MTT配制、原理、操作步驟、結(jié)果分析、注意事項

1、MTT配制、原理、操作步驟、結(jié)果分析、考前須知-四、實驗所需材料1MTT 溶液的配制 通常MTT 配成的終濃度為5mg/ml,須用PBS或生理鹽水做溶劑。市面上一般MTT的包裝為100mg,250mg或1g1.1 對于100mg這樣的小包裝，廠家都是將MTT放入小管中的，個人建議不要再用天平稱量分裝，而應(yīng)該一次性將其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS來溶解。 具休做法：預(yù)先在50ml離心管沒有的話，可用培養(yǎng)瓶替代參加20ml PBS，從中先吸取500-1000ul PBS裝入含MTT的小管中，吹打假設(shè)干次后將其移入50ml離心管，然后再混勻。可以重復(fù)幾次，以使小管中的MTT不殘留于管內(nèi)

2、。將MTT完全混勻后，用0.22m濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，分裝避光(避光袋或是黑紙、錫箔紙包住)可長期保存于-20度。按細(xì)胞培養(yǎng)板每孔需加10ul計算，一般每96孔板約需1ml，所以分裝時可考慮每管分裝1ml。1.2 對于大包裝，可按上述方法稱取一局部溶解，也有人將粉劑分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加?？记绊氈簂 在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。l 配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感l(wèi) MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4度避光保存兩周內(nèi)個人曾做過4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不錯有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，防止反復(fù)凍融，最好小劑量

3、分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用。l MTT有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.2MTT甲瓚溶解液2.1 二甲基亞砜DMSO，可以直接溶解，無需配制，使用方便，溶解速度快，但對人體毒性較大，且需去除原培養(yǎng)液，在去除培養(yǎng)液的過程中，可能會把結(jié)晶去掉，導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定。2.2 三聯(lián)溶解液：SDS10g，異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用雙蒸水溶解配成100ml溶液文獻(xiàn)方法：周建軍等，評價抗癌物質(zhì)活性的改進(jìn)MTT方法，中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1993，2410：455-457，該溶解液不需去除原培養(yǎng)基，但溶解較慢。個人覺得其溶解

4、的能力不如DMSO強該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫，將SDS結(jié)晶全部溶解后再使用。五、MTT法實驗步驟1: 胰酶消化對數(shù)期細(xì)胞，終止后離心收集，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)調(diào)整其濃度至5-10×104/ml。細(xì)胞詳細(xì)計數(shù)方法請參照 biobars 中的相關(guān)文章。對于初學(xué)者而言，要使細(xì)胞到達(dá)5-10×104/ml往往不知從何處著手，我在這里向大家提供一個簡單的方法以初步確定細(xì)胞數(shù)量。以一般細(xì)胞培養(yǎng)常用的25cm2為例，1)        細(xì)胞密度在長到約80%

5、90%下列圖所示為80%90%密度時細(xì)胞的大致狀態(tài)，消化離心收集后，將上清去掉，參加3ml培養(yǎng)基使其混勻。2)        另取一支新的15ml無菌離心管為下一步接種96孔板用，裝入約9ml培養(yǎng)基. 3)        從第一步準(zhǔn)備的3ml細(xì)胞懸液中取1ml, 參加上管，混勻后細(xì)胞計數(shù)，此時一般為或小于5-10×104/ml，該濃度相當(dāng)于細(xì)胞計數(shù)板4個大格內(nèi)每大格平均5-10個細(xì)胞見下列圖；如果不夠該濃度，再根據(jù)計數(shù)的結(jié)果滴加細(xì)胞懸液，每滴按5

6、0ul計算。 4)        細(xì)胞數(shù)量因?qū)嶒災(zāi)康牟煌瑧?yīng)做相應(yīng)調(diào)整，如一般細(xì)胞增殖實驗每孔2000個就可以相當(dāng)于細(xì)胞懸液密度為2×104/ml，細(xì)胞毒性實驗每孔500010000個相當(dāng)于細(xì)胞懸液密度為5×104/ml。此外，還應(yīng)根據(jù)細(xì)胞本身特性，如生長快慢，來決定細(xì)胞數(shù)量。比方：生長較快的細(xì)胞密度可略小。 2將細(xì)胞懸液制備好后，輕輕混勻，每孔參加100ul, 這樣待測細(xì)胞的密度為500010000/孔邊緣孔用無菌PBS填充。l     

7、0;   注意：因細(xì)胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，因此接種的過程中要反復(fù)屢次混勻，如每加6個孔就混勻一次，以確保接種的細(xì)胞密度在各孔之間完全相同，這對于MTT的結(jié)果至關(guān)重要。-3.       將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞單層鋪滿孔底96孔平底板,參加濃度梯度的藥物,原那么上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個復(fù)孔.建議設(shè)6個，否那么難以反響真實情況。下列圖可做為96孔板的的參考步局。 l  &

8、#160;    對于加藥，有人直接將藥物按不同體積參加到96孔板中，以形成濃度梯度。但本人認(rèn)為應(yīng)盡量在EP管中將不同濃度的藥物配好，然后將96孔板中的培養(yǎng)上清去掉可以用排槍吸走再參加100ul含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，這樣能保證藥物濃度的準(zhǔn)確。另外，需注意的是，如果用這種方法，不要把96孔板的培養(yǎng)液全部吸走后再加藥，應(yīng)該吸完一局部后立即加樣，防止由于96孔板枯燥引起細(xì)胞死亡。 4.       5%CO2，37孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。下列圖為一典型的藥物梯度為細(xì)胞的毒性作用。5

9、.       每孔參加10ulMTT溶液5mg/ml，即0.5%MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h。假設(shè)藥物與MTT能夠反響，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再參加含MTT的培養(yǎng)液。 6.       終止培養(yǎng)，準(zhǔn)備溶解結(jié)晶。  l         溶解結(jié)晶的方法有兩種，第一種，用DMSO溶解1)        M

10、TT參加培養(yǎng)4h后，結(jié)晶可充分形成。將上清去掉，該過程要注意不能把Formazan結(jié)晶移走。有人直接用移液器將上清移走，也有人建議先鋪幾張濾紙在桌面，然后將96孔板輕輕倒置，這樣上清便被濾紙吸走，以減少結(jié)果的損失。個人認(rèn)為，這兩種方法都有可能導(dǎo)致結(jié)晶的損失，從而引起結(jié)果的不準(zhǔn)確。采用哪種方法，可以自己摸索一下再決定。2)        每孔參加150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。 l     &

11、#160;   另一種方法，用三聯(lián)溶解液見上面MTT甲瓚溶解液1)        MTT參加培養(yǎng)4h后，結(jié)晶可充分形成。這種方法細(xì)胞上清可以不用去掉，直接在每孔參加100ul溶解液。該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫，將SDS結(jié)晶全部溶解后再使用。2)        放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育46小時，鏡下觀察，待結(jié)晶全部溶解后570nm測吸光度。通常37孵育4小時左右，紫色結(jié)晶會全部溶解。如

12、果紫色結(jié)晶較小較少，溶解的時間會短一些。如果紫色結(jié)晶較大較多，溶解的時間會長一些。 在實際的操作過程中，往往為了等待46小時，使得實驗者在下班以后或者晚上來測OD值，給實驗者帶來了很大的不方便。個人曾經(jīng)摸索，參加溶解液后過夜再測對OD值根本無影響，但要注意的是一定要避光，不過培養(yǎng)箱關(guān)閉后本身就是閉光的，所以參加溶解液后放入培養(yǎng)箱中，第二天上班時再測OD值就可以了。7、同時設(shè)置調(diào)零孔培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜，對照孔細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜。 MTT的操作方法一、MTT是什么MTT是一種粉末狀化學(xué)試劑，全稱為3-(4,5)-dimethylthiahia

13、zo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，漢語化學(xué)名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。二、MTT法用來做什么 簡單地說：是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。MTT主要有兩個用途1藥物也包括其他處理方式如放射線照射對體外培養(yǎng)的細(xì)胞毒性的測定；2細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測定。三、為何MTT可以用來做上述工作檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT復(fù)原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚Formazan并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜DMSO能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在490n

14、m波長處測定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸光度值OD值，來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強如果是測藥物毒性，那么表示藥物毒性越小。四、實驗所需材料1MTT 溶液的配制 通常MTT 配成的終濃度為5mg/ml,須用PBS或生理鹽水做溶劑。市面上一般MTT的包裝為100mg,250mg或1g1.1對于100mg這樣的小包裝，廠家都是將MTT放入小管中的，個人建議不要再用天平稱量分裝，而應(yīng)該一次性將其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS來溶解。 具休做法：預(yù)先在50ml離心管沒有的話，可用培養(yǎng)瓶替代參加20ml PBS，從中先吸取500-

15、1000ul PBS裝入含MTT的小管中，吹打假設(shè)干次后將其移入50ml離心管，然后再混勻?？梢灾貜?fù)幾次，以使小管中的MTT不殘留于管內(nèi)。將MTT完全混勻后，用0.22m濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，分裝避光(避光袋或是黑紙、錫箔紙包住)可長期保存于-20度。按細(xì)胞培養(yǎng)板每孔需加10ul計算，一般每96孔板約需1ml，所以分裝時可考慮每管分裝1ml。1.2對于大包裝，可按上述方法稱取一局部溶解，也有人將粉劑分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加?？记绊氈簂在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。l配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感l(wèi)MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4度避光保存兩周

16、內(nèi)個人曾做過4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不錯有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，防止反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用。lMTT有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套. 2MTT甲瓚溶解液2.1二甲基亞砜DMSO，可以直接溶解，無需配制，使用方便，溶解速度快，但對人體毒性較大，且需去除原培養(yǎng)液，在去除培養(yǎng)液的過程中，可能會把結(jié)晶去掉，導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定。2.2三聯(lián)溶解液：SDS10g，異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用雙蒸水溶解配成100ml溶液文獻(xiàn)方法：周建軍等，評價抗癌物質(zhì)活性

17、的改進(jìn)MTT方法，中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1993，2410：455-457，該溶解液不需去除原培養(yǎng)基，但溶解較慢。個人覺得其溶解的能力不如DMSO強該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫，將SDS結(jié)晶全部溶解后再使用。五、MTT法實驗步驟1: 胰酶消化對數(shù)期細(xì)胞，終止后離心收集，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)調(diào)整其濃度至5-10×104/ml。 細(xì)胞詳細(xì)計數(shù)方法請參照易生物實驗技術(shù)中的相關(guān)文章。對于初學(xué)者而言，要使細(xì)胞到達(dá)5-10×104/ml往往不知從何處著手，我在這里向大家提供一個簡單的方法以初步確定細(xì)胞數(shù)量。以一般細(xì)胞培養(yǎng)常用的25c

18、m2為例，1)細(xì)胞密度在長到約80%90%下列圖所示為80%90%密度時細(xì)胞的大致狀態(tài)，消化離心收集后，將上清去掉，參加3ml培養(yǎng)基使其混勻。2)另取一支新的15ml無菌離心管為下一步接種96孔板用，裝入約9ml培養(yǎng)基.3)從第一步準(zhǔn)備的3ml細(xì)胞懸液中取1ml, 參加上管，混勻后細(xì)胞計數(shù)，此時一般為或小于5-10×104/ml，該濃度相當(dāng)于細(xì)胞計數(shù)板4個大格內(nèi)每大格平均5-10個細(xì)胞見下列圖；如果不夠該濃度，再根據(jù)計數(shù)的結(jié)果滴加細(xì)胞懸液，每滴按50ul計算。)細(xì)胞數(shù)量因?qū)嶒災(zāi)康牟煌瑧?yīng)做相應(yīng)調(diào)整，如一般細(xì)胞增殖實驗每孔2000個就可以相當(dāng)于細(xì)胞懸液密度為2×104/ml，細(xì)

19、胞毒性實驗每孔500010000個相當(dāng)于細(xì)胞懸液密度為5×104/ml。此外，還應(yīng)根據(jù)細(xì)胞本身特性，如生長快慢，來決定細(xì)胞數(shù)量。比方：生長較快的細(xì)胞密度可略小。2將細(xì)胞懸液制備好后，輕輕混勻，每孔參加100ul, 這樣待測細(xì)胞的密度為500010000/孔邊緣孔用無菌PBS填充。l注意：因細(xì)胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，因此接種的過程中要反復(fù)屢次混勻，如每加6個孔就混勻一次，以確保接種的細(xì)胞密度在各孔之間完全相同，這對于MTT的結(jié)果至關(guān)重要。3.將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞單層鋪滿孔底96孔平底板,參加濃度梯度的藥物,原那么上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我

20、們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個復(fù)孔.建議設(shè)6個，否那么難以反響真實情況。下列圖可做為96孔板的的參考步局。l對于加藥，有人直接將藥物按不同體積參加到96孔板中，以形成濃度梯度。但本人認(rèn)為應(yīng)盡量在EP管中將不同濃度的藥物配好，然后將96孔板中的培養(yǎng)上清去掉可以用排槍吸走再參加100ul含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，這樣能保證藥物濃度的準(zhǔn)確。另外，需注意的是，如果用這種方法，不要把96孔板的培養(yǎng)液全部吸走后再加藥，應(yīng)該吸完一局部后立即加樣，防止由于96孔板枯燥引起細(xì)胞死亡。4.5%CO2，37孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。下列圖為一

21、典型的藥物梯度為細(xì)胞的毒性作用。5.每孔參加10ulMTT溶液5mg/ml，即0.5%MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h。假設(shè)藥物與MTT能夠反響，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再參加含MTT的培養(yǎng)液。 6. 終止培養(yǎng)，準(zhǔn)備溶解結(jié)晶。l 溶解結(jié)晶的方法有兩種，第一種，用DMSO溶解1) MTT參加培養(yǎng)4h后，結(jié)晶可充分形成。將上清去掉，該過程要注意不能把Formazan結(jié)晶移走。有人直接用移液器將上清移走，也有人建議先鋪幾張濾紙在桌面，然后將96孔板輕輕倒置，這樣上清便被濾紙吸走，以減少結(jié)果的損失。個人認(rèn)為，這兩種方法都有可能導(dǎo)致結(jié)晶的損失，從而引起結(jié)果的不準(zhǔn)確。采用哪種方法，可以自己摸索

22、一下再決定。2) 每孔參加150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。l 另一種方法，用三聯(lián)溶解液見上面MTT甲瓚溶解液1) MTT參加培養(yǎng)4h后，結(jié)晶可充分形成。這種方法細(xì)胞上清可以不用去掉，直接在每孔參加100ul溶解液。該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫，將SDS結(jié)晶全部溶解后再使用。2) 放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育46小時，鏡下觀察，待結(jié)晶全部溶解后570nm測吸光度。通常37孵育4小時左右，紫色結(jié)晶會全部溶解。如果紫色結(jié)晶較小較少，溶解的時間會短一些。如果紫色結(jié)晶較大

23、較多，溶解的時間會長一些。在實際的操作過程中，往往為了等待46小時，使得實驗者在下班以后或者晚上來測OD值，給實驗者帶來了很大的不方便。個人曾經(jīng)摸索，參加溶解液后過夜再測對OD值根本無影響，但要注意的是一定要避光，不過培養(yǎng)箱關(guān)閉后本身就是閉光的，所以參加溶解液后放入培養(yǎng)箱中，第二天上班時再測OD值就可以了。7、同時設(shè)置調(diào)零孔培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜，對照孔細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜。六、MTT結(jié)果分析關(guān)于如何計算IC50 1、改進(jìn)寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大劑量I:lg(最大劑量/相臨劑量)P:陽性反響率之和Pm:

24、最大陽性反響率Pn:最小陽性反響率舉個例子：各藥物濃度作用于某腫瘤細(xì)胞后所得MTT值如下藥物濃度ug/ml100502512.56.253.1250OD均值0.0800.0930.2360.3740.4410.5310.614公式中的最大最小陽性反響率就是最大最小抑制率抑制率=1-加藥組OD值/對照組OD值，如對于100ug/ml的藥物，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869，各組抑制率如下：藥物濃度ug/ml100502512.56.253.125抑制率0.8690.8490.6160.3910.2820.135代入計算公式：Pm=0.869Pn=0.135P=0.869+0.84

25、9+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142Xm=lg100=2lgI=lg100/50=0.301lgIC50=2-0.301*(3.142-(3-0.869-0.135)/4)=1.655 IC50=45.186該藥物的IC50值為45.186ug/ml    -/ MTT所有問題大匯總-實驗前應(yīng)明確的問題1. 選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長滿時約有105個細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗前，要進(jìn)行預(yù)實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接

26、種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否那么細(xì)胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。2. 藥物濃度的設(shè)定。一定要多看文獻(xiàn)，參考別人的結(jié)果再定個比擬大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時間范圍再細(xì)篩。切記！否那么，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。3. 時間點的設(shè)定。在不同時間點的測定OD值，輸入excel表，最后得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了到了平臺期那個時間點應(yīng)該就是最好的時間點因為這個時候的細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)的最明顯。4. 培養(yǎng)時間。200ul的培養(yǎng)液對于10的45次

27、方的增殖期細(xì)胞來說，很難維持68h，如果營養(yǎng)不夠的話，細(xì)胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在48h換液的。5. MTT法只能測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細(xì)胞絕對數(shù)。做MTT時，盡量無菌操作，因為細(xì)菌也可以導(dǎo)致MTT比色OD值的升高。6. 理論未必都是對的。要根據(jù)自己的實際情況調(diào)整。7. 實驗時應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對照孔，加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組參加不同濃度的藥物。8. 防止血清干擾。用含15%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時，高的血清物質(zhì)會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗

28、本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)剩余培養(yǎng)液。實驗步驟貼壁細(xì)胞：1. 收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔參加100ul，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔，邊緣孔用無菌PBS填充。2. 5%CO2，37孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底96孔平底板，參加濃度梯度的藥物，原那么上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度，每孔100ul，設(shè)3-5個復(fù)孔.建議設(shè)5個，否那么難以反響真實情況3. 5%CO2，37孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。4. 每孔參加20ulMTT溶液5mg/ml，即0.5%MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h。假設(shè)藥物與MTT能夠反響，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再參加含MTT的培養(yǎng)液。5. 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。6. 每孔參加1