PCR檢測常見問題與解決途徑

1、PCR檢測常見問題與解決途徑利用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因成分時，經(jīng)常出現(xiàn)假陽性、假陰性、非特異性擴(kuò)增和涂抹帶。尤其是假陽性和假陰性可使檢測結(jié)果得出錯誤結(jié)論，有時可造成嚴(yán)重后果。為了提高轉(zhuǎn)基因檢測的準(zhǔn)確性和可靠性，PCR檢測應(yīng)盡量減少假陽性、假陰性、非特異性擴(kuò)增和涂抹帶現(xiàn)象的發(fā)生。一個好的PCR方法不但要求特異性好、靈敏度高、還要求具有高的可重復(fù)性、重現(xiàn)性、魯棒性，盡量減少假陽性、假陰性和非特異性擴(kuò)增。本文對PCR檢測中出現(xiàn)的假陽性、假陰性、非特異性擴(kuò)增和涂抹帶的原因及其解決方法予以綜述。一、假陽性： 一假陽性現(xiàn)象假陽性是指檢測陰性材料得到陽性結(jié)果。如果一次實驗中的幾個陰性對照中出現(xiàn)一個或幾個陽性結(jié)

2、果，提示本次實驗中其它標(biāo)本的檢測結(jié)果可能有假陽性。實驗中設(shè)立的陰性對照可提示有無假陽性結(jié)果出現(xiàn)。二造成假陽性的原因1. 樣品間交叉污染：樣本污染主要有收集樣本的容器被污染，或樣本放置時，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有樣本而造成相互間交叉污染；樣本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；2. PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。3. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染：這是PCR反響中最主要最常見的污染問題。因為PCR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就

3、可形成假陽性。 4. 氣溶膠污染：在空氣與液體面摩 擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時比擬劇烈地?fù)u動反響管，開蓋時、吸樣時及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。5. 實驗室中克隆質(zhì)粒的污染：由于克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長繁殖的簡便性及具有很強(qiáng)的生命力，其污染可能性也很大。在分子生物學(xué)實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室，這個問題比擬常見。三假陽性問題的試驗控制在每次PCR檢測時，一定設(shè)立陰性對照樣品和陽性對照樣品。陰性對照樣品

4、檢測為陰性時，說明試驗全部過程的試劑沒有受到污染；陽性對照樣品檢測為陽性時，說明DNA提取RNA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄、DNA擴(kuò)增和電泳鑒定工作體系正常。在陰性對照樣品和陽性對照樣品檢測結(jié)果成立的前提下，才能對檢測樣品進(jìn)行判定。只有設(shè)立試驗全程的對照，才能證明試驗結(jié)果成立。造成假陰性的原因可以通過設(shè)置試驗對照來查找。試驗對照包括：1、DNA陽性對照：以含有目的片段的DNA(或質(zhì)粒作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，證明PCR試劑是否有效、擴(kuò)增過程是否正確及待測樣品中是否含有目的片段。注意：陽性樣品擴(kuò)增效率高，應(yīng)嚴(yán)格控制，防止其成為潛在的污染源。2、DNA陰性對照：以不含有目的片段的陰性樣品作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用于證明

5、擴(kuò)增過程中無假陽性現(xiàn)象。3、空白對照：以純水作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用于證明擴(kuò)增過程中無假陽性現(xiàn)象。4、PCR抑制物對照：在與陽性對照相同的反響體系中，參加相同數(shù)量的待測樣品DNA，如果未擴(kuò)增出目的片段，證明此待測樣品DNA中存在PCR抑制物。5、空白提取對照：空白提取對照擴(kuò)增結(jié)果為陽性，說明DNA提取試劑可能受到污染。6、陽性提取對照：陽性提取對照擴(kuò)增結(jié)果為陰性，說明提取過程可能有誤。如果DNA陽性對照擴(kuò)增結(jié)果為陰性，或者DNA陰性對照和空白對照擴(kuò)增結(jié)果為陽性，那么說明PCR試劑或擴(kuò)增過程存在問題。四假陽性解決途徑由于 PCR 的敏感性和效率特別高，所以少量的擴(kuò)增產(chǎn)物污染標(biāo)本或反響管即可出現(xiàn)假陽性

6、。尤其是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒分子很容易造成實驗室的污染，導(dǎo)致假陽性現(xiàn)象發(fā)生。1、標(biāo)準(zhǔn)實驗室設(shè)計實驗室設(shè)置上分配液區(qū)、DNA提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)。物流應(yīng)按分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)順序，嚴(yán)禁倒流。在連續(xù)而獨立的空間中完成不同實驗步驟。不同工作區(qū)域相互隔離，通過傳遞倉傳遞。PCR前處理區(qū)樣品制備室、DNA提取室和PCR準(zhǔn)備室設(shè)置正壓通風(fēng)系統(tǒng)，并設(shè)置通風(fēng)柜或生物反響柜造成局部負(fù)壓；后PCR室PCR室及電泳室為高度污染區(qū)設(shè)置負(fù)壓通風(fēng)系統(tǒng)，防止大量游離分子及氣溶膠，對其它區(qū)域造成環(huán)境污染。配制PCR反響體系配備冰箱及生物平安柜，此實驗室要求無模板DNA存在和向PCR反響體系中參加模板DNA配

7、備生物平安柜及冰箱要求在不同區(qū)域進(jìn)行。2、標(biāo)準(zhǔn)試劑耗材管理1驗證：新購置的試劑需進(jìn)行實驗前驗證；2分裝：雙蒸水、引物和dNTP均應(yīng)分裝儲存，并標(biāo)明日期，以防污染；試劑的分裝應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺上進(jìn)行；試劑分裝成小份一次使用后棄去。3消毒：除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。必要時，在加樣本前，反響管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。3、標(biāo)準(zhǔn)實驗室操作1控制污染源：PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒操作空間是最大的污染源，應(yīng)嚴(yán)格防止將這個空間的物品帶出；2一次性用具：使用實驗服和一次性手套，使用帶有濾膜的移液器槍頭，一次性反響管和離心管；3定期消毒：定期對實驗室進(jìn)行紫外照射，用10%漂

8、白劑、3雙氧水或?qū)Ｓ蒙虡I(yè)產(chǎn)品清理實驗室臺面及死角。4定期通風(fēng)：對實驗室定期進(jìn)行正壓、負(fù)壓通風(fēng)處理；5小心操作：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外；加樣時，最后加陽性對照。4、技術(shù)處理1在 DNA 模板和多聚酶參加前，紫外線照射反響管內(nèi)容物以破壞污染的 PCR 產(chǎn)物。一般選用波長 254nm 照射 30min Nature ， 1990 ， 34:27 ；2PCR 實驗中使用 dUTP ，而不用 dTTP 。在擴(kuò)增前使用 UraciI N 一 g1ycosylase 尿嘧啶糖基化酶處理可降解交叉污染的 PCR 產(chǎn)物，而不降解基困組 DNA 模板，然后熱滅活此酶，再進(jìn)行擴(kuò)增反

9、響 Gene，1990，93：125。美國 PE 公司提供此類試劑盒；3在 PCR 反響前參加一種光化學(xué)試劑，反響完成后激活該試劑，光化學(xué)試劑可交聯(lián) DNA 鏈，使之不能再擴(kuò)增 Nucleic Acids Res，1991，19 ：99。二、假陰性 一假陰性現(xiàn)象與判斷方法如果實驗中設(shè)置的陽性對照未能擴(kuò)增成陽性結(jié)果，提示本次實驗中可能有假陰性結(jié)果。但這里應(yīng)注意，許多國產(chǎn)PCR試劑盒中陽性對照采用質(zhì)粒DNA，和標(biāo)本相比來說，不需純化提取核酸的步驟，因此，如果在標(biāo)本核酸純化提取步驟有問題，即使陽性對照均呈陽性，標(biāo)本檢測中還可能有假陰性。設(shè)置內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因?qū)φ帐桥袛嗉訇幮暂^好的指示系統(tǒng)。在每一反響管中同時

10、對內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因?qū)φ者M(jìn)行擴(kuò)增，假設(shè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因?qū)φ瘴茨軘U(kuò)增出來，說明該反響管的結(jié)果可能有問題。二造成假陰性的原因 1 儀器因素PCR實驗對儀器的依賴性是很高的，離心機(jī)、擴(kuò)增儀都是造成PCR假陰性的因素。擴(kuò)增儀的主要問題是孔間差，引起擴(kuò)增失敗或擴(kuò)增效率降低。而離心機(jī)的影響那么更容易被無視。國內(nèi)使用離心機(jī)很少使用離心加速度XXXg作為參數(shù)指標(biāo)，而常使用轉(zhuǎn)數(shù)作為參數(shù)指標(biāo)，這里就存在著一個問題，由于離心機(jī)的大小不同，有效跳心半徑也不相同，因此同樣的轉(zhuǎn)速所產(chǎn)生的離心力相差很大(有的在數(shù)倍以上)，所以在相同的離心時間下，有可能模板并沒有離心下來，造成 PCR假陰性。這個問題在其他實驗也有，但因其他實驗都是測定大

11、分子蛋白沉淀，對離心的速度要求較低所以不太明顯。建議使用小型臺式離心機(jī)的實驗要注意一下這個問題。2 試劑質(zhì)量問題PCR實驗的成功與否試劑的質(zhì)量至關(guān)重要，試劑的質(zhì)量問題涉及多個方面：細(xì)胞的裂解；模板的抽提；引物位點的選擇；Taq酶的活性等等。其中任一環(huán)節(jié)出了問題都會引起結(jié)果的假陰性。這些都是試劑質(zhì)量的問題，因此選用高質(zhì)量的PCR試劑非常重要。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時忘加 Taq 酶或溴乙錠。     引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是 PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散

12、的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對策為： 選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看OD 值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做 PCR 有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。 引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止屢次凍融或長期放冰箱冷藏局部，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。    3 核酸模板問題1模板中含有雜蛋白質(zhì)；2模板中含有 Taq 酶抑制劑；3模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈

13、，特別是染色體中的組蛋白；4在提取制備模板時喪失過多，或吸入酚；5模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。     4、物理原因：PCR儀控溫不準(zhǔn)，也是 PCR 失敗的原因之一。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計，檢測一下擴(kuò)增儀內(nèi)的變性、退火和延伸溫度。 5、靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其 PCR 擴(kuò)增是不會成功的。6 操作人員素質(zhì)問題PCR實驗的環(huán)節(jié)很多，而且對每一環(huán)

14、節(jié)的質(zhì)量要求都很高，例如少加、漏加試劑、離心不充分、循環(huán)參數(shù)設(shè)計錯誤等等都能造成結(jié)果的假陰性。三假陰性問題的試驗控制在每次PCR檢測時，一定設(shè)立陰性對照樣品和陽性對照樣品。陰性對照樣品檢測為陰性時，說明試驗全部過程的試劑沒有受到污染；陽性對照樣品檢測為陽性時，說明DNA提取RNA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄、DNA擴(kuò)增和電泳鑒定工作體系正常。在陰性對照樣品和陽性對照樣品檢測結(jié)果成立的前提下，才能對檢測樣品進(jìn)行判定。造成假陰性的原因可以通過設(shè)置試驗對照來查找。試驗對照包括：1、DNA陽性對照：以含有目的片段的DNA(或質(zhì)粒作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，證明PCR試劑是否有效、擴(kuò)增過程是否正確及待測樣品中是否含有目的片

15、段。注意：陽性樣品擴(kuò)增效率高，應(yīng)嚴(yán)格控制，防止其成為潛在的污染源。2、DNA陰性對照：以不含有目的片段的陰性樣品作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用于證明擴(kuò)增過程中無假陽性現(xiàn)象。3、空白對照：以純水作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用于證明擴(kuò)增過程中無假陽性現(xiàn)象。4、PCR抑制物對照：在與陽性對照相同的反響體系中，參加相同數(shù)量的待測樣品DNA，如果未擴(kuò)增出目的片段，證明此待測樣品DNA中存在PCR抑制物。5、空白提取對照：空白提取對照擴(kuò)增結(jié)果為陽性，說明DNA提取試劑可能受到污染。6、陽性提取對照：陽性提取對照擴(kuò)增結(jié)果為陰性，說明提取過程可能有誤。如果DNA陽性對照擴(kuò)增結(jié)果為陰性，或者DNA陰性對照和空白對照擴(kuò)增結(jié)果為陽性，

16、那么說明PCR試劑或擴(kuò)增過程存在問題。四假陰性解決方案1反響體系不靈敏：1檢查PCR試劑是否失效；2檢驗引物是否降解：3優(yōu)化PCR擴(kuò)增體系與程序。2、PCR反響存在抑制物：1稀釋模板DNA，進(jìn)行擴(kuò)增分析；2純化模板DNA，除去蛋白質(zhì)、多酚、多糖等抑制物；3檢測PCR體系中是否含有擴(kuò)增抑制物。3、DNA提取失?。?選擇與優(yōu)化樣品DNA提取方法；2驗證DNA提取試劑是否失效。 三非特異擴(kuò)增一現(xiàn)象PCR 擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，(二原因：1. 引物設(shè)計與濃度問題引物設(shè)計：引物堿基的G+C含量以40-60%為

17、宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，防止5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。防止引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，防止兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否那么會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以防止因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物濃度：每條引物的濃度0.11umol或10100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的時機(jī)。 2. Mg2+離子濃度過高：在一般

18、的PCR反響中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反響特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反響產(chǎn)物減少。3. 退火溫度過低：變性后溫度快速冷卻至4060，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合時機(jī)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇適宜的溫度： Tm

19、值(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T) 復(fù)性溫度=Tm值-(510) 在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合， 提高PCR反響的特異性。復(fù)性時間一般為3060sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。 4. PCR循環(huán)次數(shù)過多： 當(dāng)其它參數(shù)確定之后，循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA 濃度。一般而言25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多，會使PCR 產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。通常經(jīng)25-30 輪循環(huán)擴(kuò)增后，反響中Taq DNA 聚合酶已經(jīng)缺乏， 如果此時產(chǎn)物量仍不夠，需要進(jìn)一步擴(kuò)增，可將擴(kuò)增的DNA 樣品稀釋103-105倍作為模板，重新參加各種

20、反響底物進(jìn)行擴(kuò)增，這樣經(jīng)60 輪循環(huán)后，擴(kuò)增水平可達(dá)109-1010。擴(kuò)增產(chǎn)物的量還與擴(kuò)增效率有關(guān)，擴(kuò)增產(chǎn)物的量可用以下公式表示:CCo(1+P)n 。其中：C 為擴(kuò)增產(chǎn)物量,C0 為起始DNA 量, P 為增效率, n 為循環(huán)次數(shù)。在擴(kuò)增后期，由于產(chǎn)物積累，使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反響變成平坦的曲線，產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升，這稱為平臺效應(yīng)。平臺期會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，到達(dá)較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結(jié)束反響，減少非特異性產(chǎn)物。5. 酶的質(zhì)和量，催化一典型的PCR反響約需酶量2.5U(指總反響體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃

21、度過低那么合成產(chǎn)物量減少。 往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶那么不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。 四PCR擴(kuò)增出現(xiàn)涂抹帶1、原因：往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。2、對策：1 減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶；2減少dNTP的濃度；3適當(dāng)降低Mg2+濃度；4增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。  五、標(biāo)準(zhǔn)問題轉(zhuǎn)基因成分檢測一般按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，引物和PCR反響體系一般都經(jīng)過了嚴(yán)格的循環(huán)驗證。有時標(biāo)準(zhǔn)方法可能存在問題，導(dǎo)致假陽性、假陰性、非特異性擴(kuò)增和涂抹帶的產(chǎn)生。標(biāo)準(zhǔn)方法可能存在的問題有：

22、1.引物設(shè)計不適宜：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增時，擴(kuò)增出的 PCR 產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。2. Mg2+ 濃度不合理： Mg2+ 離子濃度對 PCR 擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低 PCR 擴(kuò)增的特異性，濃度過低那么影響 PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使 PCR 擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。 3. 反響體積的改變：通常進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增采用的體積為 20ul 、 30ul 、 50ul ?；?100ul ，應(yīng)用多大體積進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，是根據(jù)檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如 20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否那么容易失

23、敗。4.PCR溫度設(shè)置不合理：變性對 PCR 擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低 PCR 擴(kuò)增效率。 六、檢測極限問題當(dāng)樣品中轉(zhuǎn)基因成分很低時，反響體系內(nèi)可能不含有擴(kuò)增模版，因而容易造成假陰性結(jié)果。PCR理論檢測極限是在反響體系中存在一個拷貝的目標(biāo)DNA分子，由于人的判讀能力限制和PCR效率等原因，定性檢測實際極限值一般是理論檢測極限值的10-30倍。也就是說，如果轉(zhuǎn)基因成分低到檢測極限時，檢測不到轉(zhuǎn)基因成分的可能性會很大，或者說出現(xiàn)假陰性的概率很大。出現(xiàn)假陰性的原因

24、是由于抽樣誤差，反響體系中不存在有效擴(kuò)增的模版分子。此時是不適合做PCR檢測的。根據(jù)作物基因組的大小，可以計算出不同作物的理論檢測極限并估計出實際檢測極限。例如在100微升的反響體系中，小麥基因組有0.58萬個拷貝，一個轉(zhuǎn)基因拷貝的重量比理論檢測極限是0.0174%，玉米的理論檢測極限是0.003，其他作物的理論檢測極限一般在0.001%-0.01%。如果反響體系是20微升，理論檢測極限值將提高5倍，小麥為0.085%，玉米為0.015%， 其他作物將在0.005-0.05%之間。反響體系是20微升的定性檢測實際極限值一般是在0.05-0.5%。低于這個含量時，反響體系中有時不含擴(kuò)增模版DNA

25、，因此很難得到正確的檢測結(jié)果。 七 怎樣查找污染源如果不慎發(fā)生污染情況，應(yīng)從下面幾條出發(fā)，逐一分析，排除污染。一設(shè)立陰陽性對照：有利于監(jiān)測反響體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時，應(yīng)選擇擴(kuò)增弱，且重復(fù)性好的樣品，因強(qiáng)陽性對照可產(chǎn)生大量不必要的擴(kuò)增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質(zhì)粒為對照，100 個拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽性擴(kuò)增。陰性對照的選擇亦要慎重，因為PCR 敏感性極高，可以從其它方法Sourthern 印跡或點雜交等檢測陰性的標(biāo)本中檢測出極微量的靶分子。此外，每次擴(kuò)增均應(yīng)包括PCR 體系中各試劑的時機(jī)對照，即包括PCR 反響所需的全部成分，而不加模板D

26、NA，這對監(jiān)測試劑中PCR 產(chǎn)物殘留污染是非常有益的。如果擴(kuò)增結(jié)果中試劑對照為陽性結(jié)果，就是某一種或數(shù)種試劑被污染了。此時，要全部更換一批新的試劑進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增時設(shè)立不同的反響管，每一管含有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應(yīng)馬上處理。二環(huán)境污染：在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，假設(shè)不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污染了，如果預(yù)防措施比擬嚴(yán)密，那么考慮可能為環(huán)境污染。環(huán)境污染中常見的污染源主要有：1. 模板提取時真空抽干裝置；2. 凝膠電泳加樣器；3. 電泳裝置；4. 紫外分析儀；5. 切膠用刀或手術(shù)刀片；6. 離心機(jī)；7. 冰箱門把手，冷凍架，門把手或?qū)嶒炁_面等；此時可用擦拭實驗來查找可疑污染源：1用

27、無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源；20.1ml 去離子水浸泡；3取5ml 做PCR 實驗；4電泳檢測結(jié)果。8. 氣溶膠。如果經(jīng)過上述追蹤實驗，仍不能查找到確切污染源，那么污染可能是由空氣中PCR 產(chǎn)物的氣溶膠造成的，此時就應(yīng)該更換實驗場所，假設(shè)條件不允許，那么重新設(shè)計新的引物與原引物無相關(guān)性。 八污染處理一環(huán)境污染1. 稀酸處理法：對可疑器具用1mol/L 鹽酸擦拭或浸泡，使剩余DNA 脫嘌呤；2. 紫外照射UV法：紫外波長nm一般選擇254/300nm，照射30min 即可。需要注意的是，選擇UV 作為消除殘留PCR 產(chǎn)物污染時，要考慮PCR 產(chǎn)物的長度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，

28、UV 照射僅對500bp 以上長片段有效，對短片段效果不大。UV 照射時，PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA 鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且UV 照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV 波長，嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點相鄰核苷酸的序列。在受照射的長DNA 鏈上，形成二聚體缺陷的數(shù)量少于0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷如環(huán)丁烷型嘧啶復(fù)合體，胸腺嘧啶乙二醇，DNA 鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和DNA 斷裂等均可終止Taq DNA 聚合酶的延伸。這些位點的數(shù)量與二聚體位點相當(dāng)。如果這些位點 0.13/堿基在DNA 分子上隨機(jī)分布，一個500bp片段的

29、DNA 分子鏈上將有32 處損傷位點，那么，105個這樣的分子中每個分子中會至少有一處損傷。相反，如果100bp 的片段，每條鏈上僅有6 處損傷，105個拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這就是UV 照射有一定的片段長度限制的原因。 二反響液污染可采用以下方法之一處理：1. DNase I 法：PCR 混合液未加模板和Taq 聚合酶參加0.5U DNase I，室溫反響30min 后加熱滅活，然后參加模板和Taq 聚合酶進(jìn)行正常PCR 擴(kuò)增。該方法的優(yōu)點是不需要知道污染DNA 的序列；2. 內(nèi)切酶法：選擇識別4 個堿基的內(nèi)切酶如Msp I 和Taq I 等，可同時選擇幾種，以克服用

30、一種酶只能識別特定序列的缺陷，室溫作用1h 后加熱滅活進(jìn)行PCR；3. 紫外照射法：未加模板和Taq 聚合酶的PCR 混合液進(jìn)行紫外照射，考前須知與方法同上述UV 照射法；4. g 射線輻射法：1.5kGy 的輻射可完全破壞0.1ng 基因組DNA，2.0 kGy 可破壞104 拷貝的質(zhì)粒分子，4.0 kGy 仍不影響PCR，但高于此限度會使PCR 擴(kuò)增效率下降。引物可受照射而不影響PCR，g 射線是通過水的離子化產(chǎn)生自由基來破壞DNA 的。 三尿嘧啶糖苷酶UNG法由于UV 照射的去污染作用對500bp 以下的片段效果不好，而臨床用于檢測的PCR 擴(kuò)增片段通常為300bp 左右，因此UNG 的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。1. 原理：在PCR 產(chǎn)物或引物中用dU 代替dT。這種dU 化的PCR 產(chǎn)物與UNG 一起孵育，因UDG 可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸，從而失去被再擴(kuò)增的能力。UNG 對不含dU 的模板無任何影響。UNG 可從單或雙鏈DNA 中消除尿嘧啶，而對RNA 中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子那么無任何作用。. dUTP 法：用dUTP 代替dT