chǔ)存和表達(dá)。的插入、儲(chǔ)存和表達(dá)。1.11.1質(zhì)粒的生物學(xué)特性：質(zhì)粒的生物學(xué)特性： 1 1、質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的構(gòu)型：的構(gòu)型： SC SC 型型 共價(jià)閉合環(huán)形共價(jià)閉合環(huán)形DNADNA（cccDNAcccDNA） OC OC 型型 開環(huán)開環(huán)DNADNA（ocDNAocDNA） L L 型型 線性線性DNADNA（cDNAcDNA）2 2、不同質(zhì)粒的分子量大小差異相當(dāng)顯著：、不同質(zhì)粒的分子量大小差異相當(dāng)顯著： 10106 610108 8D D 3 3、作為載體的質(zhì)粒都含有三種共同的組分、作為載體的質(zhì)粒都含有三種共同的組分： 復(fù)制基因（復(fù)制基因（replicatorreplicator）、選擇

8、性記號、克隆位點(diǎn)）、選擇性記號、克隆位點(diǎn) LOCSC4 4、質(zhì)粒、質(zhì)粒DNADNA編碼著一些重要的非染色體控制的遺傳性狀。編碼著一些重要的非染色體控制的遺傳性狀。 抗性特征、代謝特征、修飾寄主生活方式的因子都等抗性特征、代謝特征、修飾寄主生活方式的因子都等5 5、質(zhì)粒、質(zhì)粒DNADNA的類型：的類型： 接合型和非接合型；含大腸桿菌素接合型和非接合型；含大腸桿菌素ColCol質(zhì)粒和含抗菌質(zhì)粒和含抗菌 素抗性基因的素抗性基因的R R質(zhì)粒；質(zhì)粒；F F因子和因子和FF因子等。因子等。按接合轉(zhuǎn)移功能分類主要基因按抗性記號分類非接合型質(zhì)粒自主復(fù)制基因，長生大腸桿菌素基因Col質(zhì)粒自主復(fù)制基因，抗菌素抗性

9、基因R質(zhì)粒(R因子) 接合型質(zhì)粒自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，細(xì)菌染色體區(qū)段F質(zhì)粒（ F因子）自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，大腸桿菌素基因Col質(zhì)粒自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，抗菌素抗性基因R質(zhì)粒(R因子)自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，大腸桿菌素基因Ent質(zhì)粒6 6、質(zhì)粒、質(zhì)粒DNADNA的復(fù)制類型：的復(fù)制類型： 低拷貝的質(zhì)粒（低拷貝的質(zhì)粒（1 13 3）：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒（接合型）：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒（接合型） 高拷貝的質(zhì)粒（高拷貝的質(zhì)粒（10601060）：松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒（非接合型）：松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒（非接合型） 7 7、質(zhì)粒的不親合性、質(zhì)粒的不親合性 在同一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，一般不能同時(shí)含有兩種

10、不同的。也稱在同一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，一般不能同時(shí)含有兩種不同的。也稱為質(zhì)粒的不相容性為質(zhì)粒的不相容性: : 是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。 質(zhì)粒的不親合性分子基礎(chǔ)，主要是由于它們在復(fù)制功能之間的質(zhì)粒的不親合性分子基礎(chǔ)，主要是由于它們在復(fù)制功能之間的相互干擾造成的。相互干擾造成的。1.2 1.2 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的分離與純化的分離與純化 1 1、氯化銫密度梯度離心法、氯化銫密度梯度離心法 2 2、堿變性法、堿變性法 1.2.1

11、1.2.1氯化銫密度梯度離心法氯化銫密度梯度離心法1、質(zhì)粒DNA占總DNA的1%2%；2、在細(xì)胞裂解及DNA分離過程中，大分子量的細(xì)菌染色體易斷裂成線性片斷，而質(zhì)粒DNA分子量小，結(jié)構(gòu)緊密仍保持完整的狀態(tài)；3、染色劑溴化乙錠（EB）能摻入到DNA鏈的堿基中，導(dǎo)致鏈的解旋；而且形成的EB- DNA復(fù)合物中，EB含量越高，密度會(huì)越低。流程：流程： 首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉（首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉（SDSSDS）來促）來促進(jìn)大腸桿菌的細(xì)胞裂解。進(jìn)大腸桿菌的細(xì)胞裂解。 將溴化乙錠的氯化銫溶液加到清亮的大腸桿菌將溴化乙錠的氯化銫溶液加到清亮的大腸桿菌裂解液中，裂解液中，EBEB會(huì)嵌入到會(huì)嵌

12、入到DNADNA鏈的堿基中去。鏈的堿基中去。 在在EBEB達(dá)到飽和時(shí)，進(jìn)行氯化銫密度梯度離心。達(dá)到飽和時(shí)，進(jìn)行氯化銫密度梯度離心。 1.2.21.2.2堿變性法：堿變性法： 根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA片斷之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來的。 在PH值12.012.5范圍內(nèi)時(shí)，線性的DNA會(huì)被變性而共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA卻不會(huì)被變性。 通過冷卻或恢復(fù)中性PH值使之復(fù)性，線性染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而cccDNA可以準(zhǔn)確迅速復(fù)性，通過離心去除線性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒DNA流程：流程：1 1、取、取1.51.5毫升含質(zhì)粒的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物，加

13、在微量離心毫升含質(zhì)粒的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物，加在微量離心管中，離心收集細(xì)胞沉淀；管中，離心收集細(xì)胞沉淀；2 2、加入、加入100100微升冰冷的微升冰冷的液，（液，（50mM50mM葡萄糖，葡萄糖， 25mM Tris-25mM Tris-HClHCl PH=8.0, 10mM EDTA PH=8.0, 10mM EDTA，4 45mg5mg溶菌酶）靜置溶菌酶）靜置5 5分鐘；分鐘；3 3、加入、加入200200微升微冷的微升微冷的液（液（0.2NaOH0.2NaOH，1.0%SDS1.0%SDS）緩緩混勻）緩緩混勻置室溫置室溫5 5分鐘。分鐘。 6565度水浴一段時(shí)間會(huì)加強(qiáng)染色體度水浴一段時(shí)間

14、會(huì)加強(qiáng)染色體DNADNA的變性作用。的變性作用。4 4、加入、加入150150毫升冰冷的毫升冰冷的PH=4.8PH=4.8的的3M3M醋酸鈉，振蕩后，冰浴醋酸鈉，振蕩后，冰浴5 5分鐘。分鐘。5 5、離心的上清液用苯酚抽提數(shù)次，用乙醇沉淀收集質(zhì)粒、離心的上清液用苯酚抽提數(shù)次，用乙醇沉淀收集質(zhì)粒DNADNA1.2.3 1.2.3 影響質(zhì)粒影響質(zhì)粒DNADNA產(chǎn)量的因素：產(chǎn)量的因素： 1 1）、寄主菌株的遺傳背景）、寄主菌株的遺傳背景 使用使用endAendA基因發(fā)生突變的菌株，編碼核酸內(nèi)切酶基因發(fā)生突變的菌株，編碼核酸內(nèi)切酶從野生型的菌株中提取質(zhì)粒須采取的措施： 選擇最適的培養(yǎng)條件，以限制在細(xì)胞

15、生長期間，體內(nèi)選擇最適的培養(yǎng)條件，以限制在細(xì)胞生長期間，體內(nèi)核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶 的表達(dá)；的表達(dá)； 在純化質(zhì)粒在純化質(zhì)粒DNADNA的過程中，用加熱法的過程中，用加熱法核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶使使失活；失活； 采用最佳的實(shí)驗(yàn)流程，減少采用最佳的實(shí)驗(yàn)流程，減少核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶的污染并在的污染并在純化了質(zhì)粒純化了質(zhì)粒DNADNA之后，迅速除去污染的核酸酶。之后，迅速除去污染的核酸酶。 2 2）、質(zhì)粒的）、質(zhì)粒的拷貝數(shù)拷貝數(shù)及分子的大小及分子的大小 插入分子量大的外源插入分子量大的外源DNADNA會(huì)引起質(zhì)?？截悢?shù)會(huì)引起質(zhì)粒拷貝數(shù)的下降。的下降。1.3 1.3 質(zhì)粒載體的構(gòu)建與類型質(zhì)粒載體的構(gòu)建與類型

16、 天然質(zhì)粒：天然質(zhì)粒：沒有經(jīng)過以基因克隆為目標(biāo)的體外修飾沒有經(jīng)過以基因克隆為目標(biāo)的體外修飾改造的質(zhì)粒。改造的質(zhì)粒。 在大腸桿菌中，常見的可用于基因克隆的天然質(zhì)在大腸桿菌中，常見的可用于基因克隆的天然質(zhì)粒有粒有EolE1EolE1、RSF2124RSF2124和和pSC101pSC101等，但存在一定的局等，但存在一定的局限性。限性。 第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101pSC101，它，它含有一個(gè)含有一個(gè)EcoREcoR酶切位點(diǎn)，一個(gè)四環(huán)素抗性選酶切位點(diǎn)，一個(gè)四環(huán)素抗性選擇記號（擇記號（TetTetr r ），插入外源片斷后不影響其復(fù)），插入外源片斷后不影響其復(fù)

17、制功能，制功能，但該質(zhì)粒分子量較大，拷貝數(shù)低只具但該質(zhì)粒分子量較大，拷貝數(shù)低只具有抗菌素抗性基因，無法使用插入失活技術(shù)選有抗菌素抗性基因，無法使用插入失活技術(shù)選擇重組分子。擇重組分子。 ColE1質(zhì)粒在其唯一的單切割位點(diǎn)EcoRl中克隆外源DNA片斷后，可根據(jù)對大腸桿菌素E1的免疫性選擇轉(zhuǎn)化子，不能合成大腸桿菌素E1的菌落是具有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。但對大腸桿菌素但對大腸桿菌素E1E1的免疫篩選，在化學(xué)上是相當(dāng)?shù)拿庖吆Y選，在化學(xué)上是相當(dāng)麻煩的。麻煩的。1.4 1.4 質(zhì)粒載體必須具備的基本條件質(zhì)粒載體必須具備的基本條件(1) (1) 、具有復(fù)制起點(diǎn)；、具有復(fù)制起點(diǎn)； 自我增值的基本條件，一般具自我

18、增值的基本條件，一般具一個(gè)一個(gè)復(fù)制子。復(fù)制子。(2) (2) 、具有抗菌素抗性；、具有抗菌素抗性； 理想的質(zhì)粒載體具有理想的質(zhì)粒載體具有兩種兩種抗菌素抗性基因?？咕乜剐曰?。(3) (3) 、具有若干限制酶切、具有若干限制酶切單一單一位點(diǎn)（位點(diǎn)（CMSCMS）；）；(4) (4) 、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。 低分子量的質(zhì)粒易于操作，克隆外源片斷后仍能有低分子量的質(zhì)粒易于操作，克隆外源片斷后仍能有效的轉(zhuǎn)化給受體細(xì)胞同時(shí)低分子量的質(zhì)粒對限制酶具有效的轉(zhuǎn)化給受體細(xì)胞同時(shí)低分子量的質(zhì)粒對限制酶具有多重識別位點(diǎn)的幾率也較低；較高的拷貝數(shù)可獲得大量多重識別位點(diǎn)的

19、幾率也較低；較高的拷貝數(shù)可獲得大量的克隆基因的克隆基因 以Ampr和Tetr為選擇性標(biāo)記，克隆位點(diǎn)在這兩個(gè)選擇性標(biāo)記的單酶切位點(diǎn)上。選擇AmprTets或AmpsTetr的重組子。（4363bp） 1.4.1.質(zhì)粒載體的選擇記號質(zhì)粒載體的選擇記號 新陳代謝特性；新陳代謝特性； 對大腸桿菌素對大腸桿菌素E1E1的免疫性；的免疫性； 抗菌素抗性；抗菌素抗性； 四環(huán)素抗性、氨芐青霉素抗性、四環(huán)素抗性、氨芐青霉素抗性、 鏈霉素抗性、卡那霉素抗性鏈霉素抗性、卡那霉素抗性 大多數(shù)質(zhì)粒本身帶有抗菌素基因；大多數(shù)質(zhì)粒本身帶有抗菌素基因； 抗菌素抗性記號便于操作、易于選擇。抗菌素抗性記號便于操作、易于選擇。1.

20、5 1.5 不同類型的質(zhì)粒載體不同類型的質(zhì)粒載體高拷貝的質(zhì)粒載體高拷貝的質(zhì)粒載體克隆的目的是為分離大量的高純度的克隆基因克隆的目的是為分離大量的高純度的克隆基因低拷貝的質(zhì)粒載體低拷貝的質(zhì)粒載體 有些克隆的編碼基因，其產(chǎn)物含量過高會(huì)嚴(yán)重有些克隆的編碼基因，其產(chǎn)物含量過高會(huì)嚴(yán)重的干擾寄主細(xì)胞的正常新陳代謝活動(dòng)。的干擾寄主細(xì)胞的正常新陳代謝活動(dòng)。 編碼表面結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一些基因、調(diào)節(jié)細(xì)胞基編碼表面結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一些基因、調(diào)節(jié)細(xì)胞基礎(chǔ)代謝活動(dòng)的蛋白質(zhì)編碼基因以及囊纖維化跨膜傳礎(chǔ)代謝活動(dòng)的蛋白質(zhì)編碼基因以及囊纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因等。導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因等。 (1)(1)失控的質(zhì)粒載體失控的質(zhì)粒載

21、體 復(fù)制控制是溫度敏感型的低拷貝的質(zhì)粒。復(fù)制控制是溫度敏感型的低拷貝的質(zhì)粒。ExampleExample： pBEU1pBEU1和和pBEU2pBEU2質(zhì)粒，在質(zhì)粒，在3030度下，每個(gè)寄主細(xì)胞只含度下，每個(gè)寄主細(xì)胞只含有適量的拷貝數(shù)，當(dāng)培養(yǎng)溫度超過有適量的拷貝數(shù)，當(dāng)培養(yǎng)溫度超過3535度時(shí)，質(zhì)粒的復(fù)度時(shí)，質(zhì)粒的復(fù)制將失去控制，每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)便持續(xù)上升。在制將失去控制，每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)便持續(xù)上升。在這種高溫環(huán)境下，細(xì)胞的生長和蛋白質(zhì)的合成可按正這種高溫環(huán)境下，細(xì)胞的生長和蛋白質(zhì)的合成可按正常的速率持續(xù)常的速率持續(xù)2 23 3小時(shí)。最后得到超量的基因編碼產(chǎn)小時(shí)。最后得到超量的基因編碼產(chǎn)物，

22、細(xì)胞生長受抑制失去存活能力，積累的質(zhì)粒物，細(xì)胞生長受抑制失去存活能力，積累的質(zhì)粒DNADNA占占細(xì)胞總細(xì)胞總DNADNA的的50%50%。 (2)(2)插入失活型質(zhì)粒載體插入失活型質(zhì)粒載體 將外源將外源DNADNA片斷插入在質(zhì)粒上會(huì)導(dǎo)致選擇記號基因失片斷插入在質(zhì)粒上會(huì)導(dǎo)致選擇記號基因失活的位點(diǎn)，就有可能通過抗菌素抗性的篩選，大幅度活的位點(diǎn)，就有可能通過抗菌素抗性的篩選，大幅度的提高獲得陽性克隆的機(jī)會(huì)。的提高獲得陽性克隆的機(jī)會(huì)。ExampleExample： 在在pBR329pBR329質(zhì)粒載體的質(zhì)粒載體的EcoR1EcoR1位點(diǎn)插入外源片斷，會(huì)使位點(diǎn)插入外源片斷，會(huì)使氯霉素抗性基因失活，在篩選

23、的氯霉素敏感的轉(zhuǎn)化子氯霉素抗性基因失活，在篩選的氯霉素敏感的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞群體中，含有插入片斷的重組體質(zhì)粒的幾率會(huì)顯細(xì)胞群體中，含有插入片斷的重組體質(zhì)粒的幾率會(huì)顯著上升著上升。 (3)(3)正選擇的質(zhì)粒載體正選擇的質(zhì)粒載體 正向選擇：正向選擇：應(yīng)用只有突變體或重組體才能正常生長應(yīng)用只有突變體或重組體才能正常生長的培養(yǎng)條件進(jìn)行選擇。這種質(zhì)粒載體具有直接選擇的培養(yǎng)條件進(jìn)行選擇。這種質(zhì)粒載體具有直接選擇記號并可賦予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型。記號并可賦予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型。ExampleExample： 質(zhì)粒質(zhì)粒pKN80pKN80有來自有來自MuMu噬菌噬菌體體DNADNA的的EcoR1-CEcoR1-C的片

24、斷，的片斷，編碼一種致死功能的編碼一種致死功能的kilkil基因?；?。 該質(zhì)粒在該質(zhì)粒在MuMu噬菌體的溶噬菌體的溶源菌株中正常復(fù)制；在非源菌株中正常復(fù)制；在非溶源菌株中是致死的。溶源菌株中是致死的。 在在HindHind 或或HpaHpa 位點(diǎn)位點(diǎn)插入外源插入外源DNADNA片斷后，會(huì)片斷后，會(huì)產(chǎn)生具產(chǎn)生具AmpAmpr r表型的表型的MuMu噬菌噬菌體的非溶源的轉(zhuǎn)化子菌株體的非溶源的轉(zhuǎn)化子菌株正向選擇質(zhì)粒載體的條件限制：正向選擇質(zhì)粒載體的條件限制： 1 1、需要特殊的寄主菌株或選擇培養(yǎng)基、需要特殊的寄主菌株或選擇培養(yǎng)基 2 2、可使用的克隆位點(diǎn)少、可使用的克隆位點(diǎn)少 3 3、假陽性水平高

25、、假陽性水平高 4 4、不能夠調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)活性、不能夠調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)活性 (4)表達(dá)型的質(zhì)粒載體表達(dá)型的質(zhì)粒載體表達(dá)載體：表達(dá)載體： 按特殊設(shè)計(jì)構(gòu)建的，能使克隆在按特殊設(shè)計(jì)構(gòu)建的，能使克隆在其中特定位點(diǎn)的外源真核基因的編碼序列，其中特定位點(diǎn)的外源真核基因的編碼序列，在大腸桿菌細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)蛋在大腸桿菌細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆載體。白質(zhì)的克隆載體。 主要包括：主要包括： 大腸桿菌的啟動(dòng)子、及操縱位點(diǎn)序列、多克隆大腸桿菌的啟動(dòng)子、及操縱位點(diǎn)序列、多克隆位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯信號、質(zhì)粒載體的復(fù)制起點(diǎn)及位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯信號、質(zhì)粒載體的復(fù)制起點(diǎn)及抗菌素抗性基因。抗菌素抗性基因。

26、 待表達(dá)的真核基因編碼序列被克隆在緊挨于啟待表達(dá)的真核基因編碼序列被克隆在緊挨于啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)上，而且必須是其編碼的動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)上，而且必須是其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸末端這一頭靠近啟動(dòng)子方向插入，蛋白質(zhì)氨基酸末端這一頭靠近啟動(dòng)子方向插入，才能在啟動(dòng)子控制下進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄。才能在啟動(dòng)子控制下進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄。 1.6 1.6 重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體 1 1、pSC101pSC101質(zhì)粒載體；質(zhì)粒載體； 2 2、ColEColE 質(zhì)粒載體；質(zhì)粒載體； 3 3、pBR322pBR322質(zhì)粒載體；質(zhì)粒載體； 4 4、pUCpUC質(zhì)粒載體；質(zhì)粒載體； 5 5、其它的重要的

27、質(zhì)粒載體其它的重要的質(zhì)粒載體1.6.1 1.6.1 pSC101pSC101質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 一種嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制控制的地拷貝數(shù)的大腸桿菌一種嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制控制的地拷貝數(shù)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。平均每個(gè)寄主細(xì)胞僅有質(zhì)粒載體。平均每個(gè)寄主細(xì)胞僅有1 12 2個(gè)拷貝；個(gè)拷貝；分子量分子量9.09kb9.09kb，編碼有一個(gè)四環(huán)素抗性基因，編碼有一個(gè)四環(huán)素抗性基因（tettetr r ）。）。 有有HindHind 、EcoREcoR、BamH BamH 、Sal Sal 、Xho Xho 、PvuPvu、 SmaSma 7 7種核酸內(nèi)切限制酶。種核酸內(nèi)切限制酶。其中在其中在HindHind 、 BamH Bam

28、H 、 SmaSma 3 3個(gè)位點(diǎn)克個(gè)位點(diǎn)克隆外源隆外源DNADNA，都會(huì)導(dǎo)致，都會(huì)導(dǎo)致tettetr r 基因失活。基因失活。 是第一個(gè)真核生物的克隆載體是第一個(gè)真核生物的克隆載體Example1: 應(yīng)用pSC101質(zhì)粒作基因克隆載體 葡萄球菌質(zhì)?；蛟诖竽c桿菌中的表達(dá) 金黃色葡萄球菌的質(zhì)粒p1258,編碼若干種能在大腸桿菌檢測的結(jié)構(gòu)基因；能被核酸限制酶EcoR 切割成4段。Example2:Example2:應(yīng)用應(yīng)用pSC101pSC101質(zhì)粒作基因克隆載體質(zhì)粒作基因克隆載體 在大腸桿菌中克隆非洲爪蟾在大腸桿菌中克隆非洲爪蟾DNADNA 用核酸內(nèi)切酶EcoR 消化非洲爪蟾的核糖體DNA（

29、rDNA ），與EcoR 消化的pSC101質(zhì)粒進(jìn)行重組。 在挑取的55個(gè)轉(zhuǎn)化子中，經(jīng) EcoR 酶切，電泳后13個(gè)轉(zhuǎn)化子含有外源片斷。轉(zhuǎn)化率23.61.6.2 ColE1.6.2 ColE1 1 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 松弛型復(fù)制控制的多拷貝的質(zhì)粒，能產(chǎn)生細(xì)菌素。細(xì)菌素對大腸桿菌的正常生命活動(dòng)有抑制作用（復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯能量代謝等）。但含有對細(xì)菌素的免疫基因。 用 ColE 1質(zhì)粒特征為基礎(chǔ)建立的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，存在一定的缺陷性： 1、應(yīng)用大腸桿菌素免疫作為標(biāo)記操作上不方便； 2、在細(xì)菌群體中，能夠以相當(dāng)高的頻率自發(fā)的產(chǎn)生出抗菌素的突變體細(xì)胞。1.6.3 1.6.3 pBR322pBR322質(zhì)粒載體質(zhì)

30、粒載體 “P”P”表示是一種質(zhì)粒；表示是一種質(zhì)粒；“BR”BR”表示兩位主要構(gòu)建者姓氏的頭一個(gè)字母表示兩位主要構(gòu)建者姓氏的頭一個(gè)字母“F.BilivarF.Bilivar和和R.L.Rodriguez”;R.L.Rodriguez”;“322”“322”表示實(shí)驗(yàn)編號。表示實(shí)驗(yàn)編號。 四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素 抗性基因O r i Pst Sal Pvu Ava Bam HHind Eco RpBR322(amp(ampr r) )(ter(terr r) )pBR322pBR322的構(gòu)建：的構(gòu)建： 為改進(jìn)轉(zhuǎn)化子篩選技術(shù)，并具有相對小的分子為改進(jìn)轉(zhuǎn)化子篩選技術(shù)，并具有相對小的分子量、高拷貝數(shù)、外源

31、基因插入不影響質(zhì)粒的復(fù)制量、高拷貝數(shù)、外源基因插入不影響質(zhì)粒的復(fù)制功能、多克隆位點(diǎn)（多種限制酶的單一切割位功能、多克隆位點(diǎn)（多種限制酶的單一切割位點(diǎn)）、質(zhì)粒的穩(wěn)定性（克服質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移能力）點(diǎn)）、質(zhì)粒的穩(wěn)定性（克服質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移能力） pBR322pBR322的結(jié)構(gòu)來源的結(jié)構(gòu)來源pBR322pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)： 1、具有較小的分子量； 它的分子量為4363bp?？寺≥d體的分子量大小不要超過10kb。2、具有兩種抗菌素抗性兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。 pBR322 DNA分子中總共有24種核酸內(nèi)切酶只具有單一的酶切識別位點(diǎn)。其中7種內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)在四環(huán)素抗

32、性基因內(nèi)部，2種識別位點(diǎn)在于這個(gè)基因的啟動(dòng)區(qū)內(nèi)，所以9個(gè)限制酶切位點(diǎn)插入外源片斷可以導(dǎo)致tetr 基因的失活；另外有3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識別位點(diǎn)，Example:a. 在pBR322質(zhì)粒的BamH或Sal位點(diǎn)插入外源DNA片斷，切斷了tettetr r基因編碼序列的連續(xù)性，使之失去活性，產(chǎn)生出Ampr rTets s表型的重組pBR322質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入Amps sTets s的大腸桿菌細(xì)胞。先涂布在含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上，篩選出具Ampr r菌落，再將它們涂布于含四環(huán)素的選擇性培養(yǎng)基上。插入外源片斷的重組質(zhì)粒不能在這種培養(yǎng)基上生長。B X BBBXAmproriAmpsTe

33、troriAmprTetroripBR322BABBTetsX b. 在Pst或Sca識別位點(diǎn)插入外源片斷會(huì)導(dǎo)致Ampr r基因的失活，產(chǎn)生Amps sTetr r表型的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌之后，獲得的重組子可以比較快的檢測出來。其依據(jù)是Ampr r表型的細(xì)胞可以合成 內(nèi)酰胺酶，它能使青霉素轉(zhuǎn)變成青霉酮酸，而這種青霉酮酸能與碘結(jié)合。在含有可溶性淀粉和四環(huán)素的富裕培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子，經(jīng)37度培養(yǎng)過夜后，在此平板上加入少量的碘指示劑溶液產(chǎn)生青霉素 內(nèi)酰胺酶Ampr r的菌落，其周圍的碘指示劑溶液變得明亮，而Amps s菌落無此反應(yīng)。 具有較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增之后每個(gè)細(xì)胞中可積累10003

34、000個(gè)拷貝。 pBR322pBR322質(zhì)粒載體的改良質(zhì)粒載體的改良 為了更加實(shí)用，人們對為了更加實(shí)用，人們對pBR322pBR322質(zhì)粒進(jìn)行了改質(zhì)粒進(jìn)行了改良，得到許多良，得到許多pBR322pBR322質(zhì)粒衍生質(zhì)粒，它們各自質(zhì)粒衍生質(zhì)粒，它們各自具有不同的特點(diǎn)。具有不同的特點(diǎn)。應(yīng)用應(yīng)用pBR322pBR322質(zhì)粒作為基因克隆載體質(zhì)粒作為基因克隆載體 水稻葉綠體光誘導(dǎo)基因水稻葉綠體光誘導(dǎo)基因psbApsbA的結(jié)構(gòu)分析的結(jié)構(gòu)分析 基因psbA編碼的蛋白質(zhì)，與光合作用系統(tǒng)相關(guān)，并且它能與除草劑阿特拉津結(jié)合，它的第264位氨基酸發(fā)生取代反應(yīng)，由絲氨酸變?yōu)楦拾彼?，可?dǎo)致其失去與除草劑阿特拉津結(jié)合的能

35、力，推測是三維結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變 ；在原生生物衣藻、藍(lán)色細(xì)菌中，此蛋白質(zhì)在同一位置由絲氨酸變?yōu)楸彼岬娜〈磻?yīng)，會(huì)使他們獲得對除草劑的抗性功能。 而且，非競爭條件下，對除草劑阿特拉津抗性的千里光屬和莧屬，干物質(zhì)產(chǎn)量比敏感植物下降了25%和40%。 通過對基因psbA的體外操作，有可能創(chuàng)造出抗除草劑的或高光效的轉(zhuǎn)基因植株。用pBR322質(zhì)粒作為載體，成功的克隆了水稻的psbA基因。 首先將水稻葉綠體DNA，用EcoR內(nèi)切酶消化，經(jīng)含有溴化乙錠的熔點(diǎn)瓊脂糖電泳，回收分子大小為1.82.5kb之間的DNA片斷。 再與經(jīng)過EcoR內(nèi)切酶切割并用堿性磷酸酶作了脫磷酸處理的pBR322質(zhì)粒DNA連接。 然后轉(zhuǎn)

36、化給大腸桿菌，在氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上，形成Ampr轉(zhuǎn)化子菌落群體。 用經(jīng)32p標(biāo)記的玉米psdADNA探針作菌落雜交，從1000多個(gè)菌落中篩選出8個(gè)陽性克隆。 對這8個(gè)陽性克隆進(jìn)行進(jìn)一步的Southern分析，表明6個(gè)片斷帶有長度為2.2kb的編碼水稻葉綠體psdA基因。實(shí)際上其中1.2kb的片斷編碼著水稻psdA基因的全部序列。通過dna序列分析表明與高等植物的同原性在92%，與藍(lán)色細(xì)菌同源性75%1.6.4 1.6.4 pUCpUC質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 人們應(yīng)用多克隆位點(diǎn)技術(shù)，在pBR322的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在其5-端帶有一段多克隆位點(diǎn)的lacZ基因，而發(fā)展的具有雙功能檢測特性的新型質(zhì)粒

37、載體系列。 一種典型的一種典型的pUCpUC系列的質(zhì)粒載體，包括以下四個(gè)部分：系列的質(zhì)粒載體，包括以下四個(gè)部分： 1、來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ori）；2、氨芐青霉素抗性基因（ampr ）,但它的DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不在含有原來的核酸內(nèi)切限制酶的但識別位點(diǎn)。3、大腸桿菌-半乳糖基因（lacZ）的啟動(dòng)子及編碼-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱之為lacZ基因；4、位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段。但它并不破壞該基因的功能。 AmproripUC18(3 kb)MCS (Multiple cloning sites,多科隆位點(diǎn)）Lac promoterla

38、cZpUCpUC質(zhì)粒載體的形體圖質(zhì)粒載體的形體圖pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)第一，具有較小的分子量和更高的拷貝數(shù); 僅保留了pBR322的氨芐青霉素抗性基因和復(fù)制起點(diǎn)；在操作過程中復(fù)制起點(diǎn)內(nèi)部發(fā)生了自發(fā)突變造成了基因rop的缺失，它是控制質(zhì)粒的特殊因子，從而使拷貝數(shù)增加，平均每個(gè)細(xì)胞500700個(gè)拷貝。第二，適用于組織化學(xué)檢測重組體； 具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ基因，所編碼的-肽鏈可參與- 互補(bǔ)作用，用Xgal顯色對重組子進(jìn)行鑒定，而pBR322質(zhì)粒的重組子要進(jìn)行兩步的選擇。 第三，具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段 方便具有不同粘性末端的外源片斷的插入。1.6.51.6.5其它的重要的質(zhì)粒載體其它的重要的質(zhì)粒載體喪失遷移功能的質(zhì)粒載體能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體穿梭質(zhì)粒載體（1 1）喪失遷移功能的質(zhì)粒載體）喪失遷移功能的質(zhì)粒載體第一,擁有較高水平的拷貝數(shù),平均每個(gè)大腸桿菌寄主細(xì)胞可達(dá)3045份; 第二,失去了bom位點(diǎn)，即便在共存的F質(zhì)粒提供轉(zhuǎn)移裝置的條件下，也不可能發(fā)生遷移作用。（2）能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體 pGEM-3Z是一種與pUC系列十分類似的小分子的質(zhì)粒載體，總長度2743bp，編碼有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因和一個(gè)lacZ基因。 pGEM-3Z與pUC質(zhì)粒之間的主要區(qū)別是，它具有兩個(gè)來自噬菌體的啟動(dòng)子，即T