蛋白質沉淀與等電點

1、蛋白質的沉淀作用和等電點測定蛋白質的沉淀作用和等電點測定【實驗目的實驗目的】1. 加深對蛋白質膠體溶液穩(wěn)定因素的認識。加深對蛋白質膠體溶液穩(wěn)定因素的認識。2. 了解沉淀蛋白質的幾種方法及其實用意義。了解沉淀蛋白質的幾種方法及其實用意義。3. 了解蛋白質變性與沉淀的關系。了解蛋白質變性與沉淀的關系。4. 學習蛋白質的兩性解離性質。學習蛋白質的兩性解離性質。5. 掌握測定蛋白質等電點的基本方法。掌握測定蛋白質等電點的基本方法。 【實驗原理【實驗原理】 一、沉淀作用一、沉淀作用 在水溶液中的蛋白質分子由于表面生成在水溶液中的蛋白質分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，水化層和雙電層

2、而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質顆粒可因在一定的理化因素影響下，蛋白質顆粒可因失去電荷和脫水而沉淀。蛋白質的沉淀反應失去電荷和脫水而沉淀。蛋白質的沉淀反應可分為可逆的沉淀反應和不可逆沉淀反應兩可分為可逆的沉淀反應和不可逆沉淀反應兩類。類。 1.1.可逆沉淀作用可逆沉淀作用：在發(fā)生沉淀作用時，雖然：在發(fā)生沉淀作用時，雖然蛋白質已經(jīng)沉淀析出，然而其分子內(nèi)部結構蛋白質已經(jīng)沉淀析出，然而其分子內(nèi)部結構并沒發(fā)生明顯的改變，仍保持原有的結構和并沒發(fā)生明顯的改變，仍保持原有的結構和性質。如除去沉淀因素，蛋白質可重新溶解性質。如除去沉淀因素，蛋白質可重新溶解在原來的溶劑中。因此，這種沉

3、淀作用稱為在原來的溶劑中。因此，這種沉淀作用稱為可逆沉淀作用?？赡娉恋碜饔?。屬于此類的有鹽析作用，低屬于此類的有鹽析作用，低溫下丙酮、乙醇使蛋白質沉淀的作用，以及溫下丙酮、乙醇使蛋白質沉淀的作用，以及利用等電點的沉淀。利用等電點的沉淀。 （1 1）鹽析作用）鹽析作用：用大量中性鹽使蛋白質從：用大量中性鹽使蛋白質從溶液中析出的過程。在高濃度的中性鹽影響溶液中析出的過程。在高濃度的中性鹽影響下，蛋白質分子的水化膜被剝奪；同時蛋白下，蛋白質分子的水化膜被剝奪；同時蛋白質分子所帶的電荷被中和，因而破壞了蛋白質分子所帶的電荷被中和，因而破壞了蛋白質溶膠的穩(wěn)定因素，使蛋白質沉淀析出。但質溶膠的穩(wěn)定因素，使

4、蛋白質沉淀析出。但中性鹽并不破壞蛋白質的分子結構和性質，中性鹽并不破壞蛋白質的分子結構和性質，因此，若除去中性鹽或減低鹽的濃度，蛋白因此，若除去中性鹽或減低鹽的濃度，蛋白質就會重新溶解。質就會重新溶解。 （2 2）有機溶劑沉淀蛋白質）有機溶劑沉淀蛋白質：在蛋白質溶液：在蛋白質溶液中加入適量丙酮或乙醇，蛋白質分子的水化中加入適量丙酮或乙醇，蛋白質分子的水化膜被破壞而沉淀。若及時將蛋白質沉淀與丙膜被破壞而沉淀。若及時將蛋白質沉淀與丙酮或乙醇分離，蛋白質沉淀則可重新溶解于酮或乙醇分離，蛋白質沉淀則可重新溶解于水中。水中。 2.2.不可逆沉淀作用不可逆沉淀作用 ：一些物理化學因素往：一些物理化學因素往

5、往會導致蛋白質分子結構，尤其是空間結構往會導致蛋白質分子結構，尤其是空間結構破壞，因而失去其原來的性質，這種蛋白質破壞，因而失去其原來的性質，這種蛋白質沉淀不能再溶解于原來的溶劑中。沉淀不能再溶解于原來的溶劑中。重金屬鹽，重金屬鹽，生物堿試劑、過酸、過堿、加熱、震蕩、超生物堿試劑、過酸、過堿、加熱、震蕩、超聲波和有機溶劑等都能使蛋白質發(fā)生不可逆聲波和有機溶劑等都能使蛋白質發(fā)生不可逆沉定。沉定。 （1 1）重金屬鹽類重金屬鹽類: :能與蛋白質分子中的巰基等能與蛋白質分子中的巰基等基團結合，生成不溶物而沉淀?；鶊F結合，生成不溶物而沉淀。 （2 2）生物堿試劑生物堿試劑: :與蛋白質結合形成不溶物而

6、與蛋白質結合形成不溶物而沉淀。植物體內(nèi)具有顯著生理作用的含氮堿性沉淀。植物體內(nèi)具有顯著生理作用的含氮堿性化合物稱為生物堿（或植物堿）。能沉淀生物化合物稱為生物堿（或植物堿）。能沉淀生物堿或與其產(chǎn)生顏色反應的物質稱為生物堿試劑，堿或與其產(chǎn)生顏色反應的物質稱為生物堿試劑，如鞣酸、苦味酸、磷鎢酸等。如鞣酸、苦味酸、磷鎢酸等。 蛋白質變性后，有時由于維持溶液穩(wěn)定的蛋白質變性后，有時由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變條件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋白質并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋性蛋白質并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質也未必都已變性。白質也未必都已變性。 二、

7、等電點二、等電點 蛋白質和氨基酸一樣都是兩性電解質。調(diào)蛋白質和氨基酸一樣都是兩性電解質。調(diào)節(jié)蛋白質溶液的節(jié)蛋白質溶液的pHpH值，可使蛋白質分子側鏈或值，可使蛋白質分子側鏈或末端攜帶不同的電荷；在某一末端攜帶不同的電荷；在某一pHpH時其分子中的時其分子中的正電荷與負電荷數(shù)目相等，即凈電荷為零，該正電荷與負電荷數(shù)目相等，即凈電荷為零，該pHpH值稱為蛋白質的等電點。在等電點時蛋白質值稱為蛋白質的等電點。在等電點時蛋白質的溶解度往往較低容易沉淀析出。本實驗借助的溶解度往往較低容易沉淀析出。本實驗借助觀察在不同觀察在不同pHpH溶液中的溶解度以測定酪蛋白的溶液中的溶解度以測定酪蛋白的等電點。等電點

8、。【實驗材料和主要儀器、試劑【實驗材料和主要儀器、試劑】 1. 1.實驗材料實驗材料 蛋白質（卵清蛋白）、酪蛋白蛋白質（卵清蛋白）、酪蛋白 2.2.實驗儀器實驗儀器 試管及試管架；刻度吸管；吸耳球、膠頭試管及試管架；刻度吸管；吸耳球、膠頭滴管、滴管、pHpH試紙試紙 3. 3.實驗試劑實驗試劑 pH4.7 pH4.7 醋酸醋酸- -醋酸鈉的緩沖溶液；醋酸鈉的緩沖溶液；3%3%硝酸銀硝酸銀溶液；溶液；5%5%三氯乙酸溶液；三氯乙酸溶液；95%95%乙醇；飽和硫酸乙醇；飽和硫酸銨溶液；硫酸銨結晶粉末；銨溶液；硫酸銨結晶粉末；0.1mol/L0.1mol/L鹽酸溶鹽酸溶液；液；0.1mol/L0.1

9、mol/L氫氧化鈉溶液；氫氧化鈉溶液；0.05mol/L0.05mol/L碳酸碳酸鈉溶液；鈉溶液；0.1mol/L0.1mol/L醋酸溶液；甲基紅溶液；醋酸溶液；甲基紅溶液；0.4%0.4%酪蛋白醋酸鈉溶液；醋酸溶液（酪蛋白醋酸鈉溶液；醋酸溶液（mol/Lmol/L）：）：1.0, 0.1 ,0.011.0, 0.1 ,0.01?！緦嶒灢襟E實驗步驟】 1 1、蛋白質的沉淀反應、蛋白質的沉淀反應 （1 1）鹽析）鹽析 加加5%5%卵清蛋白溶液卵清蛋白溶液5 ml5 ml于試管中，于試管中，再加等量的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數(shù)分再加等量的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數(shù)分鐘則析出球蛋白的沉淀。倒出少

10、量混濁沉淀，鐘則析出球蛋白的沉淀。倒出少量混濁沉淀，加少量水，觀察是否溶解，為什么？將管中內(nèi)加少量水，觀察是否溶解，為什么？將管中內(nèi)容物過濾，向濾液中添加硫酸銨粉末到不再溶容物過濾，向濾液中添加硫酸銨粉末到不再溶解為止，此時析出的沉淀為清蛋白。解為止，此時析出的沉淀為清蛋白。 取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，觀察沉取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，觀察沉淀的再溶解。淀的再溶解。 【實驗步驟實驗步驟】 （2 2）重金屬離子沉淀蛋白質：重金屬離）重金屬離子沉淀蛋白質：重金屬離子與蛋白質結合成不溶于水的復合物。取子與蛋白質結合成不溶于水的復合物。取1 1支試管，加入蛋白質溶液支試管，加入蛋白質溶液2 ml

11、2 ml，再加，再加3%3%硝硝酸銀溶液酸銀溶液1 12 2滴，振蕩試管，有沉淀產(chǎn)生。滴，振蕩試管，有沉淀產(chǎn)生。放置片刻，傾去上清液，向沉淀中加入少放置片刻，傾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？為什么？量的水，沉淀是否溶解？為什么？【實驗步驟實驗步驟】 （3 3）某些有機酸沉淀蛋白質：取）某些有機酸沉淀蛋白質：取1 1支試管，支試管，加入蛋白質溶液加入蛋白質溶液2ml2ml，再加，再加1ml5%1ml5%三氯乙酸溶三氯乙酸溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻，液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻，傾出上清液，向沉淀中加入少量水，觀察沉傾出上清液，向沉淀中加入少量水，觀察沉淀是

12、否溶解。淀是否溶解。 （4 4）有機溶劑沉淀蛋白質：取一支試管，）有機溶劑沉淀蛋白質：取一支試管，加入加入2mL2mL蛋白質溶液，再加入蛋白質溶液，再加入2mL95%2mL95%乙醇。觀乙醇。觀察沉淀的生成。察沉淀的生成。 【實驗步驟【實驗步驟】 （5 5）乙醇引起的變性與沉淀）乙醇引起的變性與沉淀 a. a. 取取3 3支試管編號，依下表順序加入試劑支試管編號，依下表順序加入試劑。 b . 振搖混勻后，觀察各管有何變化。放置振搖混勻后，觀察各管有何變化。放置片刻，向各管內(nèi)加水片刻，向各管內(nèi)加水8ml，然后在第，然后在第2、3號號管中各加一滴甲基紅，再分別用管中各加一滴甲基紅，再分別用0.1

13、mol/L醋酸溶液及醋酸溶液及0.05mol/L碳酸鈉溶液中和之。碳酸鈉溶液中和之。觀察各管顏色的變化和沉淀的生成。每管觀察各管顏色的變化和沉淀的生成。每管再加再加0.1mol/L鹽酸溶液數(shù)滴，觀察沉淀的鹽酸溶液數(shù)滴，觀察沉淀的再溶解。解釋各管發(fā)生的全部現(xiàn)象。再溶解。解釋各管發(fā)生的全部現(xiàn)象。 【實驗步驟實驗步驟】 2、酪蛋白等電點的測定、酪蛋白等電點的測定 取同樣規(guī)格的使館取同樣規(guī)格的使館4 4支，按照下表順支，按照下表順序分別精確加入各試劑，然后混勻序分別精確加入各試劑，然后混勻。 向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶液液1mL1mL，加一管，搖勻一管。此時，加一管，搖勻一管。此時1 1、2 2、3 3、4 4管的管的pHpH 依次為依次為5.95.9、5.35.3、4.74.7、3.5.3.5.觀察觀察管溶液的混濁度。靜置管溶液的混濁度。靜置1010分鐘后，再觀察其分鐘后，再觀察其混濁度。最混濁的一管的混濁度。最混濁的一管的pHpH 即為酪蛋白的即為酪