實(shí)驗(yàn)四-逆轉(zhuǎn)錄PCR-(RT-PCR)

1、實(shí)驗(yàn)四 逆轉(zhuǎn)錄 PCR (RT-PCR)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?了解用逆轉(zhuǎn)錄PCF法獲取目的基因的原理。2 學(xué)習(xí)和掌握逆轉(zhuǎn)錄PCR的技術(shù)和方法。【實(shí)驗(yàn)原理】聚合酶鏈?zhǔn)椒错慞CR過程利用模板變性，引物退火和引物延伸的多個(gè)循環(huán)來擴(kuò)增DNA序列。因?yàn)樯弦惠喌臄U(kuò)增產(chǎn)物又作為下一輪擴(kuò)增的模板， 是一個(gè)指數(shù)增長的過程， 使其成為檢測(cè)核酸和克隆基因 的一種非常靈敏的技術(shù)。一般經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使模板DNA擴(kuò)增達(dá)106倍。RT-PCF將以RNA為模 板的 cDNAcomplement DNA合成即 RNA的反轉(zhuǎn)錄RT, reversetranscription，同 cDNA的 PCR 結(jié)合在一起的技術(shù)，提供了一種基

2、因表達(dá)檢測(cè)、定量和cDNA克隆的快速靈敏的方法。由于 cDNA包括了編碼蛋白的完整序列而且不含內(nèi)含子， 只要略經(jīng)改造便可直接用于基因工程表達(dá)和功能研究， 因 此RT-PCR成為目前獲得目的基因的一種重要手段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平、表達(dá)差異，細(xì)胞中 RNA病 毒的含量和直接克隆特定基因的 cDNA序列。RT-PCF比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原 位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。RT-PCF的根本原理圖。首先是在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下從 RNA合成cDNA,即總RNA中的mRNA 在體外被反向轉(zhuǎn)錄合成DNA

3、拷貝，因拷貝DNA的核苷酸序列完全互補(bǔ)于模板 mRNA,稱之為互補(bǔ)DNA cDNA然后再利用DNA聚合酶，以cDNA第一鏈為模板，以四種脫氧核苷三磷酸dNTF為材料， 在引物的引導(dǎo)下復(fù)制出大量的cDNA或目的片段。在RT時(shí)，有3種引物可選擇表4.1)。用1和2方法，理論上是擴(kuò)增的所有的 cDNA,還要用此產(chǎn)物做PCR的模板繼續(xù)擴(kuò)增。如果用3方法，先要去：查它的序列，并用oligo等軟件設(shè)計(jì)引物。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。兩步法 RT-PCR:匕較常見，在使用一個(gè)樣品檢測(cè)或克 隆多個(gè)基因的mRNA時(shí)比擬有用。在兩步法RT-PCR,每一步都在最正確條件下進(jìn)行。cDNA的合成 首先在

4、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反響產(chǎn)物進(jìn)行PCR而一步法RT-PC具有其它優(yōu)點(diǎn)表, cDNA合成和擴(kuò)增反響在同一管中進(jìn)行，不需要翻開管蓋和轉(zhuǎn)移，有助于減少污染。還可以得到更高 的靈敏度，最低可以到達(dá)總 RNA因?yàn)檎麄€(gè)cDNA樣品都被擴(kuò)增。對(duì)于成功的一步法 RT-PCR 一般使 用基因特異性引物(GSP起始cDNA的合成。由圖不難看出，隨機(jī)引物法是三種方法中特異性最低的。引物在整個(gè)轉(zhuǎn)錄本的多個(gè)位點(diǎn)退火， 產(chǎn)生短的，局部長度的cDNA。這種方法經(jīng)常用于獲取5'末端序列及從帶有二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域或帶有逆轉(zhuǎn) 錄酶不能復(fù)制的終止位點(diǎn)的 RNA模板獲得cDNA。為了獲得最長的cDNA,需要按經(jīng)驗(yàn)

5、確定每個(gè) RNA 樣品中引物與RNA的比例。隨機(jī)引物的起始濃度范圍為 50到250ng每20卩l(xiāng)反響體系。因?yàn)槭褂秒S 機(jī)引物從總RNA合成的cDNA主要是核糖體RNA所以模板一般選用poly(A)+RNAOligo(dT)起始比隨機(jī)引物特異性高。它同大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA 3端所發(fā)現(xiàn)的poly(A)尾雜交。 因?yàn)閜oly(A)+RNA大概占總RNA的1%到2%,所以與使用隨機(jī)引物相比，cDNA的數(shù)量和復(fù)雜度要少 得多。因?yàn)槠漭^高的特異性，oligo(dT)一般不需要對(duì)RNA和引物的比例及poly(A)+選擇進(jìn)行優(yōu)化。建 議每20卩l(xiāng)反響體系使用卩g oligo(dT> oligo(dT)

6、12-18適用于多數(shù)RT-PCR基因特異性引物GSP對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄步驟是特異性最好的引物。GSP是反義寡聚核苷，可以特異性地同RNA目的序列雜交，而不象隨機(jī)引物或 oligo(dT)那樣同所有RNA退火。用于設(shè)計(jì)PCR引物 的規(guī)那么同樣適用于逆轉(zhuǎn)錄反響 GSP的設(shè)計(jì)。GSP可以同與mRNA 3最末端退火的擴(kuò)增引物序列相同， 或GSP可以設(shè)計(jì)為與反向擴(kuò)增引物的下游退火。已經(jīng)制備好的雙鏈cDNA和一般DNA一樣，可以插入到質(zhì)?；蚴删w中，為此，首先必需有適 當(dāng)?shù)慕宇^Linker,接頭可以是在PCR引物上增加限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)片段，經(jīng) PCRT增后再克隆 入相應(yīng)的載體；也可以利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體和雙鏈

7、 cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA 尾巴,退火后形成重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到宿主菌中進(jìn)行擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)是要從小鼠肝臟組織中獲取 Fas配體基因，F(xiàn)as配體FasL是一分子量約為40u的II型跨 膜糖蛋白，屬TNF家族成員?；罨腡細(xì)胞可表達(dá)Fas和FasL并通過Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡作 用，保持機(jī)體免疫系統(tǒng)的自穩(wěn)態(tài)。近年研究發(fā)現(xiàn)在局部癌細(xì)胞中FasL表達(dá)增強(qiáng)，并與腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。我們采用RT-PCR方法克隆FasL全長cDNA并構(gòu)建其表達(dá)載體，可以為進(jìn)一步研究 FasL的功 能提供條件。在上下游引物的5'端分別加上了限制酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基即 Hind III和B

8、amH， 以便可以通過雙酶切將目的片段定向的克隆到原核表達(dá)載體pGFPUv上附錄圖。為了便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以用金屬螯和層析的方法別離和純化目的蛋白，我們改造了 pGFPUv在其上加了 6X His標(biāo)簽。表4.1RT-PCR|物選擇的履那么隨機(jī)可物(Random Pmers)適用于長的或具有發(fā)卡結(jié)枸的適用于rKNA>niRNA>tRNA 等所有RNA的威隸反響。主姜用干單一模板的EPCR反氛Oligo dT(Oligo- dT AdaptorPrimer)適用于具有Polfca屋巴的RNA姑于紗亦套結(jié)合至I Polka屋 巴上所次對(duì)RNA樣品的質(zhì)量耍求較託即使有少量降解也會(huì) 使全長fDX

9、H合成量大大減少-基因特異性引物(Gene SpeciHc Primer 5 GSP)與模板席列互補(bǔ)的引糊適用于目的序列的情況o表12一步法和兩步法RT-PCR的比較兩步法一步法性始第 HScDNAjSttffl；起始第一®合威棲用：O昭咚刁：隨機(jī)六聚體0P引韌GSP刖物優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)試活擴(kuò)增酶同誣轉(zhuǎn)錄酶預(yù)先泯合擴(kuò)壇酶的選怪轉(zhuǎn)管步驟少，-械少污渠可能性困難RT-PCR的優(yōu)化能力蔦靈SS度可通過選用不同特性的DNA聚合酶和改變反響條件 提高擴(kuò)壇的特異性忠實(shí)性適用于大量祥品分折適用于在里個(gè)樣品中檢測(cè)或克隆務(wù)伍因的mJ還二適用于定重PCR一試劑1. 總 RNA或 mRNA酶抑制蛋白R(shí)Nase I

10、nhibitor: 40 U/mL3. dNTP混合物(各10 mM)4.oligo(dT)12-18: 2.5 mol/L5.10*逆轉(zhuǎn)錄合成緩沖液10 RT buffer：250 mmol/L Tris-HCI (pH8.3)375 mmol/L KCl 15 mmol/L MgCI2 逆轉(zhuǎn)錄酶5u/ L7. 基因特異性5和3引物各20 mol/L8. Tap DNA聚合酶 5u/ L9.10*PCR緩沖液：500mmol/L KC, 100mmol/L Tris?C,在 25°C下，1.0% Triton X-100 15mmol/L MgCI2。二器材1PCR儀，2PCR管,

11、3微量移液器【操作方法】一逆轉(zhuǎn)錄：1建立RT反響體系:總RNA或?qū)ΨNA0.5-1 rigdNT?混合物2 LoligoiT124S1J1L10>RT緩;梆如AMV逆諾錄酶IpLRNase Inhibitor0.5DEPC水如至20 pLTotal volume20 pL2渦旋混勻，42C反響1小時(shí)，95C加熱5分鐘，然后置于冰上。二PCR擴(kuò)增：1建立PCR反響體系:上步逆轉(zhuǎn)錄反響得到的10L基因特異性亍和歹引物各ILdNIP混合初1110叩CR緩;械5TiqDNAM 合醸0.5 1LDEPC水力咗50iiLTotal volumeSOuL2將上述反響體系渦旋混勻，按以下程序運(yùn)行循環(huán):

12、step變性5 minstep2變性1 minstcp3性曲secstcp472延伸step5芒遼溫肓lOminstepC保存H過夜step2-4運(yùn)行30個(gè)循環(huán)，其中復(fù)性溫度主要依據(jù)引物的不同而不同。三取10-20uL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，余下的 PCR產(chǎn)物-20C保存?！究记绊氈c提示】1. 逆轉(zhuǎn)錄反響過程，需建立無 RNAase環(huán)境，以防止RNA的降解。2. 成功的逆轉(zhuǎn)錄反響決定于高質(zhì)量的模板 RNA高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如EDTA或 SDS此外，RT-PCR所遇到的一個(gè)潛在的困難是 RNA中沾染的基因組DNA。使用較 好的RNA別離方法，如T

13、rizol Reage nt會(huì)減少RNA制備物中沾染的基因組 DNA。因此在進(jìn)行PCR反 應(yīng)時(shí)應(yīng)該對(duì)每個(gè)RNA模板進(jìn)行一個(gè)無逆轉(zhuǎn)錄的對(duì)照反響，以確定擴(kuò)增出來的片段是來自基因組DNA還是cDNAo在無逆轉(zhuǎn)錄時(shí)所得到的PCR產(chǎn)物來源于基因組。的起始模板可是總RNA或mRNA都可以檢測(cè)到擴(kuò)增結(jié)果如以下列圖。另外，別離mRNA會(huì)導(dǎo)致樣 品間mRNA豐度的波動(dòng)變化，從而使信息的檢出和定量產(chǎn)生偏差。然而，當(dāng)分析稀有基因時(shí)，使用 mRNA會(huì)增加檢測(cè)的靈敏度。4 / 64. 在逆轉(zhuǎn)錄反響中經(jīng)常參加RNA酶抑制蛋白以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。RNA酶抑制蛋白要在第一鏈合成反響中，在緩沖液和復(fù)原劑如 DTT存

14、在的條件下參加，因?yàn)閏DNA合成前的過程會(huì)使抑 制劑變性，從而釋放結(jié)合的可以降解 RNA的RNase RNA酶抑制蛋白僅防止RNase A，B，C對(duì)RNA 的降解，并不能防止皮膚上的 RNase因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心試驗(yàn)者的手上Rnase對(duì)樣品的污染。5. 較高的保溫溫度有助于 RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的翻開，增加了反響的產(chǎn)量。對(duì)于多數(shù)RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65C保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數(shù)二級(jí)結(jié)構(gòu)， 從而使引物可以結(jié)合。然而某些模板仍然會(huì)存在二級(jí)結(jié)構(gòu)， 即使熱變性后也是如此。對(duì)這些困難模板 的擴(kuò)增可以使用經(jīng)過改良的耐高溫逆轉(zhuǎn)錄酶，女如: Inv

15、itrogen公司的ThermoScript逆轉(zhuǎn)錄酶，使逆轉(zhuǎn)錄反響置于較高溫度下進(jìn)行以改善擴(kuò)增。而且適當(dāng)提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度，可增加RT-PCR勺特異性。6. 建立反響體系時(shí)，加完其它反響物后，才加模板DNA和Taq DNA聚合酶；然后將全部反響物渦旋混 勻；上PCR儀前加礦物油封蓋或設(shè)熱蓋。反響的循環(huán)數(shù)一般25-30次就足夠了，過多的循環(huán)數(shù)會(huì)造成非特異性擴(kuò)增和時(shí)間的浪費(fèi)。復(fù)性溫度的 計(jì)算，一般是在引物的Tm值上下浮動(dòng)，Tm =2 : A+T+4 G+C。適當(dāng)提高復(fù)性溫度可提高 PCRT增 的特異性。8.不管是反轉(zhuǎn)錄反響還是 PCF反響都應(yīng)先調(diào)制試劑的 Master Mix 包括RNase Fr

16、ee dH2O緩沖液、dNTP Mixture等，然后分裝到每個(gè)反響管中。這樣可使所取的試劑的體積更準(zhǔn)確，減少試劑的損失，防止 重復(fù)分取同一試劑，同時(shí)也可以減少實(shí)驗(yàn)操作造成的誤差。而且分裝試劑時(shí)務(wù)必用新Tip，以防止樣品間的污染。、RNase Inhibitor、Taq等酶類，要輕輕地混勻，防止起泡。分取之前要輕輕地離心收集到反響管底部， 因其粘度高，所以要慢慢地分取。 酶類務(wù)必在實(shí)驗(yàn)前從-20C取出，使用后立即放回-20C保存。10.最正確的PCR條件，因PCRT增儀的不同而不同，所以在使用您的樣品之前最好先做 Control反響， 以確定最正確的PCR條件。為延長PCR儀的使用壽命，應(yīng)盡可能縮短PCR儀4C保存的時(shí)間，盡量防 止4 °C過夜的情況。-1500bplOOObp800bp一 50flbp® 4.2 RT-PCK瓊脂稲瀧除電泳示意團(tuán)Lane 1:總RNA的RT-PCR產(chǎn)物人細(xì)胞調(diào)亡因子 TF15基因Lane 2: mRN