PDA培養(yǎng)基的配制方法

1、PDA培養(yǎng)基的配制方法一、目的要求1 .學(xué)習(xí)并掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。2. 學(xué)習(xí)并掌握棉塞的制作方法。二、培養(yǎng)基的配制原理培養(yǎng)基是人工配制的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供微生物生長(zhǎng)繁殖的基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。在自然界中，微生物種類繁多，營(yíng)養(yǎng)類型多樣，加上實(shí)訓(xùn)和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多，但不論是何種培養(yǎng)基，均應(yīng)含有水分、碳源、氮源、能源、無(wú)機(jī)鹽等。不同微生物對(duì)pH值要求不一樣，所以配制培養(yǎng)基時(shí)，還應(yīng)根據(jù)不同微生物對(duì)pH值的要求，將培養(yǎng)基調(diào)到合適的pH值范圍。三、實(shí)訓(xùn)材料和用具瓊脂，可溶性淀粉，葡萄糖，10%NaOH,10%HCl,1mol/LNaOH,Im

2、ol/LHCl,KNO3,NaCl,K2HPO4-3H20,MgSO47H20,FeSO47H2O;試管，三角瓶，燒杯，量筒，玻璃棒，天平，牛角匙，PH試紙，棉花，牛皮紙，記號(hào)筆，紗布，四、操作方法與步驟（一）培養(yǎng)基的配制PDA培養(yǎng)基的配制其配方如下：土豆200g,葡萄糖20g,瓊脂1520g,水1000mL,pH值自然。（1）稱量和熬煮藥品實(shí)際用量計(jì)算后，按培養(yǎng)基配方逐一稱取去皮土豆。土豆切成小塊放入鍋中，加水1000ml，在加熱器上加熱至沸騰，維持2030min，用可用2層紗布趁熱在量杯上過(guò)濾，濾渣棄取。濾液補(bǔ)充水分到1000ml。（2）加熱溶解把濾液放入鍋中，加入葡萄糖20g，瓊脂152

3、0g（提前搞碎），然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，待瓊脂完全溶解后，再補(bǔ)充水分至所需量。（3）分裝按實(shí)訓(xùn)要求，將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或500ml三角瓶?jī)?nèi)。分裝時(shí)可用三角漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上造成污染。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的1/5,滅菌后制成斜面，分裝入三角瓶?jī)?nèi)以不超過(guò)其容積的一半為宜；半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。加棉塞培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞或試管帽等），以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)造成污染，并保證有良好的通氣性能。（5）包扎加塞后，將全部試管用麻繩或橡皮筋捆好，再在棉塞外包一

4、層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤(rùn)濕棉塞，其外再用一道線繩或橡皮筋扎好，用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。（二）棉塞的制作棉塞的作用有二：一是防止雜菌污染；二是可過(guò)濾空氣，保證通氣良好，并可減緩培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)，所以正確地制備棉塞是培養(yǎng)基制備中重要的一環(huán)。正確的棉塞是形狀、大小，松緊應(yīng)與試管口（或三角燒瓶）完全適合。過(guò)緊則妨礙空氣流通，操作不便；過(guò)松時(shí)，空氣會(huì)毫無(wú)障礙地進(jìn)入試管（或三角燒瓶）中，達(dá)不到滅菌的目的。棉塞過(guò)小往往易掉進(jìn)試管內(nèi)，因此棉塞質(zhì)量的優(yōu)劣對(duì)實(shí)訓(xùn)的結(jié)果有很大的影響。正確的棉塞頭較大，加塞時(shí)，應(yīng)使棉塞長(zhǎng)度的1/3留在試管口外，2/3在試管口內(nèi)（見(jiàn)實(shí)訓(xùn)圖6-4）。目前，有條件的實(shí)

5、訓(xùn)室已使用堅(jiān)固的塑料試管帽、金屬試管帽、硅膠泡沫塞替代棉塞，制作棉塞要選纖維較長(zhǎng)的棉花，一般不選用脫脂棉。因?yàn)樗菀孜儩?，造成污染，而且價(jià)格也貴。棉塞制作方法見(jiàn)圖6-5實(shí)圖6-4棉塞實(shí)圖6-5棉塞的制作方法（三）斜面與平板培養(yǎng)基的制作斜面與平面培養(yǎng)基是常用的瓊脂固體培養(yǎng)基。將熬制好的瓊脂培養(yǎng)基趁熱裝入試管滅菌后擺鞋面，凝固后即成斜面培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基常用于菌種培養(yǎng)、菌種保藏等工作。將滅菌后的瓊脂培養(yǎng)基傾注于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，凝固后即成平板培養(yǎng)基。平板培養(yǎng)基常用于分離菌種、菌落計(jì)數(shù)、菌落形態(tài)觀察及菌種鑒定等。斜面與平板培養(yǎng)基的制作過(guò)程大致為：溶解原料、融化瓊脂、調(diào)PK分裝、滅菌和制斜面或平板。1

6、、溶解原料為加速原料的溶解，最好用熱水。先將原料依次加入到占配制量一半的水中，待全部溶解后在加足水量。如配方中有馬鈴薯、熬皮、胡羅卜、豆芽等天然原料，需將其熬制約30min,取出定量濾液，在將所需的其他原料加入濾液中。、融化瓊脂瓊脂的用量可靈活掌握。用作保藏菌種的培養(yǎng)基，瓊脂用量可提高至2.5%,以增加持水性。冬季的氣溫低，瓊脂用量可適當(dāng)減少。瓊脂用前可剪成小段，以利于融化。待溶液煮沸是再加入，不斷攪拌至完全無(wú)瓊脂塊狀物時(shí)再停止加熱。2 、調(diào)整PH用潔凈干燥的玻璃棒沾一點(diǎn)培養(yǎng)基滴在試紙上，立即與比色板比較。一般用10%NaOKHCl調(diào)節(jié)1/47或9支扎一、分裝將培養(yǎng)基趁熱倒入墊有紗布的漏斗中，

7、使培養(yǎng)基直接濾至試管或三角瓶中，試管裝量一般為管高的左右，三角瓶的裝量約為其容量的一半。勿使培養(yǎng)基玷污容器口部。口部塞有棉塞，試管每捆，棉塞外面包牛皮紙，以防在滅菌過(guò)程中被水汽打濕。104kPa壓力下，滅菌1/2為宜，凝固后即成5、滅菌分裝后的培養(yǎng)基應(yīng)隨即滅菌。除特殊情況外，一般培養(yǎng)基均用高壓蒸汽滅菌，在20-30min6、制作斜面或平板將滅菌后的試管趁熱斜置于棍條上，傾斜度以試管中的培養(yǎng)基約占試管長(zhǎng)度的斜面培養(yǎng)基。待滅菌后三角瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基冷卻至4550時(shí)，以無(wú)菌操作法向無(wú)菌培養(yǎng)皿中倒入培養(yǎng)基，裝置以剛覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿底部為宜（約15ml），凝固后即成平板培養(yǎng)基。五、高壓蒸汽滅菌法該法使用高壓滅

8、菌鍋，在121C,O.105MPa壓力下滅菌1530min。微生物實(shí)訓(xùn)所需的一切器皿、器具、培養(yǎng)基（不耐高溫者除外）、無(wú)菌水、工作服等物品都可用此法滅菌。高壓蒸汽滅菌鍋是能耐一定壓力的密閉金屬鍋，有立式或臥式（實(shí)圖8-1、2）兩種。滅菌鍋上附有壓力表、排氣閥、安全閥、加水口、排水口等。臥式滅菌鍋還附有溫度計(jì)。有的還有蒸汽人口。滅菌鍋的加熱源有電、煤氣和蒸汽三種。高壓蒸汽滅菌的操作過(guò)程加水將滅菌鍋內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，以水面與三角架相平為宜。立式鍋是直接加水至鍋內(nèi)底部隔板以下1/3處。有加水口者由加水口加入至止水線處。(1) 裝料將裝料桶放回鍋內(nèi)，裝入待滅菌的物品。放置裝有培

9、養(yǎng)基的容器時(shí)要防止液體溢出，瓶塞不要緊貼桶壁，以防冷凝水沾濕棉塞。(2) 加蓋擺正鍋蓋，對(duì)齊螺口，然后以同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓的方式擰緊所有螺栓，打開(kāi)排氣閥。排氣用電爐或煤氣加熱，待水煮沸后，水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出。一般認(rèn)為，當(dāng)排氣流很強(qiáng)并有噓聲時(shí)，表明鍋內(nèi)空氣已排凈(沸后約5min)o(3) 升壓當(dāng)鍋內(nèi)空氣排凈時(shí)，即可關(guān)閉排氣閥，壓力開(kāi)始上升。實(shí)圖7-1立式滅菌鍋實(shí)圖7-2臥式滅菌鍋1.安全閥2.壓力表3.放氣閥7. 軟管5.緊固螺栓6.滅菌桶篩架8.水(4) 保壓當(dāng)壓力表指針達(dá)到所需壓力刻度時(shí)，控制熱源，開(kāi)始計(jì)時(shí)并維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)訓(xùn)用121C、20rnin滅菌。(5) 降壓達(dá)

10、到所需滅菌時(shí)間后，關(guān)閉熱源，讓壓力自然下降到零后，打開(kāi)排氣閥。放凈余下的蒸汽后，再打開(kāi)鍋蓋，取出滅菌物品，排掉鍋內(nèi)剩余水。無(wú)菌檢查將已火菌培養(yǎng)基冷卻后置于37C怛溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h,若無(wú)菌生長(zhǎng)，則放人冰箱或陰涼處保存?zhèn)溆谩?.化學(xué)藥品滅菌化學(xué)藥品消毒滅菌法是用能抑制或殺死微生物的化學(xué)制劑進(jìn)行消毒滅菌的方法。能破壞細(xì)菌代謝機(jī)能并有致死作用的化學(xué)藥劑為殺菌劑，如重金屬離子等；僅阻抑細(xì)菌代謝機(jī)能，使細(xì)菌不能增殖的化學(xué)藥劑為抑菌劑，如磺胺類及大多抗生素等。化學(xué)藥品對(duì)微生物的作用是抑菌還是殺菌以及作用效果，還與化學(xué)藥品濃度的高低、處理微生物的時(shí)間長(zhǎng)短、微生物的種類及微生物所處的環(huán)境等有關(guān)。微生物實(shí)訓(xùn)室中常用的化學(xué)藥品有2%煤酚皂溶液(來(lái)蘇爾)、O.25%新潔爾滅、0.1%升汞、3%5%的甲醛溶液和75%乙醇溶液等。4. 注意事項(xiàng)(1) 使用高壓滅菌鍋應(yīng)嚴(yán)格按照操作程序進(jìn)行，避免發(fā)生事故；滅菌時(shí)，操作者切勿擅自離開(kāi)；務(wù)必待壓力降到零后，才可打開(kāi)鍋蓋。(2) 干熱滅菌時(shí)電烘箱中物品不要擺得太擁擠，以免阻礙空氣流通而影響滅菌效果；滅菌物品不要與電烘箱內(nèi)壁的鐵板接觸，以防包裝紙烤焦。(3) 記述高壓蒸汽滅菌的操作